辣椒属于茄科多年生草本植物,是世界范围内广泛食用的蔬菜,也常用作香料[1],其富含人体必需营养素,具有一定的营养价值,并含有益健康的成分[2]。辣椒在全球范围内种植广泛,中国、墨西哥、土耳其和印度尼西亚是主要的生产国,合计占全球产量的70%以上[3],我国贵州种植椒田面积高于33.4 万hm2[4],成为当地重要的支柱产业。然而,新鲜辣椒含水量高、采后易腐烂、保质期短,腌制是辣椒保藏的重要方式之一。发酵辣椒制品通常是将新鲜辣椒修剪或剁碎,加入适量食盐、白糖、白酒和香料等,在自然条件下借助辣椒表面的微生物,利用其中的糖类、氨基酸等营养物质代谢产生有机酸、醛类等特征性风味成分而制成的产品[5]。传统发酵辣椒制品不仅有利于辣椒的保藏,而且增添了独特的风味,同时具有制作工艺简单的优点,深受消费者青睐,但大多以家庭自制为主。
发酵辣椒制品风味品质形成的关键源于微生物的作用,探究影响发酵辣椒品质的主要微生物,分离微生物并进行接种,改善产品风味,提高产品品质稳定性是必要的[6]。近年来,随着分子生物学的发展,应用Illumina MiSeq 高通量测序技术分析发酵食品微生物多样性和探究微生物在发酵过程中的变化已趋于成熟,为研究食品微生物提供了一种非常有用的方法[7-8],目前已广泛应用于发酵食品微生物群落结构、相对丰度及其消长规律的研究中。韩俊燕等[9]应用高通量测序技术分析了自制剁辣椒、酸辣椒、腌辣椒和辣椒酱的细菌多样性,结果表明魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）是主要优势菌属,且4 种发酵辣椒制品的细菌多样性和丰度均存在较大差异。Peng 等[10]选取中国9 个地区的14 份不同发酵辣椒样品,并对其进行高通量测序分析,结果显示其中5 份样品优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）和片球菌属（Pediococcus）,而其他9 份样品优势菌属是假单胞菌属（Pseudomonas）和肠杆菌属（Enterobacter）,且不同地区不同样品之间的差异较大。然而,目前关于不同地区农家自制自然发酵辣椒制品细菌多样性、理化特性及其相互关系的研究仍需加强。
本研究收集不同地区的6 种自然发酵辣椒制品,比较其理化特性,并运用高通量测序技术分析其细菌群落结构和多样性,同时深度剖析核心细菌类群,挖掘功能性菌种资源,以期为传统发酵辣椒制品的工业化、标准化生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
云南辣椒酱：云南省昭通市昭阳区农家自制；湖南辣椒酱、鲊辣椒：湖南省常德市安乡县农家自制；江苏泡椒：江苏省徐州市睢宁县农家自制；江西泡椒：江西省赣州市定南县农家自制；贵州剁辣椒：贵州省遵义市习水县农家自制；氯化钠（食品级）：市售；氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；冰乙酸、无水乙醇（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；亚硝酸钠、硼酸钠（均为分析纯）：上海沪试实验室器材股份有限公司；亚铁氰化钾（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸锌、酚酞（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；铬酸钾（分析纯）、平板计数琼脂（plate count agar,PCA）：北京陆桥技术股份有限公司；E.Z.N.ATM DNA 提取试剂盒：美国Omega 公司；Qubit3.0 DNA 检测试剂盒：美国Life 公司；2×Hieff®聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）预混液、Hieff NGSTM DNA 分选磁珠：翌圣生物科技（上海）股份有限公司。
Pico-21 型台式离心机：美国Thermo Fisher 公司；DYY-6 C 型电泳仪电源、DYCZ-21 型电泳槽：北京市六一仪器厂；FR-1000 凝胶成像系统：上海复日科技有限公司；TND03-H-H 混匀型干式恒温器：深圳拓能达科技有限公司；GL-88B 型漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Q32866 型Qubit® 3.0 荧光计、ETC 811 型PCR 仪：北京东胜创新生物科技有限公司；Miseq 型测序仪：美国Illumina 公司；ZHTE-48 多样品组织研磨仪：南京卓恒科学仪器有限公司；FE28 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HPX-9082MBE 电热恒温培养箱：江苏省科学器材有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品预处理
固态样品（鲊辣椒1 种、泡椒2 种、剁辣椒1 种）用高温灭菌的剪刀剪碎后混合均匀,半固态样品（辣椒酱2 种）不做处理。称取0.5 g 样品放入2 mL 样品管中,于多样品组织研磨仪中破碎10 s,备用。
1.2.2 总酸度和pH 值测定
总酸度参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[11]中第一法,酸碱指示剂滴定法测定；pH 值采用pH 计进行测定。
1.2.3 NaCl 含量测定
NaCl 含量参考GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》[12]中第三法——银量法测定。
1.2.4 亚硝酸钠（NaNO2）含量测定
NaNO2 含量参考GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[13]中的方法,采用分光光度法-盐酸萘乙二胺法进行测定。
1.2.5 菌落总数测定
菌落总数参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]中的方法进行测定。
1.2.6 DNA 提取
参考庞春霞等[6]的方法进行DNA 提取。
1.2.7 PCR 扩增及高通量测序
参考庞春霞等[6]的方法进行PCR 扩增及高通量测序。为区分不同样本,引物上连接碱基的标签序列分别为云南辣椒酱（TTCCAT）、江苏泡椒（TCTAGG）、湖南辣椒酱（CTATAC）、湖南鲊辣椒（GTCCCA）、江西泡椒（ATCGCA）、贵州剁辣椒（TTACGA）。
利用blastn 将序列与对应数据库进行比对,筛选并过滤出序列最佳的比对结果,默认满足覆盖率>90%且相似度>90% 的序列被用来后续分类,不满足条件的序列则被归为未分类并在各个水平上统计群落结构,并讨论6 种发酵辣椒制品微生物群落特征。
1.3 数据处理
采用cutadapt1.18、NCBI Blast 2.10.0、Mothur 1.43.0、Mothur 1.43.0、Excel 2016、Origin 2021、SPSS 22.0 等软件进行数据处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1 样品理化指标分析
6 种传统发酵辣椒制品的理化指标结果见表1。
表1 6 种传统发酵辣椒制品的理化指标
Table 1 Physical and chemical indexes of six traditional fermented chili products
注：-表示未检出。
项目云南辣椒酱江苏泡椒湖南辣椒酱湖南鲊辣椒江西泡椒贵州剁辣椒总酸度/（g/kg）24.21±0.90 4.44±0.05 12.21±0.27 23.10±0.61 15.81±0.27 1.58±0.12 pH 值4.66±0.01 5.56±0.02 3.23±0.00 3.48±0.01 3.62±0.03 4.89±0.05 NaCl 含量/%7.88±0.08 4.75±0.06 4.34±0.04-2.80±0.02 7.74±0.11 NaNO2 含量/（mg/kg）0.85±0.05--1.03±0.10 0.31±0.06-菌落总数/[lg（CFU/g）]6.30±0.13 6.23±0.12 6.18±0.12 3.85±0.08 5.30±0.11 4.40±0.09
2.1.1 总酸度和pH 值
从表1 可知,6 种发酵辣椒样品总酸度和pH 值分别为1.58～24.21 g/kg 和3.23～5.56,其中云南辣椒酱和湖南鲊辣椒中总酸度大于20.00 g/kg,江苏泡椒和贵州剁辣椒总酸度小于5.00 g/kg,各样品间的总酸度和pH值差异较大,这可能与不同地区环境中微生物种类、加工工艺以及辣椒品种等因素有关。
2.1.2 氯化钠和亚硝酸钠含量
从表1 可知,6 种发酵辣椒样品中云南辣椒酱和贵州剁辣椒NaCl 含量相对较高,分别为7.88% 和7.74%,江苏泡椒和湖南辣椒酱NaCl 含量适中,分别为4.75%和4.34%,江西泡椒NaCl 含量较少,为2.80%,湖南鲊辣椒样品NaCl 未检出,这可能是造成发酵蔬菜样品理化指标、菌群结构及感官和风味差异的重要原因。
NaNO2 摄入过多可能会对人体造成损害,因此NaNO2含量是评价发酵食品安全性的重要指标。由表1可知,6 种样品NaNO2含量均较低,为0.31～1.03 mg/kg,且江苏泡椒、湖南辣椒酱和贵州剁辣椒未检出亚硝酸钠,符合GB 2762—2022《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[15]相关限量标准（<20 mg/kg）的要求。
2.1.3 菌落总数
从表1 可以看出,6 种发酵辣椒制品菌落总数为3.85～6.30 lg（CFU/g）,其菌落总数由多到少顺序为云南辣椒酱>江苏泡椒>湖南辣椒酱>江西泡椒>贵州剁辣椒>湖南鲊辣椒。
2.2 样品DNA 提取及PCR 扩增分析
以6 种发酵辣椒样品中提取的微生物基因组DNA为模板,应用PCR 扩增16S rDNA V3～V4 区序列,扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果见图1。从图1 可知,各样品DNA 条带清晰,浓度合适,没有异常的条带,符合预期结果,能够满足后续测序试验的要求。
图1 PCR 扩增产物电泳图
Fig.1 Electrophoretogram of polymerase chain reaction products
M.DNA 分子量标准；1.云南辣椒酱（0.524 ng/μL）；2.江苏泡椒（52.18 ng/μL）；3.湖南辣椒酱（0.232 ng/μL）；4.湖南鲊辣椒（0.104 ng/μL）；5.江西泡椒（0.286 ng/μL）；6.贵州剁辣椒（4.700 ng/μL）。
2.3 Illumina 高通量测序数据分析
采用Illumina 高通量测序方法对6 种发酵辣椒制品进行测序,结果见表2。
表2 不同地区发酵辣椒制品微生物有效序列数据统计
Table 2 Statistics of effective sequence data of microorganisms from fermented chili products from different regions
注：OTU 为操作单元分类（operational taxonomic unit）。
样品云南辣椒酱江苏泡椒湖南辣椒酱湖南鲊辣椒江西泡椒贵州剁辣椒区分样品碱基序列TTCCAT TCTAGG CTATAC GTCCCA ATCGCA TTACGA有效序列条数82 154 148 619 138 073 148 341 90 191 102 678碱基数/bp 34 791 221 60 609 814 59 061 855 63 278 225 38 614 256 41 771 946平均长度/bp 423.49 407.82 427.76 426.57 428.14 407.82最短序列长度/bp 350 350 351 351 350 350最长序列长度/bp 454 465 465 452 467 446 OTU 数量473 412 151 232 349 382
由表2 可知,经质控筛选和优化后共得到710 056 条有效序列,去除低质量序列、接头引物序列和标签序列后,样品有效序列条数都在80 000 以上,符合后续微生物多样性分析的要求。进而对样品序列进行聚类分析,在97% 相似水平下的操作单元分类（operational taxonomic unit,OTU）生物信息统计发现,6 种样品得到的OTU 数量范围为151～473,有效OTU 数量为1 999。
2.4 OTU 物种信息统计分析
6 种传统发酵辣椒制品OTU 物种信息见图2。
图2 6 种传统发酵辣椒制品OTU 物种信息
Fig.2 Species information of OUT in six different samples
A. OTU 数量；B. Alpha 多样性指数。
如图2A 所示,6 组样品的OTU 数量在样本数量小于50 000 时急剧上升,样本数量在50 000 以上时,云南辣椒酱、江西泡椒、贵州剁辣椒样品的曲线逐渐平稳；样本数量在100 000 以上时,江苏泡椒、湖南鲊辣椒、湖南辣椒酱样品的曲线逐渐平稳,说明测序数据合理。样本物种的丰富程度和均匀程度一般用丰度等级（Rank-abundance）曲线呈现[16]。如图2B 所示,湖南辣椒酱OTU 等级在0～200 之间,物种丰富度最少,其余5 种OTU 等级在200～300 之间。并且随着OTU 等级数增大,显示物种组成较为均匀。
韦恩图通过统计样本OTU 物种数量,根据特有和共有OTU 数量分析样品间细菌群落的重叠性和独有性[17],结果如图3 所示。
图3 不同样品的OTU 样本分布韦恩图
Fig.3 Venn diagram for the OTU distribution of different samples
由图3 可知,云南辣椒酱、江苏泡椒、湖南辣椒酱、湖南鲊辣椒、江西泡椒、贵州剁辣椒样品分别有87、57、48、71、53、52 个细菌OTU,共有35 个OTU,各自特有OTU 数量分别为52、22、13、36、18、17 个；云南辣椒酱与其他样品细菌菌群的差异性较大。
2.5 Alpha 多样性分析
根据97%相似性水平下的OTU 信息,采用Alpha多样性指标进行评估,分析样品微生物物种丰富度和多样性,结果见表3。
表3 不同发酵辣椒制品微生物测序的Alpha 多样性指数
Table 3 Alpha diversity index for sequencing of microorganisms from different traditional fermented chili products
注：序列数是去除嵌合体后的序列数目。
样品云南辣椒酱江苏泡椒湖南辣椒酱湖南鲊辣椒江西泡椒贵州剁辣椒序列数67 992.0 137 217.0 130 089.0 145 226.0 72 134.0 96 008.0 Shannon 指数3.22 1.13 1.32 2.00 1.69 1.00 Chao 指数481.18 427.45 172.72 237.06 361.22 405.91 Ace 指数496.05 447.01 180.66 237.08 378.71 431.83 Simpson 指数0.08 0.58 0.39 0.29 0.30 0.66 Shannoneven 指数0.52 0.19 0.26 0.37 0.29 0.17 Coverage 指数1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
从表3 可知,Coverage 指数均达到1.00,说明结果可以代表样本的真实情况[18]。6 种发酵辣椒制品Chao指数、Ace 指数差异明显,Chao 指数、Ace 指数主要评价物种总数指标,因此得出6 种发酵辣椒制品物种总数排序为云南辣椒酱>江苏泡椒>贵州剁辣椒>江西泡椒>湖南鲊辣椒>湖南辣椒酱；云南辣椒酱Shannon 指数最大（3.22）,贵州剁辣椒Shannon 指数最小,为1.00。其中,云南辣椒酱Chao 指数、Ace 指数最高,表示其物种总数较多；Shannon 指数最大,而Simpson 指数最小,说明云南辣椒酱群落丰富度和物种多样性较其他地区丰富。Shannoneven 是关于物种个体数目在群落中分配的均匀程度的指数,数值越大,越均匀,云南辣椒酱的Shannoneven 指数最大,表明均匀性较好。
2.6 主成分分析和聚类分析
主成分分析（principal component analysis,PCA）是一种可以对数据进行简化处理进而获得有效信息的技术,通过在PCA 散点图中样品分布距离判断物种组成,越相似其距离就越接近[19]。不同传统发酵辣椒制品主成分分析和聚类分析见图4。
图4 不同传统发酵辣椒制品主成分分析和聚类分析
Fig.4 Principal component analysis and cluster analysis of different traditional fermented chili products
A. 主成分分析；B. 聚类分析。
由图4A 可知,PC1 和PC2 两主轴贡献之和大于70%,说明能够反映样品大部分的信息。根据图中样本分布,江西泡椒和湖南鲊辣椒、江苏泡椒和贵州剁辣椒两两相距较近,说明其菌群结构相似。云南辣椒酱与江西泡椒和湖南鲊辣椒分布的距离相对较近,说明不同地区的辣椒制品菌群结构存在一定的相似性。湖南辣椒酱与其他5 种样品距离较远,菌群差异最大。在同一种辣椒制品中,湖南辣椒酱和云南辣椒酱相距较远,江苏泡椒和江西泡椒相距较远,这可能是地域环境、加工工艺、食盐添加量等不同所致。
对距离矩阵按层级进行分类,构建出聚类树,通过树状图样本之间的关系来进行聚类分析,树枝的长短代表着样本之间的差异,差异小的样本,间距就越近。由图4B 可知,江西泡椒和云南辣椒酱距离较近,江苏泡椒和贵州剁辣椒距离较近,湖南辣椒酱与其他5 种样品距离较远,与主成分分析结果基本一致。
2.7 菌群在属水平上的结构组成分析
不同地区发酵辣椒制品菌群在属水平上的相对丰度见表4。
表4 不同地区发酵辣椒制品菌群在属水平上的相对丰度
Table 4 Relative abundance of bacterial flora at the genus level in fermented chili products from different regions%
菌属名称魏斯氏菌属（Weissella）植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）屎乳杆菌属（Ligilactobacillus）罗伊氏粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）罗伊氏乳杆菌属（Lactobacillus）片球菌属（Pediococcus）明串珠菌属（Leuconostoc）布氏乳杆菌（Lentilactobacillus）副干酪乳杆菌属（Lacticaseibacillus）罗伊氏乳杆菌属（Latilactobacillus）乳酸菌相对丰度合计Simplicispira杆菌属（Bacillus）泛菌属（Pantoea）不动杆菌属（Acinetobacter）鞘脂菌属（Sphingobium）柠檬酸细菌属（Citrobacter）屠场杆菌属（Macellibacteroides）阴沟肠杆菌属（Enterobacter）伊格纳茨氏菌属（Ignatzschineria）高温放线菌属（Kroppenstedtia）拟杆菌属（Bacteroides）假单胞菌属（Pseudomonas）未分类其他菌属云南辣椒酱0.74 0.61 0.01 0.08 0.05 0.58 1.97 0.00 0.09 0.30 4.43 0.05 24.66 20.91 0.17 11.70 10.02 0.01 4.96 5.17 4.01 0.02 0.76 0.98 12.14江苏泡椒73.75 2.14 0.02 0.33 0.18 0.09 1.20 0.01 0.29 0.00 78.01 0.04 1.66 0.17 0.35 0.09 0.73 0.01 0.00 0.01 0.07 1.29 0.32 6.61 10.66湖南辣椒酱23.96 58.15 0.00 0.00 0.00 12.00 0.02 0.00 0.00 0.00 94.13 0.01 0.00 0.08 0.02 1.05 2.54 0.00 0.65 0.00 0.00 0.00 0.02 0.02 1.48湖南鲊辣椒0.24 0.60 0.00 0.05 0.05 0.10 0.00 0.00 0.00 0.00 1.04 50.53 0.19 0.01 14.61 3.65 13.70 7.33 0.00 0.00 0.00 0.03 1.26 0.66 6.98江西泡椒0.03 2.02 0.01 43.43 35.91 0.06 0.02 1.24 0.27 0.00 82.99 0.00 0.40 0.50 0.02 0.25 7.16 0.00 5.66 0.00 0.00 0.01 0.01 0.74 2.27贵州剁辣椒0.66 2.47 47.63 0.54 0.19 0.07 0.78 0.02 0.48 0.03 52.87 0.05 2.35 0.43 0.45 2.96 2.28 0.00 0.31 0.00 0.09 2.61 0.43 12.91 22.24
从表4 可知,6 种样品的细菌种类在属水平上具有多样性,它们之间的丰度也存在较大差异。云南辣椒酱中主要优势菌种有杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、阴沟肠杆菌属（Enterobacter）、伊格纳茨氏菌属（Ignatzschineria）、高温放线菌属（Kroppenstedtia）、明串珠菌属（Leuconostoc）；江苏泡椒优势菌属是魏斯氏菌属（Weissella）、植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）、杆菌属（Bacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）和明串珠菌属（Leuconostoc）；湖南辣椒酱中优势菌属是植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、片球菌属（Pediococcus）和鞘脂菌属（Sphingobium）；湖南鲊辣椒中优势菌属是Simplicispira、不动杆菌属（Acinetobacter）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、屠场杆菌属（Macellibacteroides）和假单胞菌属（Pseudomonas）；江西泡椒中优势菌属是罗伊氏粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）、罗伊氏乳杆菌属（Lactobacillus）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、阴沟肠杆菌属（Enterobacter）、植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）和布氏乳杆菌（Lentilactobacillus）；贵州剁辣椒中优势菌属是屎乳杆菌属（Ligilactobacillus）、鞘脂菌属（Sphingobium）、拟杆菌属（Bacteroides）、植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）、杆菌属（Bacillus）和柠檬酸细菌属（Citrobacter）。
2.8 FAPROTAX 功能预测分析
原核生物类群的功能注释（functional annotation of prokaryotic taxa,FAPROTAX）是根据已发表的文献手动整理出的群落功能注释数据库,目前已包含多个功能注释和分类群。不同地区发酵辣椒制品微生物功能相对丰度见表5。
表5 不同地区发酵辣椒制品微生物功能相对丰度
Table 5 Relative abundance of microorganisms function in fermented chili products from different regions%
功能名称化能异养发酵需氧化能异养细胞内寄生虫动物寄生虫或共生体哺乳动物-肠道人类-肠道人类-病原菌芳香化合物降解硝酸盐还原其他功能云南辣椒酱17.60 9.29 12.63 0.23 7.99 7.29 7.29 0.51 0.31 5.58 3.47江苏泡椒31.23 30.30 1.09 26.78 0.65 0.30 0.30 0.15 0.31 0.07 1.79湖南辣椒酱26.31 25.18 2.81 0.08 2.22 2.07 2.07 0.19 0.02 0.64 1.33湖南鲊辣椒15.51 6.37 14.76 0.01 11.82 5.64 5.64 6.76 6.05 0.04 1.75江西泡椒24.55 24.30 3.81 0.01 6.39 6.35 6.35 0.05 0.03 2.87 0.34贵州剁辣椒7.97 4.03 4.67 33.98 2.14 1.23 1.23 0.57 0.84 0.72 5.75
从表5 可知,具有化能异养、发酵、需氧化能异养功能的微生物菌群其相对丰度在云南辣椒酱、江苏泡椒、湖南辣椒酱、湖南鲊辣椒和江西泡椒中均较高,是自然发酵辣椒制品微生物菌群的主要功能,其中江苏泡椒、湖南辣椒酱和江西泡椒中具有发酵功能的微生物菌群相对丰度远高于其他样品,分别为30.30%、25.18% 和24.30%。具有动物寄生虫或共生体、哺乳动物-肠道和人类-肠道功能的微生物在云南辣椒酱、湖南辣椒酱、湖南鲊辣椒、江西泡椒和贵州剁辣椒中相对丰度也较高,均在1% 以上。湖南鲊辣椒中还具有人类-病原菌和芳香化合物降解功能的微生物相对丰度也较高,分别为6.76%和6.05%。此外,云南辣椒酱和江西泡椒中具有硝酸盐还原功能的微生物相对丰度较高,分别为5.58%和2.87%。以上结果表明,不同地区发酵辣椒样品微生物功能具有相似性,但同时也存在差异性。
3 讨论
发酵是我国最古老的食品加工和保存方法之一,可以追溯到数千年前[20],是一种低成本、低能耗的食品保藏方法[21]。发酵辣椒制品因风味独特、味道鲜美、增进食欲等特点而深受人们喜爱。发酵过程中由于受到多种因素影响,产品风味多样。其中,微生物是影响发酵辣椒制品品质的关键因素,其通过分解辣椒中果胶、脂质、蛋白质、类胡萝卜素、辣椒素和酚类物质,产生独特的香气、风味活性氨基酸、有机酸、颜色和质地,同时还会产生有益健康的化合物,形成具有独特风味的辣椒制品[22]。
研究表明细菌在辣椒发酵过程中发挥着重要作用,因此从自然发酵蔬菜中分离菌种,通过接种发酵缩短周期、提高安全性逐渐成为研究者的关注重点。乳酸菌发酵可产生有机酸、酸菌素等代谢物而明显增强发酵辣椒风味,同时还可以抑制有害细菌的生长,因而科研人员对乳酸菌分离鉴定及接种发酵的研究居多[23-24]。刘洋等[25]对四川自然发酵辣椒酱进行细菌多样性分析,发现优势菌属主要有乳杆菌属（Lactobacillus spp.）、片球菌属（Pediococcus spp.）、魏斯氏菌属（Weissella spp.）、葡萄球菌属（Staphyloccoccus spp.）等。Cai 等[26]在鲊辣椒中发现乳酸菌（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、片球菌属（Pediococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）和葡萄球菌属（Staphylococcus）是优势菌属。Ye 等[27]对腌制辣椒的微生物分析得出优势菌种为费斯莫尔德乳杆菌（Lactobacillus versmoldensis）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。此外有研究表明,从辣椒酱中分离出解淀粉芽孢杆菌和产气荚膜梭菌的拮抗菌株植物乳杆菌LM1-3,在与NaCl 和乙酸结合下能有效抑制产气30 d[28]。Li 等[29]接种植物乳杆菌PC8 发酵干辣椒酱,结果表明其氨基氮、苹果酸和琥珀酸浓度较高,颜色较红,而且有鲜明的草药、坚果和发酵香气特征。韩江雪等[30]分析不同乳酸菌发酵辣椒的风味成分,发现发酵乳杆菌、乳酸片球菌以及植物乳杆菌接种发酵的辣椒品质风味比自然发酵高。本研究应用Illumina MiSeq 高通量测序技术,检测了6 种地区的发酵辣椒制品群落结构及相对丰度,其中相对丰度大于1%的优势乳酸菌主要有魏斯氏菌属（Weissella）、植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）、屎乳杆菌属（Ligilactobacillus）、罗伊氏粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）、罗伊氏乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和布氏乳杆菌（Lentilactobacillus）,此外相对丰度较高的还有Simplicispira、杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘脂菌属（Sphingobium）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、屠场杆菌属（Macellibacteroides）、阴沟肠杆菌属（Enterobacter）、伊格纳茨氏菌属（Ignatzschineria）、高温放线菌属（Kroppenstedtia）、拟杆菌属（Bacteroides）和假单胞菌属（Pseudomonas）,且不同样品中各种乳酸菌相对丰度有较大差异,这可能是不同地区6 种发酵辣椒制品风味各异的重要原因。江西泡椒乳酸菌相对丰度在6 种样品中较高,其总酸含量也较高,而贵州剁辣椒乳酸菌相对丰度较低,其总酸含量也较低（表4）。需要特别指出的是,云南辣椒酱和湖南鲊辣椒的乳酸菌相对丰度较低,但其总酸含量均较高,这可能是由于云南辣椒酱和湖南鲊辣椒中分别添加了大豆和大米粉,导致柠檬酸细菌属相对丰度较高,分别为10.02%和13.70%。
发酵辣椒制品制作过程中,食盐也是常用的辅料,具有抑制微生物生长及防腐的作用,其浓度也会影响发酵蔬菜样品的理化指标变化、菌群结构差异,以及产生不同的感官和风味[31-32]。李军波[33]比较了3 种食盐浓度（2%、5%和8%）的传统自然发酵泡菜中微生物和代谢物的变化,结果显示添加2% 食盐的泡菜中乳酸菌繁殖速度最快,既有同型发酵,也有异型发酵,发酵结束时乳酸含量最高。熊涛等[34]研究了2%、5% 和8%食盐水对自然发酵圆白菜菌系结构和代谢物的影响,结果表明2%食盐浓度泡菜的乳酸菌繁殖最快,酵母最先消亡,发酵结束时乳酸含量最高。此外,申文熹[35]采用2%、5% 和8% 食盐添加量制作传统四川泡圆白菜,研究了发酵过程中细菌群落结构的变化,结果表明添加2%食盐的样品菌落总数在整个发酵期间最高,同时总酸含量也最高,而添加8%食盐的样品菌落总数和总酸含量最低。本研究中,食盐含量较高的样品是云南辣椒酱和贵州剁辣椒,其中贵州剁辣椒的菌落总数和总酸度也较低,与前人研究基本一致,但云南辣椒酱的菌落总数和总酸度在6 种样品中均最高,这可能是因为云南辣椒酱制作过程中还用到了大豆、红糖等原料,为微生物提供了较好的生长条件。此外,尽管湖南鲊辣椒的菌落总数并不高,但总酸度很高,这可能是其加工过程中添加了较多的大米粉,且未添加食盐,是微生物利用淀粉发酵产酸所致。
4 结论
不同地区6 种发酵辣椒制品的总酸度、pH 值、氯化钠和亚硝酸钠含量及菌落总数分别为1.58～24.21 g/kg、3.23～5.56、2.80%～7.88%、0.31～1.03 mg/kg 和3.85～6.30 lg（CFU/g）,这些差异可能与地区环境、加工工艺及氯化钠添加量等有关。此外,不同地区的辣椒制品菌群结构存在一定的相似性,但也存在较大差异,6 种样品中湖南辣椒酱与其他5 种样品菌群结构差异最大；发酵辣椒制品原辅料如大豆、大米粉、氯化钠等可能对微生物群落结构、相对丰度和理化指标产生较大影响,其确切关系还有待进一步研究。功能预测分析发现,除贵州剁辣椒外,其他5 种样品中具有化能异养、发酵、需氧化能异养功能的微生物菌群相对丰度均较高,这些功能可能对产品风味的形成具有重要促进作用。本研究揭示了不同地区6 种自然发酵辣椒制品中微生物群落结构和多样性差异,表明样品中含有丰富的乳酸菌资源,可为后期乳酸菌的进一步分离、鉴定与工业化利用提供参考。
[1]CHO S Y, KIM H W, LEE M K, et al. Antioxidant and anti-inflammatory activities in relation to the flavonoids composition of pepper(Capsicum annuum L.)[J]. Antioxidants, 2020, 9(10): 986.
[2]OLATUNJI T L, AFOLAYAN A J. The suitability of chili pepper(Capsicum annuum L.) for alleviating human micronutrient dietary deficiencies: A review[J]. Food Science & Nutrition, 2018, 6(8):2239-2251.
[3]LIU Z J, CAI S B, ZHANG S Y, et al. A systematic review on fermented chili pepper products: Sensorial quality, health benefits,fermentation microbiomes, and metabolic pathways[J]. Trends in Food Science & Technology, 2023, 141: 104189.
[4]付浩, 张小明, 田浩. 辣椒产业发展现状分析及建议——基于贵州辣椒产业高质量发展分析研究[J]. 耕作与栽培, 2024, 44(2):146-150.FU Hao, ZHANG Xiaoming, TIAN Hao. Analysis and suggestions of the chili industry′s current development situation based on the high-quality development of the chili industry in Guizhou province[J]. Tillage and Cultivation, 2024, 44(2):146-150.
[5]LI Z H, DONG L, ZHAO C, et al. Metagenomic insights into the changes in microbial community and antimicrobial resistance genes associated with different salt content of red pepper (Capsicum annuum L.) sauce[J]. Food Microbiology, 2020, 85: 103295.
[6]庞春霞, 李艺, 虞任莹, 等. 基于Illumina Miseq 技术比较不同地区传统发酵大豆制品细菌多样性[J]. 食品工业科技, 2022, 43(8): 133-140.PANG Chunxia, LI Yi, YU Renying, et al. Comparison of bacterial diversity of traditional fermented soybean products from different regions based on Illumina Miseq technology[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(8): 133-140.
[7]HE G Q, LIU T J, SADIQ F A, et al. Insights into the microbial diversity and community dynamics of Chinese traditional fermented foods from using high-throughput sequencing approaches[J]. Journal of Zhejiang University Science B, 2017, 18(4): 289-302.
[8]李成, 孔晓雪, 余炬波, 等. 基于高通量测序分析蟹糊微生物菌群多样性[J]. 食品科学, 2020, 41(4): 134-139.LI Cheng, KONG Xiaoxue, YU Jubo, et al. Analysis of microbial community diversity of crab paste by high-throughput sequencing[J]. Food Science, 2020, 41(4): 134-139.
[9]韩俊燕, 赵国忠, 赵建新, 等. 发酵辣椒细菌多样性的16S rDNA测序分析[J]. 中国食品学报, 2018, 18(5): 246-251.HAN Junyan, ZHAO Guozhong, ZHAO Jianxin, et al. 16S rDNA sequencing analysis of bacterial diversity of fermented pepper[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2018,18(5): 246-251.
[10]PENG S J, XU J Y, XU J G, et al. Microbial community and volatile metabolites related to the fermentation degree of salted fermented chili peppers[J]. LWT-Food Science and Technology, 2023,181: 114752.
[11]中华人民共和国国家卫生健康委员会, 国家市场监督管理总局. 食品安全国家标准 食品中总酸的测定: GB 12456—2021[S]. 北京: 中国标准出版社, 2021.National Health Commission of the People′s Republic of China,State Administration for Market Regulation. National food safety standard Determination of total acid in foods: GB 12456—2021[S].Beijing: Standards Press of China, 2021.
[12]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准 食品中氯化物的测定: GB 5009.44—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.National Health and Family Planning Commission of the People′s Republic of China. National food safety standard Determination of chloride in food: GB 5009.44—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017.
[13]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局. 食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定: GB 5009.33—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.National Health and Family Planning Commission of the People′s Republic of China, State Food and Drug Administration. National food safety standard Determination of nitrite and nitrate in food: GB 5009.33—2016[S]. Beijing: Standards Press of China, 2017.
[14]中华人民共和国国家卫生健康委员会, 国家市场监督管理总局. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定: GB 4789.2—2022[S]. 北京: 中国标准出版社, 2022.National Health Commission of the People′s Republic of China,State Administration for Market Regulation. National standard for food safety Food microbiological test Total colony determination:GB 4789.2—2022[S]. Beijing: Standards Press of China, 2022.
[15]中华人民共和国国家卫生健康委员会, 国家市场监督管理总局. 食品安全国家标准 食品中污染物限量: GB 2762—2022[S].北京: 中国标准出版社, 2022.National Health Commission of the People′s Republic of China,State Administration for Market Regulation. National standard for limit of pollutants in food: GB 2762—2022[S]. Beijing: Standards Press of China, 2022.
[16]魏本良, 刘长根, 肖阳生, 等. 基于Illumina HiSeq 技术分析浆水中细菌多样性及理化性质[J]. 食品科学, 2019, 40(6): 62-68.WEI Benliang, LIU Changgen, XIAO Yangsheng, et al. Bacterial diversity analysis using Illumina HiSeq sequencing of Jiangshui, a Chinese fermented vegetable food, and its physicochemical properties[J]. Food Science, 2019, 40(6): 62-68.
[17]ZHANG L N, CUI D, MA X D, et al. Comparative analysis of rice reveals insights into the mechanism of colored rice via widely targeted metabolomics[J]. Food Chemistry, 2023, 399: 133926.
[18]LI K K, ZHUO C, TENG C Y, et al. Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on chronic pancreatitis and intestinal microbiota in mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2016, 93(Pt A): 904-912.
[19]AREDES R S, PEIXOTO F C, SPHAIER L A, et al. Evaluation of craft beers through the direct determination of amino acids by capillary electrophoresis and principal component analysis[J]. Food Chemistry, 2021, 344: 128572.
[20]LIU S N, HAN Y, ZHOU Z J. Lactic acid bacteria in traditional fermented Chinese foods[J]. Food Research International, 2011, 44(3):643-651.
[21]LI Y M, LUO X Q, LONG F W, et al. Quality improvement of fermented chili pepper by inoculation of Pediococcus ethanolidurans M1117: Insight into relevance of bacterial community succession and metabolic profile[J]. LWT-Food Science and Technology, 2023,179: 114655.
[22]吴旋, 阚晓波, 徐怀德, 等. 植物乳杆菌发酵的不同地区辣椒品质分析[J]. 中国食品学报, 2022, 22(7): 319-327.WU Xuan, KAN Xiaobo, XU Huaide, et al. Quality analysis of pepper from different regions fermented by Lactobacillus plantarum[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2022,22(7): 319-327.
[23]WOUTERS D, GROSU-TUDOR S, ZAMFIR M, et al. Applicability of Lactobacillus plantarum IMDO 788 as a starter culture to control vegetable fermentations[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3352-3361.
[24]DI CAGNO R, CODA R, DE ANGELIS M, et al. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J]. Food Microbiology, 2013, 33(1): 1-10.
[25]刘洋, 丁悦, 孙劲松, 等. 基于高通量测序分析四川辣椒酱自然发酵过程中细菌群落结构演替规律[J]. 食品工业科技, 2020, 41(24): 81-86.LIU Yang, DING Yue, SUN Jinsong, et al. Succession of bacterial community structure during Sichuan chili sauce natural fermentation analyzed by high-throughput sequencing[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(24): 81-86.
[26]CAI W C, TANG F X, WANG Y R, et al. Bacterial diversity and flavor profile of Zha-Chili, a traditional fermented food in China[J].Food Research International, 2021, 141: 110112.
[27]YE Z, SHANG Z X, ZHANG S Y, et al. Dynamic analysis of flavor properties and microbial communities in Chinese pickled chili pepper (Capsicum frutescens L.): A typical industrial-scale natural fermentation process[J]. Food Research International, 2022, 153:110952.
[28]ZHENG Y, CHEN J, CHEN L, et al. Analysis and control of microbial gas production in fermented chili paste[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2020, 44(10): e14806.
[29]LI X, CHENG X Q, YANG J, et al. Unraveling the difference in physicochemical properties, sensory, and volatile profiles of dry chili sauce and traditional fresh dry chili sauce fermented by Lactobacillus plantarum PC8 using electronic nose and HS-SPME-GCMS[J]. Food Bioscience, 2022, 50: 102057.
[30]韩江雪, 丁筑红, 李仲军, 等. 不同乳酸菌强化接种发酵辣椒挥发性风味成分分析[J]. 食品科学, 2012, 33(10): 179-183.HAN Jiangxue, DING Zhuhong, LI Zhongjun, et al. Volatile analysis of chili fermented by different Lactobacillus species[J]. Food Science, 2012, 33(10): 179-183.
[31]于新颖, 刘文丽, 殷杰, 等. 不同食盐浓度下白菜泡菜的乳酸菌数及理化指标变化[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(10): 119-124.YU Xinying, LIU Wenli, YIN Jie, et al. The lactic acid bacteria and physicochemical changes of Chinese cabbage Paocai fermented in different salinity[J]. Food and Fermentation Industries,2015, 41(10): 119-124.
[32]谢靓, 蒋立文. 不同食盐含量对发酵辣椒质构的变化研究[J].中国酿造, 2014, 33(11): 59-62.XIE Jing, JIANG Liwen. Effect of different salt content on change of fermented chili texture[J]. China Brewing, 2014, 33(11): 59-62.
[33]李军波. 盐浓度对传统泡菜和强化发酵泡菜的影响[D]. 南昌:南昌大学, 2016.LI Junbo. Effect of salt concentration on traditional Chinese sauerkraut and fortified fermented sauerkraut[D]. Nanchang: Nanchang University, 2016.
[34]熊涛, 李军波, 彭飞, 等. 食盐质量浓度对传统自然发酵圆白菜的菌系结构和代谢的影响[J]. 食品科学, 2015, 36(11): 172-176.XIONG Tao, LI Junbo, PENG Fei, et al. Effect of salt concentration on microbial community composition and metabolism in traditional pickled cabbage[J]. Food Science, 2015, 36(11): 172-176.
[35]申文熹. 不同食盐浓度对传统四川泡圆白菜发酵过程中细菌群落结构和品质的影响研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2020.SHEN Wenxi. Effects of different salt concentrations on the bacterial community structure and quality during the fermentation process of traditional Sichuan pickled cabbage[D]. Ya′an: Sichuan Agricultural University, 2020.