豌豆分离蛋白是一种优质的植物蛋白,营养丰富、来源广泛、价格低廉、不含过敏原,已被应用于蛋白基薄膜的开发[1]。然而,豌豆分离蛋白基薄膜具有一些固有的缺点（力学性能、阻隔性、热稳定性较差等）,限制了其在食品包装领域的应用。因此,迫切需要利用改性技术来改善豌豆分离蛋白基薄膜的基本功能性能。
近年来,由于人们的环保意识不断提高,合理节约资源的加工理念应运而生,其中关于水果加工副产物的利用成为研究重点。水果加工后的副产物（水果残渣）价值较高,如苹果渣中存在大量的纤维素,从中提取出的纤维素纳米晶体作为一种高纵横比、可生物降解、可再生的纳米级膳食纤维,其在食品领域的潜在应用已被广泛探究[2]。研究表明,纤维素纳米晶体不仅改善了琼脂/明胶薄膜和琼脂/结冷胶薄膜的机械性能,而且与普通的塑料薄膜相比,纤维素纳米晶体改性后的草莓保鲜性能更好[3]。纤维素纳米晶体独特的物理化学特性使其更容易通过物理填充效应或界面相互作用来改善天然聚合物薄膜的功能性能。
单一的改性技术很难全面提升蛋白基薄膜的功能性能,在这方面多种技术的协同使用是非常有效和必要的,对提升薄膜包装性能至关重要。金属盐离子是另一个能够引发蛋白质凝胶化的重要因素,这取决于盐离子的价态和浓度。其中,钠离子（Na+）是一种重要的增强剂,常用于促进凝胶的形成和稳定凝胶基质[4]。金属离子可能会影响静电相互作用、氢键、疏水相互作用和二硫键,这些是维持凝胶系统中蛋白质凝胶的主要力量。蛋白质的静电排斥力以及蛋白质与其溶剂之间的分子间力随着电荷数的变化显著变化,这影响了凝胶化过程,包括肽链的延伸、重排和聚集[5]。
基于此,假设Na+可能会增强分子间相互作用从而提升豌豆分离蛋白基薄膜的功能性质,本研究旨在探究Na+对豌豆分离蛋白基薄膜功能性质的影响,包括力学性能、阻隔性能、光学性能、耐水性等,以期为设计开发高性能的蛋白基薄膜提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
苹果渣：阜阳师范大学安徽省功能性果饮生态发酵工程研究中心提供；豌豆分离蛋白（蛋白质含量大于80%）：上海源叶生物科技有限公司；甘油、乙醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；透析袋（8 000～14 000 Da）：北京索莱宝生物科技有限公司；NaOH、NaClO2、H2SO（4均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
电热鼓风干燥箱（GZX-9070）：上海博迅实业有限公司；超声波多频清洗机（KQ-250DE）：昆山超声仪器有限公司；恒温恒湿培养箱（YKHWS-160L）：合肥右科仪器设备有限公司；扫描电子显微镜（S-3400N）、比色仪（CM-400）：日本日立公司；原子力显微镜（multimode-8）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）仪（Vertex70）、X-射线衍射仪（D8Advance）：德国布鲁克公司；热重分析仪（DTG 60A）：日本岛津公司；电子千分尺（DL91150）：宁波得力集团有限公司；质构分析仪（XLW）：济南兰光测试仪器有限公司；水接触角测量仪（JY-82B）：德国克吕士公司。
1.2 方法
1.2.1 苹果渣纤维素纳米晶的制备
苹果渣纤维素纳米晶以苹果渣为原料,采用经典的硫酸水解法制备[6]：将苹果渣在60 ℃电热鼓风干燥箱中干燥24 h,粉碎后过40 目筛。所得粉末在室温（25 ℃）下用乙醇洗涤12 h,去除脂质成分,自然晾干。随后,将所得样品按1∶20 （g/mL）料液比浸泡于5%的NaOH 溶液中,70 ℃条件下搅拌4 h。经大量去离子水清洗后,将不溶性残渣混入2.0%的NaClO2 溶液中（用醋酸将pH 值调为3～4）,70 ℃条件下搅拌2 h,此漂白过程重复5 次。最终将得到的白色悬浊液用去离子水彻底清洗至pH 值为中性,用滤布过滤,得到苹果渣纤维素。将苹果渣纤维素按1∶20 （g/mL）料液比分散于64%的H2SO4 溶液中,在45 ℃条件下搅拌90 min。随后,用10 倍冷去离子水稀释酸液以终止水解反应,得到苹果渣纤维素纳米晶悬浮液,冷冻干燥后得到苹果渣纤维素纳米晶粉末,备用。
1.2.2 原子力显微镜扫描
用原子力显微镜观察所制备的苹果渣纤维素纳米晶的形态特征。
1.2.3 苹果渣纤维素纳米晶-豌豆分离蛋白复合膜的制备
取一定量的豌豆分离蛋白（4.5%）、苹果渣纤维素纳米晶（0.5%,10 g）和甘油（2%）分别与不同浓度的Na+混入去离子水,室温下搅拌2 h。将得到的混合溶液在水浴（90 ℃）中加热25 min,超声（25 ℃,500 W）脱气10 min。将成膜液（10 mL）倒到直径为90 mm 的一次性培养皿中,在55 ℃电热鼓风干燥箱中干燥12 h。将制备好的薄膜放入恒温恒湿培养箱（25 ℃,相对湿度50%）静置平衡48 h。将未添加Na+的对照组命名为APNC-PPI 薄膜。
1.2.4 薄膜的微观结构
采用恒定电压5.00 kV,放大8 000 倍的扫描电子显微镜对薄膜进行观察,记录薄膜表面的微观形貌。
1.2.5 薄膜性能的测定
1.2.5.1 厚度测定使用精确度为0.001 mm 的千分尺选取薄膜10 个不同位置测定其厚度。
1.2.5.2 机械性能采用质构分析仪测量剪切至均匀尺寸（20 mm×20 mm）的薄膜的抗拉伸强度（tensile strength,TS）和断裂伸长率（elongation at break,EAB）。测量条件如下：扩展速率为1.0 mm/s,初始夹具距离为20 mm。抗拉伸强度（TS,MPa）和断裂伸长率（EAB,%）计算公式如下。
式中：FMAX 表示拉伸过程中产生的最大载荷力,N；t 为膜的厚度,mm；L 为膜的横截面宽度,mm；L0 为膜的初始长度,mm；L1 为拉伸时薄膜断裂的长度,mm。
1.2.5.3 含水量测定
采用重量法测定薄膜的含水量（water content,WC）,精确称量薄膜,然后在105 ℃的电热鼓风干燥箱中烘干至恒重,记录薄膜的质量[7]。薄膜的含水量（WC,%）计算公式如下。
式中：m0 为薄膜的初始质量,g；m1 为薄膜干燥至恒重时的质量,g。
1.2.5.4 水蒸气透过率测定
水蒸气透过率（water vapor permeability,WVP）的测定方法参照Xu 等[8]的方法。在测试杯中加入去离子水（10 mL）,杯口用薄膜密封,在恒温恒湿室（25 ℃,50% 相对湿度）中保存48 h。每隔6 h 测量测试杯的质量,监测失水情况。水蒸气透过率[WVP,g/（Pa·s·m）]计算公式如下。
式中：Δm/Δt 为损失质量随时间曲线的斜率,g/s；t为膜的厚度,m；S 为测试杯边的面积,m2；Δp 表示薄膜在储存环境中两侧的水蒸气压差,Pa。
1.2.5.5 水接触角（water contact angle,WCA）的测定
用水接触角测量仪记录在膜表面（20 mm×20 mm）滴入10 μL 去离子水后形成的角度。
1.2.5.6 色差
使用比色仪扫描薄膜表面的L*值（亮度）、a*值（红度或绿度）和b*值（黄度或蓝度）。以标准白板（L0=96.59、a0=-0.13、b0=-0.11）为对照组。总色差（ΔE）计算公式如下。
1.2.5.7 傅立叶变换红外光谱
薄膜的红外光谱由FTIR 光谱仪收集。程序如下：扫描编号32,背景为空气,扫描范围4 000～650 cm-1,分辨率4 cm-1。
1.2.5.8 X 射线衍射光谱利用X 射线衍射仪对薄膜的晶体结构进行测量。扫描速度为10°/min,扫描范围为5°～90°（2θ）。
1.2.5.9 热稳定性使用热重分析仪评估薄膜的热稳定性。将样品放置在氮气环境中以20 ℃/min 的速率从25 ℃加热到800 ℃,记录样品的失重曲线。
1.3 统计分析
试验结果均重复3 次或以上,以平均值±标准差表示。采用Statistics V17.0 软件评估统计学显著性。
2 结果与分析
2.1 微观形貌分析
本试验采用硫酸水解法从苹果残渣中制备出纤维素纳米晶,图1 为原子力显微镜扫描结果。
图1 苹果渣纤维素纳米晶的原子力显微镜图
Fig.1 Atomic force microscopy of APNC
由图1 可知,由苹果渣制备的纤维素纳米晶呈现出典型的针状结构,其平均长度和宽度分别为（236.35±85.42）nm 和（38.43±9.03）nm。
图2 为不同Na+浓度豌豆分离蛋白基膜的横截面。
图2 豌豆分离蛋白基膜的扫描电子显微镜图（横截面）
Fig.2 Scan electron microscope of PPI-based film （cross-section）
a～e 分别为Na+浓度0、25、50、75、100 mmol/L。
由图2 可知,对照组（0 mmol/L）的APNC-PPI 薄膜中存在许多褶皱和沟壑结构。可能是加热过程中水分流时产生的水通道相互连接造成的。天然豌豆分离蛋白分子间的交联能力较弱,凝胶网络结构主要依靠蛋白质的热聚集和疏水作用形成,网络结构相对松散[9]。当Na+浓度从25 mmol/L 逐渐增加到100 mmol/L 时,复合膜的横截面逐渐变得平滑,结构变得更加致密,从而限制了自由水的流动和析出。这主要是带正电的Na+与带负电的氨基酸结合,削弱了蛋白质分子间的静电排斥力[10],从而促使蛋白质以适当的速度和程度有序聚集,使薄膜内部结构更加致密。
2.2 机械性能分析
不同Na+浓度APNC-PPI 薄膜机械性能分析见图3～图5。
图3 豌豆分离蛋白基膜的厚度
Fig.3 Thickness of PPI-based film
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图3 可知,随着Na+浓度的增加,各组膜的厚度也不断地增加且厚度间差异较为显著（p<0.05）。Na+添加使得APNC 与PPI 间结合的范围更广,更多的APNC 进入PPI 使得薄膜厚度明显增加。
APNC-PPI 薄膜的断裂伸长率和抗拉伸强度是体现该膜的力学性能的重要依据。由图4 和图5 可知,添加Na+后均对薄膜的力学性能产生显著影响。对于断裂伸长率是正向反馈,断裂伸长率不断增加,抗拉伸强度则反之。这也表明APNC-PPI 薄膜拥有了更加柔韧的力学性能。这一切归因于Na+的添加更好地结合了APNC-PPI 薄膜自身的刚性,增强了两者的界面黏附力,拉伸强度随之降低,使其表现出更好的柔韧性和更强的抗变形能力,使薄膜的应用方向多样化。
图4 豌豆分离蛋白基膜的断裂拉伸率
Fig.4 Tensile elongation at break of PPI-based film
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
图5 豌豆分离蛋白基膜的拉伸强度
Fig.5 Tensile strength of PPI-based film
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
2.3 水敏性能分析
不同Na+浓度豌豆分离蛋白基膜的含水量见图6。
图6 豌豆分离蛋白基膜的含水量
Fig.6 Water content of PPI-based film
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图6 可知,Na+浓度的变化并不会影响豌豆分离蛋白基膜的含水量（p>0.05）。含水量的变化主要还是由APNC-PPI 薄膜中的亲水性多糖APNC 决定。经过平衡处理后,APNC-PPI 薄膜的含水率保持在84.09%～87.63%。这可能是由于APNC 增强的薄膜结构更加紧密,与水分子的接触面积减小,增加了水分子进入薄膜的阻力,同时薄膜自身水分也被保留使其拥有较高的含水量[11]。
水蒸气透过率（WVP）是影响薄膜应用的重要性能之一,其一般反映了薄膜的致密性,值越小说明薄膜的密封效果越好。不同Na+浓度豌豆分离蛋白基膜的水蒸气透过率见图7。
图7 豌豆分离蛋白基膜的水蒸气透过率
Fig.7 Water vapor permeability of PPI-based film
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图7 可知,Na+浓度为25～100 mmol/L 时,豌豆分离蛋白基薄膜的WVP 值整体上呈现出明显下降趋势。APNC-PPI 薄膜防漏性的增强可能是由于在薄膜形成过程中Na+的加入使得APNC 与PPI 之间形成了更多的氢键,从而使薄膜结构变得更加紧密[12]。Na+的加入使APNC-PPI 薄膜形成了更致密的结构,表明外界环境水分的渗透受到抑制,从而阻碍了水蒸气的渗入。而薄膜内层可以吸收并保留来自内部环境的水分。同时也使薄膜具有更内聚的结构,能够最大程度地扩大两侧的阻水性差异。
薄膜的水接触角反映薄膜的疏水性。不同Na+浓度豌豆分离蛋白基膜的水接触角见图8。
图8 豌豆分离蛋白基膜的水接触角
Fig.8 Water contact angle of PPI-based film
a～e 分别为Na+浓度0、25、50、75、100 mmol/L。
由图8 可知,对照组APNC-PPI 薄膜的WCA 值较大,可能是APNC 的存在导致豌豆分离蛋白分子的蛋白质构象发生变化,从而暴露出更多的疏水性氨基酸侧链[13]。APNC-PPI 薄膜相对有较高的疏水性。Na+的加入导致豌豆分离蛋白基薄膜的WCA 值在不断下降,薄膜表面更加亲水,这对包装膜有影响。薄膜疏水性的降低可能是带有羟基的亲水分子持续扩大薄膜表面的亲水通道。同时也考虑到WCA 值是薄膜表面润湿性的测量,它不仅与表面化学性质有关,还受薄膜表面微观结构,即粗糙度、孔隙率和孔径的影响[14]。
2.4 颜色参数分析
对于包装膜来说,其颜色是重要的感官特性,在一定程度上会主导消费者的选择,也会影响其应用价值。表1 显示了不同Na+浓度豌豆分离蛋白基薄膜的表面颜色参数。
表1 豌豆分离蛋白基膜的颜色参数
Table 1 Color parameters of PPI-based film
注：同列相同小写字母表示差异不显著（p>0.05）。
Na+浓度/（mmol/L）0 25 50 75 100 ΔE 值5.46±0.39a 6.50±0.55a 6.61±1.04a 6.13±1.93a 6.99±1.43a L*值95.75±0.09a 95.53±0.12a 95.53±0.22a 95.62±0.42a 95.43±0.30a a*值-1.01±0.07a-1.19±0.10a-1.20±0.19a-1.13±0.33a-1.29±0.24a b*值5.22±0.38a 6.22±0.53a 6.32±1.00a 5.86±1.86a 6.69±1.38a
由表1 可知,与对照组薄膜相比,添加Na+后,薄膜的L*值、ΔE 值、a*以及b*值均无显著差异（p>0.05）,表明Na+的存在并没有改变PPI 基薄膜表面颜色的参数。这也侧面说明了薄膜的颜色主要受薄膜里含有的APNC 这种多糖影响,其主要的变化大多在加热过程中,APNC 中的羰基与豌豆分离蛋白所含的氨基发生了反应,产生的棕色化合物会对薄膜的表面颜色产生影响[15]。
2.5 化学/晶体结构分析
不同Na+浓度豌豆分离蛋白基膜的红外光谱和X射线衍射光谱如图9、图10 所示。
图9 豌豆分离蛋白基膜的红外光谱
Fig.9 Infrared spectroscopy of PPI-based film
图10 豌豆分离蛋白基膜的X 射线衍射光谱
Fig.10 XRD spectra of PPI-based film
由图9 可知,豌豆分离蛋白基薄膜在3 700～3 100 cm-1 处呈现宽谱带,最大值为3 279 cm-1,与分子间和分子内氢键中的自由O—H 和N—H 基团的拉伸有关。2 933 cm-1 处出现的峰归因于C—H 键的拉伸。1 700～1 600 cm-1 和1 600～1 500 cm-1 范围内的谱带分别作为酰胺Ⅰ组（C O 的延伸）或与COO 连接的氢键以及酰胺Ⅱ（C—N 的延伸和角度变化的N—H 基团）引入的[16]。与对照组的红外光谱对比,所有复合样品的上述光谱中均未出现新的特征峰且无明显差异,说明Na+的加入并未在成膜体系中产生强烈的化学反应使之交联形成新的官能团[17]。
从图10 中可以看出,所有薄膜均在约20.28°处出现了明显的特征峰,这与豌豆分离蛋白自身的分子晶体结构相对应。随着Na+的加入会导致峰强度的减弱,甚至在Na+浓度为75 mmol/L 时会使豌豆分离蛋白基薄膜的特征峰消失。这一现象可能归因于阳离子可以诱导分子构象重排,形成结晶性较差的新型无定形构象[18]。金属阳离子的存在应大幅度地降低薄膜的峰强度,但从图10 中可以看出薄膜的峰强度只是略微降低。这表明Na+与APNC 同时存在时起到的协同作用,Na+的存在诱导了APNC 与PPI 之间的连接和交联。这种效应可以通过影响网络结构强度使得PPI 基薄膜更加致密,从而对应更高的XRD 峰强度[19]。
2.6 热性能分析
图11 的导数热重曲线反映不同Na+浓度豌豆分离蛋白基膜在热降解过程中的最大失重温度。
图11 豌豆分离蛋白基膜的导数热重曲线
Fig.11 Derivative thermogravimetry curves of PPI-based film
由图11 可知,所有薄膜都经历了3 个主要的失重阶段：第一阶段（65.59～120 ℃）主要与自由水的蒸发有关[20]；第二阶段对应于样品中的甘油和结构中结合水的损失以及纤维素的降解[21],大概发生在235 ℃左右；且随着Na+浓度的增加,最大失重温度分别从对照组的224.25 ℃降低至223.74 ℃（75 mmol/L）和184.63 ℃（100 mmol/L）。这可能是因为Na+与APNC 的协同影响,加强了薄膜的结构使薄膜中固定水的含量上升,导致薄膜在水分子分散阶段的质量变化较大,因此该阶段的最大失重温度呈下降趋势。第三阶段主要由薄膜中的豌豆分离蛋白基质的热降解引起,发生在310 ℃左右[22]。此时,所有薄膜的最大失重温度均在大气压范围[（293.22±1.34） ℃]内,没有明显的差异。
3 结论
本研究将制备得到的苹果渣纤维素纳米晶掺入豌豆分离蛋白成膜基质中制备出蛋白基复合包装膜。添加适量Na+能有效改善豌豆分离蛋白基复合薄膜的整体功能特性。与对照组相比,25～100 mmol/L 的Na+使得薄膜的断裂伸长率增加了18.35%～88.28%,表明薄膜的柔韧性增强。同时,Na+的添加使得薄膜的水蒸气透过率显著下降,表明薄膜的致密性得到了提升。Na+可能通过静电屏蔽效应促进蛋白质分子在适当的速率和程度下发生有序聚集。Na+的存在可以进一步加强纤维素链与蛋白质分子之间的交联和相互作用,导致晶体结构重排以及热稳定性提高,蛋白质的空间构象得到改善,从而有助于在APNC-PPI 复合膜中形成致密、有序、均匀的三维网络结构。综上,适量Na+的添加在调控豌豆分离蛋白基包装膜性能上发挥重要作用。
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