枣（Ziziphus jujube Mill.）是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物,广泛种植于我国吉林、辽宁、河北、山东、山西、陕西、河南、甘肃、新疆、安徽等地区,生长于海拔1 700 m 以下的山区、丘陵或平原。新疆是我国主要的枣产地,种植规模逐年增多。据统计,新疆枣种植面积有47.3 万hm2,新疆枣主要分布在哈密、喀什和和田等地区,其中和田地区作为传统的大枣主产区之一,种植面积较大[1]。在《中华人民共和国药典》中记载,大枣具有补中益气、养血安神之功效,用于脾虚食少、乏力便溏及妇人脏躁的治疗[2]。《本草纲目》记载：“干枣润心肺、止咳、补五脏、治虚损,除肠胃癖气”。大枣味甘无毒、主心邪气、安中养脾、平胃气、通九窍,助十二经。枣的果实味甜,鲜枣的碳水化合物含量高于大多数蔬菜和一些其他水果,除供鲜食外,常可以制成熏枣、酒枣等蜜饯和果脯,还可以做枣泥、枣面、枣酒、枣醋等。红枣具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎及免疫调节等功效[3],富含多糖、低聚糖、氨基酸、维生素、黄酮、萜类、多酚等活性成分[4]。红枣多糖表现出了较强的抗氧化、调节免疫、改善肠道菌群及抗肿瘤等多种活性[5]。
多糖具有良好的生物活性和结构特征,且毒性较低,大部分多糖都具有良好的抗氧化、免疫调节、降血糖、抗肿瘤及调节肠道菌群等生理作用[6]。多糖是一种由多种单糖通过糖苷键连接而成的糖类化合物,具有较大的分子量和复杂的结构。结构是生物活性的基础,多糖结构的复杂性能够使其更好地传递生物信息。因此,研究多糖的构效关系,寻找其活性片段受到研究者们的广泛关注。由于多糖分子量较大、水溶性较差,很难较好地融入到细胞,影响其生物活性的发挥,导致在相关研究领域具有局限性。研究表明通过结构修饰可改变多糖原有的结构,改善其功效,甚至挖掘一些新的生物活性。因此,需要对多糖进行相应的修饰改性,以便挖掘更多的潜在功能。
目前,常用于动植物多糖修饰改性的手段包括引入一些功能性基团、降解多糖链及多糖金属螯合物等。分子量作为多糖生物活性发挥过程中重要的指标,过高的分子量会导致多糖活性的降低。因此,通过降解法可有效控制多糖的分子量,从而制备高活性的多糖片段。广泛应用于动植物多糖降解的方法包括化学法（酸解法、双氧水降解法等）[8]、物理法（超声波降解法、高压降解法、微波降解法等）、生物酶降解法[9]以及多种方法联合降解法等[7]。物理法具有简便、绿色和安全等特点；化学法具有高效、条件温和等优点。曹慧馨等[10]用三氟乙酸对黑木耳多糖进行降解,得出降解后的多糖分子量减小,抗氧化活性增强。郭蓉等[11]对比研究超声波降解法、双氧水降解法、超声-双氧水降解法3 种方法对黑水皮香覃多糖的影响,结果显示降解可以显著影响多糖分子量,对单糖种类的影响较小,且超声-双氧水降解后的多糖的抗氧化活性更强。谭诗敏等[12]用H2O2-VC 降解水莲花多糖得到3 种不同的产物,降解后的多糖表观黏度降低,固体弹性增高,且抗氧化活性明显高于原多糖。目前,资源较为丰富的红枣多糖相关研究仅限于其提取及活性筛选,有关进一步开发利用及构效关系研究尚处于初始阶段。
本文以和田大枣为研究对象,通过水提醇沉法制备其多糖,并采取H2O2-VC 对多糖进行降解,分别利用紫外-可见分光光度（ultraviolet-visible spectroscopy,UV）法、傅立叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR）法、气相色谱（gas chromatography,GC）法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法、圆二色谱（circular dichroism,CD）法、扫描电子显微镜-X 射线能谱（scanning electron microscope-energy dispersive X-ray,SEM-EDX）法及刚果红染色法对降解前后的多糖进行结构表征,通过测定2,2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）阳离 子[2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）,ABTS+]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、羟自由基清除率及总还原能力评价抗氧化活性,对原多糖与其降解产物进行对比研究,以期为红枣资源的综合利用及红枣多糖构效关系的阐明提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红枣：产自新疆和田；氯化钠、甲醇、硫酸亚铁、氯化羟胺（盐酸羟胺）、石油醚、氢氧化钠、三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）、乙酸酐（均为色谱纯）：天津市鑫铂特化工有限公司；三氯甲烷（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；硫酸（分析纯）：四川西陇科学有限公司；无水乙醇、抗坏血酸（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；吡啶（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；菲啰嗪-钠盐、蒽酮、半乳糖醛酸、间羟基联苯（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：上海阿达玛斯试剂有限公司；H2O2（分析纯）：津百世化工有限公司；右旋糖酐Dextran 标准品（分子量5、12、25、50、80、150、270、410、670 kDa,色谱纯）：美国Sigma-Aldrich 公司；ABTS、DPPH（均为分析纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene,BHT）（分析纯）：上海阿达玛斯试剂有限公司；氯化钠（光谱纯）：上海阿拉丁生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
RE-2012 旋转蒸发仪、DF-101 S 集热式恒温加热磁力搅拌器：上海新创科学仪器设备有限公司；KQ 5200 E 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；AL 204 电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；DF-101 S冷冻干燥机：上海力辰邦西仪器科技有限公司；723 N可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；TD 4-WS 医用离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司；WJX-500 A 高速多功能粉碎机：永康市红太阳机电有限公司；MM-2 微量振荡器：常州翔天实验仪器厂；HWS-26水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司；GPIN-9080 恒温培养箱：上海新春兰科学仪器有限公司；GC-2014 气相色谱仪、IR Affinity1 红外光谱仪：日本岛津检测技术有限公司；Multiskan FC 酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；Chirascan qCD 圆二色光谱仪：英国应用光物理公司；Waters 1515 液相色谱仪：美国Waters 公司；SUPRA 55VP 型SEM 仪：德国Zeiss 公司；X-射线能谱仪：德国Bruker Nano GmbH 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 红枣多糖的提取
将红枣常温干燥后去核后粉碎,过100 目筛,按料液比1∶5 （g/mL）加入85% 乙醇,进行回流脱色,重复至颜色变淡。取一定量预处理好的红枣粉末（m0）,按照料液比1∶30 （g/mL）于90 ℃提取2 h。待提取液降温,4 000 r/min 离心10 min,取上清液,浓缩至原体积的1/3,相同条件再次离心一次,取上清液。将上清液透析48 h（3 500 Da）,按浓缩的体积比1∶4 加入无水乙醇,静置12 h 后离心（6 000 r/min,5 min）,取出沉淀,烘干（称质量记为m1）,即可得到红枣多糖（jujube polysaccharide,JP）,按下式（1）计算得率（Y,%）。
式中：m1 为冻干后红枣多糖的干重,g；m0 为红枣干重,g。
1.3.2 红枣多糖的降解
参照谭诗敏等[12]的方法,利用H2O2-VC 对JP 进行降解,制备条件：0.1 mol/L 双氧水溶液和0.1 mol/L 抗坏血酸溶液各10 mL 加入5 mg/mL 的多糖溶液,60 ℃恒温回流降解30、60、90 min。待反应完毕,溶液pH 值调至中性,去离子水透析48 h（3 500 Da）,得到3 种降解红枣多糖,分别命名为JP-30、JP-60、JP-90。
1.3.3 结构表征
1.3.3.1 含量测定
中性糖含量：配制浓度为200 μg/mL 的葡萄糖标准品溶液,稀释至不同浓度,按体积比1∶4 加入0.2%蒽酮-硫酸试剂,冷却后于90 ℃反应10 min,取出,再次冷却至室温后放置10 min,测定吸光度（620 nm）,绘制葡萄糖标准曲线。同时将JP、JP-30、JP-60、JP-90 配制为浓度200 μg/mL 的溶液,按照葡萄糖标准曲线测定方法进行操作。所得标准曲线为Y=0.002 39X+0.097 3,R2=0.996。
糖醛酸含量：配制100 μg/mL 的半乳糖醛酸（GalA）标准溶液,稀释至不同浓度,取100 μL 不同浓度的GalA 标准溶液,加入四硼酸钠600 μL,摇匀,95 ℃加热反应12 min,冷却,再加入间羟基联苯溶液8 μL,摇匀后反应40 min,测定吸光度（525 nm）,绘制半乳糖醛酸标准曲线。同时将JP、JP-30、JP-60、JP-90配制为100 μg/mL 溶液,按照糖醛酸标准曲线测定方法进行操作。所得标曲为Y=4×10-5X2+0.001 4X+0.077 9,R2=0.995。
蛋白质含量：配制不同浓度的牛血清蛋白溶液各1 mL,分别加3 mL 考马斯亮蓝溶液,混匀,室温避光反应5 min,测定吸光度（595 nm）,绘制牛血清蛋白标准曲线。同时,将JP、JP-30、JP-60、JP-90 配制为1 mg/mL的溶液,按照上述标准曲线的方法进行测定[13]。所得标准曲线为Y=0.105X+0.718,R2=0.998 2。
1.3.3.2 单糖组成测定
参照刘梦培等[14]的方法测定红枣多糖的单糖组成。酸水解：JP 及其降解产物各称取5 mg,加入3～4 mL 的2 mol/L 的三氟乙酸,在110 ℃的烘箱中加热4～6 h,冷却至室温,转入圆底烧瓶,加入3～4 mL 甲醇进行旋干,3～4 次即可。衍生化：蒸干后的样品中依次加入8 mg 盐酸羟胺和0.5 mL 吡啶,混匀后,于90 ℃的水浴中反应30 min,冷却至室温,加入0.5 mL 乙酸酐,90 ℃的水浴中反应30 min,待反应结束,将溶液吹干,加入氯仿混匀,过0.22 μL 滤头,备用。气相色谱条件：进样口及检测器温度为280 ℃、程序升温条件：180 ℃保持5 min,以2 ℃/min 的速率加热到220 ℃,保留10 min,以5 ℃/min 的速率 加 热到280 ℃,保留10 min,进样量5 μL。
1.3.3.3 分子量的测定
参考文献[15]的方法测定红枣多糖的分子量,精密称取JP 及其降解产物各5 mg,溶解在0.05 mol/L NaCl溶液中,配制成浓度为5 mg/mL 的溶液,8 000 r/min 离心10 min,取上清液过0.22 μm 滤头,备用。色谱柱：OHpak 803-804-805 串联聚合物基质水溶性凝胶柱（8 mm×300 mm）；流动相：0.05 mol/L NaCl 溶液；流速：0.65 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：30 μL。得到校正曲线方程：lg Mw=-0.176 1T+11.029 9,lg Mn=-0.167 4T+10.536 1,R2=0.993 7。
1.3.3.4 紫外吸收光谱扫描
将JP 及其降解产物分别配制为浓度0.1 mg/mL的溶液,在200～400 nm 范围内进行全波长扫描。
1.3.3.5 红外吸收光谱扫描
将少量的JP 及其降解产物置于样品台,铺平,进行检测,得到透光率随波数变化的红外吸收光谱图。
1.3.3.6 扫描电子显微镜-X 射线能谱扫描
将少量的JP 及其降解产物置于试样台上,使用离子溅射仪对各样品进行喷铂金处理,采用扫描电子显微镜进行表面结构形貌的观察。采用EDX 检测样品表面元素含量。
1.3.3.7 刚果红试验测定
参考文献[16]的方法进行测定,将JP、JP-30、JP-60、JP-90 分别配制成浓度为2 mg/mL 的溶液,准确量取1 mL 各溶液6 份,加入1 mL 刚果红溶液及不同体积的1 mol/L 氢氧化钠溶液,蒸馏水定容到4 mL,使溶液中氢氧化钠的浓度分别为0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05、0 mol/L,室温反应5 min,以蒸馏水代替样品的混合溶液作为对照品,用紫外分光光度计进行400～700 nm 全波长扫描得到最大吸收波长（λmax）。
1.3.3.8 圆二色谱扫描
将各JP 及其降解产物配制成浓度为5 mg/mL 的溶液,离心（6 000 r/min,5 min）,取上清液,通过圆二色谱仪测定样品溶液在190～260 nm 范围内的吸收峰情况。
1.3.4 抗氧化活性测定
1.3.4.1 DPPH 自由基清除能力
将JP、JP-30、JP-60、JP-90 配制浓度为4 mg/mL 的样品溶液,稀释至不同浓度梯度,加100 μL 现配的DPPH-甲醇溶液,恒温室温避光反应30 min,测定吸光度（517 nm）,用蒸馏水代替样品作为空白组。BHT 作为阳性对照。DPPH 自由基清除率（Y,%）按公式（2）计算。
式中：Ai 为样品组吸光度；Aj 为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。
1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力
将JP、JP-30、JP-60、JP-90 配制浓度为4 mg/mL 的样品溶液,稀释至不同梯度。加180 μL 在734 nm 处吸光度在0.70±0.02 的ABTS 溶液与20 μL 样品溶液,混匀,室温反应5 min,测定吸光度（734 nm）。用蒸馏水代替样品作为空白组,按公式（2）计算清除率。
1.3.4.3 羟自由基清除能力
将JP、JP-30、JP-60、JP-90 配制浓度为4 mg/mL 的样品溶液,稀释至不同梯度,加入200 μL 现配的硫酸亚铁溶液,200 μL 水杨酸-乙醇溶液,混匀,再加入200 μL 过氧化氢（0.1%）溶液,放入37 ℃烘箱中反应30 min,于510 nm 处测定吸光度,用蒸馏水代替样品作为空白组。按公式（2）计算清除率。
1.3.4.4 总还原能力
将JP、JP-30、JP-60、JP-90 配制浓度为4 mg/mL 的样品溶液,稀释至不同梯度,加入100 μL 磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L,pH6.6）与100 μL 铁氰化钾溶液,混匀,于50 ℃恒温反应50 min、取出、冷却至室温；加入100 μL 的10% 的三氯乙酸水溶液,加入400 μL 蒸馏水和100 μL 三氯化铁水溶液,室温放置10 min,BHT作为阳性对照,于700 nm 处测定吸光度即可。
1.4 数据分析
通过Origin 2019 对数据进行绘图和处理。每次试验设置3 组平行试验,数据以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 红枣多糖组成分析
红枣多糖及其降解产物的含量及分子量结果见表1。
表1 红枣多糖及其降解产物的含量及分子量
Table 1 Content and molecular weight of Jujube polysaccharide and its degraded products
样品JP JP-30 JP-60 JP-90中性糖含量/%54.48 60.69 49.42 53.98糖醛酸含量/%64.83 60.95 66.09 66.74分子量Mw/kDa 81.46 13.50 12.62 11.92 Mn/kDa 52.41 9.50 8.92 8.44分散系数（Mw/Mn）1.55 1.42 1.42 1.41
按照1.3.1 方法进行红枣多糖的提取其得率为（6.57±0.33）%。由表1 可知,JP 及其降解产物的中性糖含量在54.58%～60.69%,糖醛酸含量60.95%～66.74%。与原多糖相比,JP-30 的中性糖含量增加,JP-60 和JP-90 中性糖含量减小；JP-30 的糖醛酸含量减少,JP-60 和JP-90 糖醛酸含量增加。结果表明在较短的降解时间影响下,中性糖含量上升,糖醛酸含量降低；随着降解时间的延长,中性糖含量下降,糖醛酸含量上升。此结果说明红枣多糖主链中可能含有较多的糖醛酸,降解过程中导致糖苷键的断裂；随着降解程度的增大,导致分支链或末端糖苷键断裂,从而含有更多的糖醛酸。红枣多糖的蛋白质含量为4.004%,蛋白质含量较少,对于后续降解及结构分析影响较小。杨燕敏等[17]报道哈密大枣多糖经超声辅助提取后,在其最优工艺条件下,多糖的提取率为（3.11±0.45）%,不同方法提取的差异性使得粗多糖得率不同；白冰瑶等[18]报道经碱液浸提法制备的新疆不同产地的红枣多糖产率为5.28%～6.81%,枣的品种与提取方式的不同使得到粗多糖的得率有所差距,糖、蛋白质及糖醛酸含量分别在56.58%～72.62%、2.88%～6.73%、6.03%～9.24%,其中和田骏枣多糖提取率为5.28%,糖、蛋白质及糖醛酸含量分别为56.58%、4.13%及6.59%,其糖含量及蛋白质含量跟本文结果基本一致,然而糖醛酸含量差距较大,可能是因为不同溶剂提取过程对样品的作用不一样,导致含量的差异。
红枣多糖及其降解产物的高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography,HPGPC）图见图1。
图1 红枣多糖及其降解产物的HPGPC 图
Fig.1 HPGPC spectrum of Jujube polysaccharide and its degraded products
由图1 可知,JP 及其降解产物均出现均匀的单一峰,说明各多糖样品纯度较高。随着降解时间的递增,样品的保留时间逐渐增长,分子量逐渐减小,尤其是当降解时间为30 min 时,分子量由原来的81.46 kDa 降低成13.50 kDa,随着降解时间的延长虽然分子量显出降低的趋势,然而其变化幅度较小,结果说明降解会导致多糖部分链的失去,使其分子量逐渐减小。
红枣多糖及其降解产物的单糖组成结果见表2。
表2 红枣多糖及其降解产物的单糖组成（物质的量比）
Table 2 Monosaccharide composition of Jujube polysaccharide and its degraded products（molar ratio）
样品JP JP-30 JP-60 JP-90 Rha 1.56 1.74 1.61 1.52 Ara 49.42 47.40 49.08 29.74 Xyl 6.50 6.94 7.24 10.91 Man 4.70 5.29 4.53 7.06 Glc 14.68 11.93 7.85 13.00 Gal 23.15 26.71 29.71 37.77
由表2 可知,JP 及其降解产物均由不同物质的量比的鼠李糖（rhamnose,Rha）、葡萄糖（glucose,Glc）、阿拉伯糖（arabinose,Ara）、甘露糖（mannose,Man）、木糖（xylose,Xyl）和半乳糖（galactose,Gal）组成。JP、JP-30、JP-60 的单糖组成中含量最多的是Ara,JP-90 的单糖组成中含量最多的是Gal,JP 及其降解产物的单糖组成中含量最少的均是Rha。虽然降解前后的红枣多糖中单糖种类不变,但各单糖物质的量比有明显差异。赵非等[19]研究发现,若羌红枣多糖中含有Man、Gal、Glc 及Rha,含量最多的是Glc,含量最低的是Man。冀晓龙等[20]研究发现红枣多糖由不同物质的量比的Gal、Rha、Ara、半乳糖醛酸构成,表明不同产地的红枣多糖的基本单糖组成大致相同。
2.2 紫外及红外吸收光谱结果
红枣多糖及其降解产物的UV 和FT-IR 图见图2。
图2 红枣多糖及其衍生物的UV 图谱和FT-IR 图谱
Fig.2 UV spectrum and FT-IR spectrum of Jujube polysaccharide and its degraded products
A. UV 图；B. FT-IR 图。
由图2A 可知,JP 及其3 种降解产物的UV 图谱呈现出较为平滑的曲线趋势,JP 及JP-60 在（260～280） nm 处有微弱的吸收峰,表明其中含较少的蛋白质。
由图2B 可知,JP 及其3 种降解产物均显出典型的多糖吸收峰,且具有相似的特征吸收峰,说明H2O2-VC 降解对红枣多糖的结构特性并不产生显著的影响。在3 334.92 cm-1 处是O—H 的伸缩振动峰。在1 737.86 cm-1 有明显的伸缩振动峰,为糖醛酸的峰,而多糖水合振动峰处在1 606.70 cm-1 附近[21],1 442.75 cm-1 处为C—H 弯曲振动,在820～825 cm-1 及900 cm-1 的振动峰说明JP 及其降解产物中既含有α-型糖苷键,又含有β-型糖苷键[22]。
2.3 扫描电子显微镜-X-射线能谱结果
红枣多糖及其降解产物在100 倍与300 倍放大倍数下的扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）图见图3。
图3 红枣多糖及其降解产物的扫描电子显微镜图
Fig.3 SEM image of Jujube polysaccharide and its degraded products
由图3 可知,JP 呈现出大颗粒块状结构,孔隙较小。JP-30、JP-60、JP-90 具有相似的形态特征,比原多糖的块状更加碎片化,表面也逐步光滑,随着降解程度加深,在不同倍数下可见蜂窝状多孔结构和细小的裂纹也逐步明显,可初步判断降解对多糖的高级结构影响较为显著。
红枣多糖及其降解产物的X 射线能谱（energy dispersive X-ray,EDX）图见图4。
图4 红枣多糖及其降解产物的EDX 图
Fig.4 EDX image of Jujube polysaccharide and its degraded products
由图4 可以观察到JP 及其降解产物中除了含有较多的C、O,同时含有较少的Na、Mg、P、K、Ca 等对人体有益的微量元素。
2.4 刚果红染色试验结果
刚果红染色试验可用于检测多糖结构是否有三螺旋结构,含有三螺旋结构的多糖在碱性环境下与刚果红形成红色络合物,其λmax 发生红移,且随着碱浓度的升高,三螺旋结构被破坏,λmax 逐渐降低。红枣多糖及其降解产物刚果红络合物最大吸收波长变化见图5。
图5 红枣多糖及其降解产物-刚果红络合物的最大吸收波长变化
Fig.5 Variation of the maximum absorption wavelength of the complex of Jujube polysaccharide and its degraded products with Congo red
由图5 可知,在NaOH 浓度从0.05 mol/L 上升到0.50 mol/L,与对照组相比,JP 及其降解产物与刚果红形成的络合物的λmax 均出现红移,且随着NaOH 浓度的增加,络合物的λmax 逐渐减小,表明均含有三螺旋结构。同时,与原多糖相比,降解后的多糖λmax 有所下降,各降解产物之间也有差异,说明降解处理可能影响多糖的高级结构。
2.5 圆二色谱结果
圆二色谱（CD）可用于检测具有光学活性基团的生物大分子的二级结构。多糖、蛋白等生物大分子介质对左右旋圆偏振光的折射率不同,从而对平面偏振光分解成了右旋和左旋圆偏振光吸收也不同,从而产生了圆二色性[23]。JP 及其3 种降解产物的CD 图见图6。
图6 红枣多糖及其降解产物的圆二色谱图
Fig.6 CD spectrum of Jujube polysaccharide and its degraded products
由图6 可知,JP 及其3 种降解产物没有负相峰,在200 nm 附近有正科顿效应[24],用H2O2-VC 降解后的红枣多糖正相峰的位置大致不变,但降解后的红枣多糖在200 nm 左右的峰吸收强度都明显高于JP 的峰,降解处理虽然对多糖正相峰的位置无显著变化,但对其吸收峰的强度有一定的影响,此差距可能由多糖分子内和分子间相互作用的影响导致的。因此,可推测降解对于红枣多糖的高级结构有一定的影响[25]。
2.6 抗氧化活性
JP 及其降解产物的抗氧化活性见图7。
图7 红枣多糖及其降解产物的抗氧化活性
Fig.7 Antioxidant activity of Jujube polysaccharides and its degraded products
A. DPPH 自由基清除率；B. ABTS+自由基清除率；C.羟自由基清除率；D.总还原能力。
由图7A 可知,JP 及JP-90 的DPPH 自由基清除能力随着样品质量浓度的升高逐渐上升,呈浓度依赖性关系；然而,JP-30 及JP-60 对DPPH 自由基的清除能力呈现无规则变化。JP、JP-30、JP-60、JP-90 样品的IC50 值分别为0.170 0、0.230 0、0.870 0、0.004 4 mg/mL,其中,JP-90 的DPPH 自由基清除能力明显高于原多糖及另两种降解产物。由图7B 可知,JP 及其降解产物均有较好的ABTS+自由基的清除能力,随着浓度的增大其清除能力也有显著增强,JP 及其降解产物的IC50值分别为0.130 0、0.180 0、0.200 0、0.060 0 mg/mL。其中,JP-90 的ABTS+自由基的清除能力显著强于原多糖及JP-30 和JP-60,此结果与DPPH 自由基清除能力一致。由图7C 和图7D 可知,与DPPH 自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力相比,JP 及其降解产物的羟自由基清除能力及总还原能力较弱,且经降解处理后活性并未明显增强,原多糖的羟自由基清除能力及总还原能力均强于降解产物,3 种降解产物的羟自由基清除能力及总还原能力无明显差异,结果表明多糖对于自由基的清除作用有一定的选择性。巩晓佩等[26]研究当浓度为0.5 mg/mL 时,由Glc、Ara 及Gal 组成的不具有三螺旋结构的石河子红枣多糖及其硫酸化产物对DPPH 自由基清除率分别为40.4% 和47.6%。杨燕敏等[17]研究经超声辅助提取制备的哈密大枣多糖浓度为1 mg/mL 时,DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除率分别为89.65% 和99%,总还原能力吸光度为0.764。段景峰等[27]研究产自阿拉尔地区的糖含量为47.89% 的冬枣多糖对DPPH 自由基的IC50 值为132.13 μg/mL,糖含量为42.39% 壶瓶枣多糖对ABTS+自由基的IC50 值为593.97 μg/mL,含量为53.87%的灰枣多糖对羟自由基的IC50 值为273.84 μg/mL。张越锋等[28]研究红枣（阿拉尔骏枣）多糖及红枣硒多糖对DPPH 及羟自由基的IC50 值分别为0.051、0.079 mg/mL及1.36、0.088 mg/mL。不同红枣品种枣多糖对同一种自由基的清除能力不同,同一品种红枣多糖对不同自由基的清除能力也不同。研究表明多糖的生物活性与其结构的关系较为紧密。分子量较低的多糖游离羟基比例高,可与自由基作用终止自由基链反应或提供电子将自由基还原为更稳定的形式,从而提高抗氧化活性[29]。同时,糖醛酸含量更高的酸性多糖也在抗氧化活性方面有明显的优势。因此,JP-90 高活性的原因也可能是跟其分子量或含量等相关。
3 结论
以和田大枣为研究对象,通过水提醇沉法制备红枣多糖,提取率为（6.57±0.33）%,利用化学降解法制备其3 种降解产物,对其结构和活性进行对比研究。结果表明降解显著影响多糖的一级及高级结构。JP、JP-30、JP-60、JP-90 的分子量分别为81.46、13.50、12.62、11.92 kDa,均由不同物质的量比的Rha、Glc、Ara、Man、Xyl、Gal 组成。红枣多糖主要成分由半乳糖和阿拉伯糖组成,其糖醛酸含量较高,初步判断其可能为果胶类多糖。刚果红染色结果表明红枣多糖及其降解产物含有三螺旋结构,且表面结构形貌差异较大。原多糖及其降解产物均显出较强的抗氧化活性,其中JP-90 对DPPH 自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力明显强于其余多糖,IC50值分别为0.004 4 及0.060 0 mg/mL。本研究将为红枣功效物质基础及红枣多糖构效关系的阐明提供依据。
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