云南省不同颜色青稞中多酚含量及生物活性比较

青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）也称裸大麦,是一种重要的高原和高寒作物,主要种植在西藏、青海、四川、甘肃、云南等地区[1]。青稞不仅含有蛋白质、纤维素和维生素等营养素,还含有多酚、花色苷、β-葡聚糖等生物活性成分[2]。青稞按颜色可分为蓝色、白色、紫色和黑色[3]。研究发现青稞的营养成分、多酚化合物及生物活性与颜色存在一定关系[4]。

多酚根据其存在形式可分为可溶性和不可溶键合多酚,根据结构可分为类黄酮、酚酸、二苯乙烯和木脂素等[5-6]。多酚具有抗氧化、抗炎、免疫调节、降血糖和降血脂等作用,可以预防糖尿病、肥胖和癌症等慢性疾病[7]。多酚可以作为活性氧（reactive oxygen species,ROS）的清除剂和抑制剂,通过提供氢或电子以减少对细胞内蛋白质、脂质和DNA 等大型生物分子的损伤,从而减缓氧化应激引起慢性疾病[8]。此外,多酚可以抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的活性[9]。研究表明,青稞在高寒和紫外线条件下,积累了丰富的多酚化合物,其不仅具有较好的体外抗氧化活性,而且可以有效抑制代谢综合征相关酶的活性[10]。

目前,关于云南省不同颜色青稞中多酚含量和生物活性的比较研究鲜见报道。为更加系统地比较研究云南省不同颜色青稞中的多酚化合物,本研究以4 种不同颜色青稞为试验原料,通过提取可溶性和不可溶键合多酚,对其进行多酚和黄酮含量测定,并使用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）进行多酚化合物组成分析；对青稞多酚提取液进行体外抗氧化活性和代谢综合征相关酶抑制活性测定,并研究其对H2O2 诱导HepG2 细胞氧化损伤的保护作用,以期为不同颜色青稞在功能食品中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝色、白色、紫色、黑色青稞：云南迪庆藏族自治州农业科学研究所；人类肝癌细胞系HepG2 细胞：中国科学院细胞库（上海）；没食子酸、原儿茶酸、（-）表没食子儿茶素、儿茶素、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、香草醛、儿茶素、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、牡荆素、邻香豆酸、鞣花酸、杨梅素、反式肉桂酸、槲皮素、山奈酚、芹菜素：北京北纳创联生物技术研究所；Folin-Ciocalteu 试剂：北京博奥拓达科技有限公司；甲醇、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、四甲基噻偶氮唑盐[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]、乙腈、甲酸、二氯荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFH2-DA）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridyl-s-triazine,TPTZ）、猪胰腺α-淀粉酶（8 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（28 U/mg）、胰蛋白酶消化液：美国Sigma 公司；2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2,2′-azinobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid） diammonium salt,ABTS]、H2O2：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；猪胰腺脂肪酶（3 万U/g）、对硝基苯酚（p-nitrophenol,p-NP）、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG）：上海源叶生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase,CAT）检测试剂盒、谷胱甘肽（glutathione,GSH）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde,MDA）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；高糖培养基（dulbecco′s modified eagle′s medium,DMEM）、青霉素-链霉素双抗溶液：白鲨生物科技有限公司；FeSO4、Na2CO3、NaNO2、HCl、AlCl3、NaOH：天津市风船化学试剂科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超声波清洗器（KQ-500B）：昆山市超声仪器有限公司；离心机（TGL20M）：湖南湘立科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（agilent1260）：安捷伦科技（德国）有限公司；冷冻干燥机（LGJ-12）：郑州南北仪器设备有限公司；旋转蒸发仪（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；紫外分光光度计（A360）：翱艺仪器（上海）有限公司；全自动荧光酶标仪（Synergy H1）：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 可溶性和不可溶键合多酚的提取

参考Wang 等[11]的方法并稍作修改。将青稞样品粉碎并过40 目筛,称取2 g 青稞样品,按料液比1∶10 （g/mL）加入提取液（甲醇∶甲酸∶水=80∶0.1∶19.9,体积比）,并在低温下超声辅助提取,持续1 h,在4 ℃下8 000 r/min 离心15 min,重复上述步骤2 次,合并上清液,即为青稞可溶性多酚提取液。

将提取后的青稞可溶性多酚样品残渣在室温下用40 mL 4 mol/L NaOH 在氮气下水解4 h。用6 mol/L HCl调节pH 值为2。在4 ℃下8 000 r/min 离心15 min后,上清液用等体积的乙酸乙酯∶乙醚（1∶1,体积比）提取3 次,然后通过旋转蒸发浓缩,获得青稞不可溶键合多酚提取液 。

1.3.2 多酚和黄酮含量的测定

参考Yang 等[3]的方法并稍作修改。通过Folin-Ciocalteu 法测定多酚含量。以阿魏酸（ferulic acid,FAE）为标准品制备标准曲线,标准曲线方程为y=1.289x-0.003（R2=0.998 8）。结果以μmol FAE/g 干重（dry weight,DW）表示。

参考Zhang 等 [12]的方法,根据AlCl3 比色法测定黄酮含量。以儿茶素（caredhieacid,CE）为标准品制备标准曲线,标准曲线方程为y=2.545 9x-0.011 43（R2=0.998）。结果以μmol CE/g DW 表示。

1.3.3 HPLC 分析

参照Li 等 [13]的方法进行多酚化合物组成分析。HPLC 操 作 条 件：Poroshell120EC-C18 柱（150 mm×4.6 mm,4 μm）,流速、柱温、检测波长和注射体积分别设定为0.8 mL/min、30 ℃、280 nm 和5 μL。流动相由甲醇（流动相A）和0.1%甲酸（流动相B）组成。梯度洗脱程序：0～7 min,15% A；7～20 min,20% A；20～30 min,30% A；30～35 min,65% A。根据多酚化合物标准品的液相色谱图的出峰时间进行定性,通过对比峰面积进行定量。

1.3.4 体外抗氧化能力的测定

1.3.4.1 DPPH 自由基清除能力测定

参考Yeo 等[14]的方法并略作改动,取适量青稞可溶性和不可溶键合多酚提取液,加入DPPH 甲醇溶液,在室温下避光反应10 min,在517 nm 波长下测定吸光度。利用阿魏酸绘制标准曲线,DPPH 自由基清除率计算公式如下。

式中：A0 为DPPH-甲醇溶液空白吸光度；A1 为样品溶液的吸光度；y 为DPPH 自由基清除率,%；x 为阿魏酸浓度,μmol/L。

以标准曲线方程计算DPPH 自由基清除能力,每克青稞干样品中的DPPH 自由基清除能力表示为阿魏酸当量,μmol FAE/g DW。

1.3.4.2 铁离子还原/抗氧化能力测定（ferric reducing antioxidant power,FRAP）

FRAP 的测定按照Li 等[15]的方法,取适量青稞可溶性和不可溶键合多酚提取液,加入FRAP 溶液,在37 ℃下避光反应4 min,在593 nm 波长下测定其吸光度。用FeSO4 标准液绘制标准曲线,FRAP 公式如下。

y = 6.24x + 0.000 5（R2 = 0.998 4）式中：y 为吸光度；x 为硫酸亚铁的浓度,mmol/L。以标准曲线方程计算铁离子还原/抗氧化能力,每克青稞干样品中铁离子还原能力/抗氧化能力表示为Fe2+当量, μmol FE/g DW。

1.3.4.3 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力的测定按照Hou 等[16]的方法并略作改动,取适量青稞可溶性和不可溶键合多酚提取液,加入ABTS 工作液,在室温下避光下反应6 min,于734 nm 下测定吸光度。利用Trolox 绘制标准曲线,总抗氧化能力计算公式如下。

式中：A0 为ABTS 工作液吸光度；A1 为样品溶液的吸光度；z 为ABTS+自由基清除率,%；x 为Trolox 浓度,mmol/L。

以标准曲线方程计算ABTS+自由基清除能力,每克青稞干样品中ABTS+自由基清除能力表示为Trolox当量,μmol TE/g DW。

1.3.4.4 过氧化氢清除能力测定

参照Wang 等[11]的方法进行测定并略作改动,取适量青稞可溶性和不可溶键合多酚提取液,加入H2O2溶液,再加入磷酸钠缓冲溶液,在30 ℃避光下反应40 min,在230 nm 波长处测定吸光度。用Trolox 绘制标准曲线,H2O2 清除率计算公式如下。

式中：A0 为H2O2 空白吸光度； A1 为样品溶液的吸光度；h 为H2O2 清除率,%；x 为Trolox 浓度,μmol/L。

以标准曲线方程计算H2O2清除能力,每克青稞干样品中H2O2清除能力表示为Trolox 当量,μmol TE/g DW。

1.3.5 代谢综合征相关酶抑制活性测定

将提取的青稞可溶性多酚提取液经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥,设置其浓度范围为0～1 000 μg/mL,用于代谢综合征相关酶抑制活性的测定。

1.3.5.1 α-淀粉酶抑制活性测定

参考Guo 等[17]的方法,并稍作修改。将0.5 mL 不同浓度（12.5～1 000.0 μg FAE/mL）的青稞可溶性多酚提取液与等体积的α-淀粉酶溶液（13 U/mL）混合,37 ℃孵育10 min。再加入0.5 mL 的1% 可溶性淀粉溶液,继续在相同的反应条件下再次孵育。随后,将1 mL 3,5-二硝基水杨酸 （3,5-dinitrosalicylic acid,DNS）试剂加入混合物中,并在沸水浴中保持5 min。反应完成后,用冰水快速冷却,测定540 nm 处吸光度,以阿卡波糖（1 mg/mL）作阳性对照。α-淀粉酶抑制率计算公式如下。

式中：Q 为α-淀粉酶抑制率,%；As 为样品+酶+底物+DNS 的吸光度；As′为样品+底物+DNS 的吸光度；Ac为缓冲溶液+酶+底物+DNS 的吸光度；Ac′为缓冲溶液+底物+DNS 的吸光度。

1.3.5.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

参照Fan 等[18]的方法,并略作修改。将0.5 mL 不同浓度（12.5～1 000.0 μg GAE/mL）的青稞可溶性多酚提取液和0.5 mL α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）在试管中混合,37 ℃下孵育10 min,然后加入0.5 mL 的p-NPG,继续37 ℃下孵育10 min。最后加入Na2CO3 溶液（2 mL,0.1 mol/L）终止反应。在405 nm 处测定吸光度。以阿卡波糖（1 mg/mL）作为α-葡萄糖苷酶的阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下。

式中：F 为α-葡萄糖苷酶抑制率,%；As 为样品+酶+p-NPG+Na2CO3 的 吸 光 度；As′为 样 品+p-NPG+Na2CO3 的吸光度；Ac 为缓冲溶液+酶+p-NPG+Na2CO3的吸光度；Ac′为缓冲溶液+p-NPG+DNS 的吸光度。

1.3.5.3 脂肪酶抑制活性测定

参照Li 等[19]的方法,并略有改进。将40 μL 磷酸盐缓冲液（pH6.9,0.1mol/L）转移到10 mL 试管中。取40 mL 不同浓度（12.5～1 000.0 μg GAE/mL）的青稞可溶性多酚提取液与等体积的脂肪酶溶液（2.5 mg/mL）混合,37 ℃下反应15 min。然后将20 μL 0.01 mol/L对硝基苯酚加入混合物中,并在37 ℃下再孵育15 min。最后,加入100 μL 无水乙醇终止反应。在405 nm 处记录吸光度。以奥利司他作为阳性对照。脂肪酶抑制率计算公式如下。

式中：Z 为脂肪酶抑制率,%；As 为样品+酶+底物+DNS 的吸光度；As′为样品+底物+DNS 的吸光度；Ac为缓冲溶液+酶+底物+DNS 的吸光度；Ac′为缓冲溶液+底物+DNS 的吸光度。

1.3.6 HepG2 肝癌细胞培养

HepG2 细胞接种在含有10% 胎牛血清（FBS）和1%双抗的DMEM 培养基中,37 ℃条件下,在含5%的CO2 培养箱中培养。当HepG2 细胞贴壁铺满率达到90%左右时,小心地倒出培养基,并用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L,pH 值为7.2～7.4）洗涤细胞2～3 次,用0.25% 胰蛋白酶消化,收集HepG2 细胞用于后续试验,试验组分为正常组、损伤组和多酚处理组。

1.3.7 MTT 法检测细胞存活率

用MTT 法进行细胞存活率测定。首先,将HepG2细胞（2×104/孔）接种在96 孔板中过夜培养,然后用青稞可溶性多酚提取液处理细胞24 h,紧接着用H2O2 处理6 h。孵育后,加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）,在37 ℃下孵育4 h。弃去上清液,然后加入100 mL DMSO,最后在517 nm 处,采用酶标仪测定吸光度。细胞存活率计算公式如下。

式中：H 为细胞存活率,%；A1 为样品组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.3.8 细胞内ROS 含量的测定

根据Zhu 等[20]的研究,采用DCFH-DA 荧光染料法并稍作修改测定活性氧（ROS）含量。将HepG2 细胞接种在96 孔板中（2×104/孔）培养24 h 后,加入青稞可溶性多酚提取液处理24 h,然后用800 mmol/L H2O2 再处理6 h。用10 mmol/L DCFH-DA 于37 ℃黑暗中培养30 min。在激发光波长（488 nm）和发射光波长（525 nm）下测定荧光强度。细胞内ROS 含量计算公式如下。

式中：R 为细胞内ROS 含量,%；A1 为样品组吸光度；A0 为空白组吸光度。

1.3.9 细胞内MDA、GSH 含量和CAT、SOD 活力的测定将HepG2 细胞接种在六孔板中（2×105/孔）,参考试剂盒说明书检测MDA、GSH 含量和CAT、SOD 活力。

1.4 统计分析

所有试验均重复3 次,结果以平均值±标准差表示；采用SPSS 22.0 进行单因素方差分析（one-factor analysis of variance,one-way ANOVA）并采用邓肯（Duncan′s multiple-range test）多重检验的方法对试验数据进行显著性差异分析,P<0.05 表示具有显著的统计学意义；采用GraphPad Prism 8.0 进行作图。采用Pearson 相关热图分析青稞可溶性多酚化合物含量与生物活性之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 青稞提取液多酚和黄酮含量

谷物中含有大量的多酚,具有较好的生物活性[21]。4 种青稞提取液的多酚和黄酮含量如表1 所示。

由表1 可知,在4 种青稞中,黑色青稞中可溶性多酚含量最高,为（15.92±0.42） μmol FAE/g DW,显著高于其他3 种青稞（P<0.05）,其次是紫色青稞,可溶性多酚含量为（13.08±0.20） μmol FAE/g DW；黑色青稞不可溶键合多酚含量最高为（14.00±0.81） μmol FAE/g DW,显著高于其他3 种青稞（P<0.05）,而其他颜色青稞不可 溶 键 合 多 酚 含 量 范 围 为（8.16±0.10）～（11.96±0.30） μmol FAE/g DW。

黄酮类化合物是植物中最重要的多酚化合物,具有多种生物活性[22]。在4 种颜色青稞中,黑色青稞中可溶性黄酮含量最高,为（0.63±0.03） μmol CE/g DW,显著高于其他3 种青稞（P<0.05）,紫色、白色和蓝色青稞可溶性黄酮含量间无显著性差异（P>0.05）；黑色青稞中不可溶键合黄酮含量最高,为（0.61±0.00） μmol CE/g DW,显著高于其他3 种青稞（P<0.05）。其他颜色青稞不可溶键合黄酮含量范围为（0.21±0.03）～（0.37±0.06） μmol CE/g DW。

结果表明,黑色青稞的可溶性和不可溶键合多酚及黄酮含量显著高于其他3 种青稞（P<0.05）。此外,4 种青稞中可溶性和不可溶键合多酚及黄酮含量有很大差异,可能是由于不同颜色青稞中多酚化合物种类和组成存在差异。

2.2 青稞多酚化合物组成分析

多酚化合物标品HPLC 见图1,不同颜色青稞中可溶性和不可溶键合多酚化合物组成见表2。

由表2 可知,在4 种青稞提取液中共检测出21 种多酚化合物,包括12 种酚酸和9 种黄酮类化合物。在4 种青稞可溶性多酚提取液中,蓝色青稞检测出11 种多酚化合物,含量最高的是香草酸；白色青稞检测出10 种多酚化合物,含量最高多酚的是杨梅素；紫色青稞检测出13 种多酚化合物,黑色青稞检测出9 种多酚化合物,紫色和黑色青稞含量最高多酚化合物均是（-）表没食子儿茶素。在4 种青稞不可溶键合多酚提取液中,白色青稞检测出6 种多酚化合物,含量最高的是儿茶素；蓝色青稞检测出10 种多酚化合物,紫色青稞检测出5 种多酚化合物,黑色青稞检测出18 种多酚化合物,黑、蓝、紫色青稞含量最高多酚化合物均是阿魏酸；此外,在4 种青稞中,黑色青稞检测出的可溶性多酚化合物种类最少,不可溶键合多酚化合物种类最多,分析原因可能是黑色青稞中的多酚化合物和细胞壁成分的结合能力较强。

2.3 青稞提取液体外抗氧化活性

4 种青稞可溶性和不可溶键合多酚的体外抗氧化活性如表3 所示。

由表3 可知,在4 种青稞中,黑色青稞可溶性和不可溶键合多酚提取液的DPPH 自由基清除能力、总抗氧化能力和过氧化氢清除能力均显著高于紫、蓝和白色青稞（P<0.05）,黑色青稞和紫色青稞的FRAP 均显著高于蓝、白色青稞（P<0.05）,并且黑色青稞和紫色青稞之间无显著性差异（P>0.05）。结果表明,黑色青稞表现出较好的体外抗氧化活性。

2.4 青稞多酚提取液对代谢综合征相关酶的抑制活性

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶可以催化二糖和寡糖底物转化为可吸收单糖、脂肪酶参与甘油三酯水解为游离脂肪酸和甘油[23]。因此,抑制这些酶的活性可以预防代谢综合征相关疾病。研究表明青稞多酚化合物是α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的天然有效的抑制剂[10]。不同颜色青稞多酚对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的抑制率见图2 和表4。

由图2 可知,4 种青稞可溶性多酚提取液对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的抑制活性以浓度依赖的方式增加,当4 种青稞多酚浓度为600.0 μg FAE/mL时,3 种关键消化酶的抑制率随浓度增加趋于平稳。IC50 值越低,说明其对关键消化酶的抑制作用越好。由表4 可知,4 种青稞可溶性多酚提取液对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的IC50 值均显著低于阳性对照（P<0.05）,表明4 种青稞可溶性多酚提取液的抑制活性优于阳性对照组。蓝色青稞可溶性多酚提取液对α-淀粉酶的抑制效果最好（IC50=55.59 μg FAE/mL）。此外,蓝色青稞（IC50=51.60 μg FAE/mL）和白色青稞（IC50=52.44 μg FAE/mL）可溶性多酚提取液对α-葡萄糖苷酶抑制活性显著高于紫色青稞（IC50=72.22 μg FAE/mL）和黑色青稞（IC50=77.16 μg FAE/mL）可溶性多酚提取液（P<0.05）,并且蓝色青稞与白色青稞间无显著性差异（P>0.05）。4 种青稞对脂肪酶抑制活性的强弱顺序依次是紫色青稞（IC50=67.14 μg FAE/mL）、黑色 青 稞（IC50=75.27 μg FAE/mL）、白 色 青 稞（IC50=81.66 μg FAE/mL）和蓝色青稞（IC50=83.2 μg FAE/mL）可溶性多酚提取液,表明4 种不同颜色青稞提取液均对3 种代谢综合征相关酶有较好的抑制作用。

2.5 青稞多酚提取液对HepG2 细胞存活率的影响

4 种青稞可溶性多酚提取液对HepG2 细胞存活率的影响如图3 所示。

当细胞存活率大于90%时,对应的多酚浓度被认为无毒。由图3 可知,蓝、白、紫和黑色青稞可溶性多酚提取液分别在5～50、5～25、1.25～10.00、1.25～5.00 μg/mL时无细胞毒性。因此,对蓝色和白色青稞选择多酚浓度分别为5、10、25 μg/mL,紫色和黑色青稞选择1.25、2.50、5.00 μg/mL 进行后续试验。

2.6 青稞多酚提取液对HepG2 细胞ROS 含量的影响

研究表明,过多的ROS 的产生可能会导致氧化应激。天然的多酚化合物可以降低ROS 的含量,从而减缓细胞内的氧化损伤[24]。H2O2 作为一种氧化剂,通常用于构建细胞的氧化应激损伤模型。青稞多酚提取液对H2O2 诱导的HepG2 细胞中ROS 含量的影响如图4所示。

由图4 可知,与正常组相比,损伤组中的ROS 含量显著升高（P<0.05）；与损伤组相比,经4 种青稞多酚提取液预处理后,细胞内ROS 含量均显著降低（P<0.05）,并且随着多酚浓度的增加呈剂量依赖性降低。结果表明,4 种青稞多酚提取液均可以降低H2O2 诱导HepG2 细胞中的ROS 含量,减少ROS 诱导的细胞氧化损伤。

2.7 青稞多酚提取液对HepG2 细胞MDA 含量的影响

MDA 是脂质过氧化的最终产物,是氧化应激的重要标志物。MDA 含量越高,表示细胞氧化损伤程度越深[25]。青稞多酚提取液对HepG2 细胞中MDA 含量的影响如图5 所示。

由图5 可知,与正常组相比,损伤组中的MDA 含量显著升高（P<0.05）；与损伤组相比,不同浓度的4 种青稞多酚提取液预处理后,细胞内MDA 含量均显著降低（P<0.05）。表明4 种青稞多酚提取液均对H2O2诱导HepG2 细胞氧化应激有较好的保护作用。

2.8 青稞多酚提取液对HepG2 细胞GSH 含量的影响

GSH 属于天然的抗氧化剂,可以保持细胞的氧化还原平衡,防止自由基和过氧化物对细胞造成的氧化损伤[26]。4 种青稞多酚对氧化损伤HepG2 细胞内GSH 含量的影响见图6。

由图6 可知,与正常组相比,损伤组中的GSH 含量显著降低（P<0.05）,表明损伤模型已成功构建。与损伤组相比,用25 μg/mL 蓝、白色青稞可溶性多酚提取液和5.00 μg/mL 紫、黑色青稞可溶性多酚提取液预处理均显著提高了细胞内GSH 含量（P<0.05）。4 种青稞多酚提取液均能以浓度依赖的方式增加细胞内GSH 含量。黑色青稞可溶性多酚提取液在较低浓度时对氧化损伤的HepG2 细胞可以起到较好的保护作用（P<0.05）。

2.9 青稞多酚提取液对HepG2 细胞CAT 活力的影响

CAT 可以将H2O2 催化为水和氧气,从而使细胞免于遭受H2O2 的氧化损伤[27]。 4 种青稞多酚对氧化损伤HepG2 细胞内CAT 活力的影响如图7 所示。

由图7 可知,与正常组相比,损伤组中的CAT 活力显著降低（P<0.05）,表示H2O2 处理可以导致HepG2细胞抗氧化能力下降；与损伤组相比,经25 μg/mL 蓝、白色青稞多酚提取液和5.00 μg/mL 紫、黑色青稞多酚提取液处理能显著提高细胞内CAT 活力（P<0.05）。当用不同浓度的青稞多酚提取液处理均能够以浓度依赖的方式显著增加细胞内CAT 的活力,说明4 种青稞多酚提取液均能对H2O2 诱导HepG2 细胞起到保护作用。紫色青稞可溶性多酚提取液在较低浓度时可以显著提高氧化损伤的HepG2 细胞中CAT 活力（P<0.05）。

2.10 青稞多酚提取液对HepG2 细胞SOD 活力的影响

SOD 是细胞内的一种酶促抗氧化剂,可以催化超氧化物阴离子转化为氧气和H2O2,保护细胞或机体免受氧化应激诱导的损伤[28]。4 种青稞多酚对HepG2 细胞SOD 活力的影响见图8。

如图8 所示,与正常组相比,H2O2 处理后SOD 活力显著降低（P<0.05）,表明细胞为缓解氧化应激消耗了大量的SOD。经4 种青稞多酚提取液处理后,与损伤组相比,25 μg/mL 蓝、白色青稞多酚提取液和5.00 μg/mL紫、黑色青稞多酚提取液处理均显著提高细胞内SOD活力（P<0.05）。当用不同浓度的青稞多酚提取液处理时,SOD 活力随浓度的增加而增加。

2.11 青稞可溶性多酚化合物含量与生物活性的相关性分析

青稞可溶性多酚化合物含量与生物活性的相关性分析如图9 所示。

由图9 可知,过氧化氢清除能力与山萘酚、槲皮素、阿魏酸含量呈显著（P<0.05）或极显著正相关（P<0.01）；FRAP、总抗氧化能力与儿茶素含量呈显著负相关（P<0.05）；α-葡萄糖苷酶抑制活性与（-）表没食子儿茶素、反式肉桂酸含量呈显著正相关（P<0.05）,与鞣花酸含量呈显著负相关（P<0.05）；GSH 含量与香草酸含量呈极显著负相关（P<0.01）；MDA 含量与芥子酸含量呈极显著负相关（P<0.01）；SOD 活力与芥子酸、对香豆酸含量呈显著正相关（P<0.05）,CAT 活力与表儿茶素呈显著负相关。表明山萘酚、槲皮素、阿魏酸是过氧化氢清除能力的主要贡献者；青稞多酚中（-）表没食子儿茶素、反式肉桂酸是抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要化合物；芥子酸、对香豆酸是SOD 活力的主要贡献者。

3 结论

本文通过研究云南4 种不同颜色青稞,发现黑色青稞多酚和黄酮含量均显著高于其他青稞（P<0.05）。在4 种青稞中,黑色青稞中检测出的可溶性多酚化合物种类最少,不可溶键合多酚化合物种类最多。此外,黑色青稞可溶性和不可溶键合多酚提取液的体外抗氧化活性最好。4 种青稞均对3 种代谢综合征相关酶具有较好的抑制效果。其中,蓝色青稞对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好,紫色青稞对脂肪酶的抑制效果最好。此外,在H2O2 诱导的氧化损伤模型中,4 种青稞可溶性多酚提取液在高浓度时均可显著逆转H2O2 引起的HepG2 细胞内的GSH 含量、CAT、SOD 活力的降低和ROS、MDA 含量的升高,从而缓解氧化应激对HepG2 细胞造成的氧化损伤。青稞可溶性多酚提取液中山萘酚、槲皮素、阿魏酸是过氧化氢清除能力的主要贡献者；青稞多酚中（-）表没食子儿茶素、反式肉桂酸是抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要化合物；芥子酸、对香豆酸是SOD 活力的主要贡献者。综上所述,不同颜色青稞中多酚含量及生物活性存在差异,可能与不同青稞中的多酚种类和组成存在一定的关系。本文为青稞在功能食品中的应用提供理论依据,也为其进一步开发利用提供新思路。

参考文献：

[1]王犇. 不同热处理对青稞酚类物质和风味物质的影响规律及机理探究[D]. 无锡: 江南大学, 2023.WANG Ben. Effects and mechanism of different thermal processing on phenolics and flavor substances of highland barley[D].Wuxi: Jiangnan University, 2023.

[2]杜艳, 李娟, 陈正行, 等. 不同品种青稞籽粒不同部位粉营养价值综合评价[J]. 中国粮油学报, 2021, 36(10): 50-56.DU Yan, LI Juan, CHEN Zhengxing, et al. Comprehensive evaluation of nutritional value of various parts of flour of different highland barley varieties[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2021, 36(10): 50-56.

[3]YANG X J, DANG B, FAN M T. Free and bound phenolic compound content and antioxidant activity of different cultivated blue highland barley varieties from the Qinghai-Tibet Plateau[J]. Molecules, 2018, 23(4): 879.

[4]DANG B, ZHANG W G, ZHANG J, et al. Evaluation of nutritional components, phenolic composition, and antioxidant capacity of highland barley with different grain colors on the Qinghai Tibet Plateau[J]. Foods, 2022, 11(14): 2025.

[5]邹青飞, 杨士花, 李永强, 等.体外结肠发酵对青稞膳食纤维中酚类化合物的含量及抗氧化活性的影响[J].食品科学, 2020, 41(2):94-100.ZOU Qingfei, YANG Shihua, LI Yongqiang, et al. Effects of in vitro colonic fermentation on phenolic content and antioxidant activity in dietary fiber from highland barley[J]. Food Science, 2020, 41(2): 94-100.

[6]雷娇, 邵起菊, 肖欣, 等.基于HPLC-ECD 测定鱼腥草叶多酚含量及抗氧化活性[J].食品工业科技, 2024, 45(4): 221-228.LEI Jiao, SHAO Qiju, XIAO Xin, et al. Determination of polyphenol content and antioxidant activity of Houttuynia cordata leaves using HPLC-ECD[J]. Science and Technology of Food Industry,2024, 45(4): 221-228.

[7]张娜, 刘丽, 李璐, 等.青胶蒲公英根多酚超声辅助提取工艺优化及其体外抗氧化、降糖活性[J]. 食品工业科技, 2024, 45(17):200-208.ZHANG Na, LIU Li, LI Lu, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polyphenols from Taraxacum kok-saghyz rodin roots and its antioxidant, hypoglycemic activity in vitro[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(17):200-208.

[8]PARK C L, KIM J H, JEON J S, et al. Protective effect of Alpinia oxyphylla fruit against tert-butyl hydroperoxide-induced toxicity in HepG2 cells via Nrf2 activation and free radical scavenging and its active molecules[J]. Antioxidants, 2022, 11(5): 1032.

[9]王倩, 王娟, 傅金凤, 等.青香蕉果肉多酚成分鉴定及其对淀粉酶、葡萄糖苷酶的抑制作用[J].食品科学, 2024, 45(7): 61-68.WANG Qian, WANG Jua, FU Jinfeng, et al. Identification of polyphenolic components in unripe banana and their inhibitory effects on amylase and glucosidase[J]. Food Science, 2024, 45(7): 61-68.

[10]DENG X F, CHEN B, LUO Q, et al. Hulless barley polyphenol extract inhibits adipogenesis in 3T3-L1 cells and obesity related-enzymes[J]. Frontiers in Nutrition, 2022, 9: 933068.

[11]WANG Y, LI Y Q, CHEN B, et al. UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis of phenolic compounds from the fruit of Cephalostachyum fuchsianum gamble and their antioxidant and cytoprotective activities[J].Molecules, 2022, 27(12): 3767.

[12]ZHANG J, GUO J L, DANG B, et al. Enhancement of polyphenols and antioxidant activity in germinated black highland barley by ultrasonication[J]. Molecules, 2023, 28(9): 3679.

[13]LI Q, YANG S H, LI Y Q, et al. Antioxidant activity of free and hydrolyzed phenolic compounds in soluble and insoluble dietary fibres derived from hulless barley[J]. LWT-Food Science and Technology, 2019, 111: 534-540.

[14]YEO J, SHAHIDI F. Identification and quantification of soluble and insoluble-bound phenolics in lentil hulls using HPLC-ESI-MS/MS and their antioxidant potential[J]. Food Chemistry, 2020, 315:126202.

[15]LI Q, YANG S H, LI Y Q, et al. Comparative evaluation of soluble and insoluble-bound phenolics and antioxidant activity of two Chinese mistletoes[J]. Molecules, 2018, 23(2): 359.

[16]HOU Y N, PENG S J, SONG Z L, et al. Oat polyphenol avenanthramide-2c confers protection from oxidative stress by regulating the Nrf2-ARE signaling pathway in PC12 cells[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2021, 706: 108857.

[17]GUO X M, LONG P P, MENG Q L, et al. An emerging strategy for evaluating the grades of Keemun black tea by combinatory liquid chromatography-orbitrap mass spectrometry-based untargeted metabolomics and inhibition effects on α-glucosidase and α-amylase[J]. Food Chemistry, 2018, 246: 74-81.

[18]FAN H Q, CHEN M S, DAI T T, et al. Phenolic compounds profile of Amomum tsaoko Crevost et Lemaire and their antioxidant and hypoglycemic potential[J]. Food Bioscience, 2023, 52: 102508.

[19]LI X P, CHEN Y, LI S Y, et al. Oligomer procyanidins from Lotus seedpod regulate lipid homeostasis partially by modifying fat emulsification and digestion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(16): 4524-4534.

[20]ZHU W R, TANG H, LI J C, et al. Ellagic acid attenuates interleukin-1β-induced oxidative stress and exerts protective effects on chondrocytes through the Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)/nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) pathway[J]. Bioengineered, 2022, 13(4): 9233-9247.

[21]PONTIERI P, TROISI J, CALCAGNILE M, et al. Chemical composition, fatty acid and mineral content of food-grade white, red and black Sorghum varieties grown in the Mediterranean environment[J]. Foods, 2022, 11(3): 436.

[22]ARORA S, ITANKAR P. Extraction, isolation and identification of flavonoid from Chenopodium album aerial parts[J]. Journal of Traditional and Complementary Medicine, 2018, 8(4): 476-482.

[23]YAO Y J, WANG H L, XU F R, et al. Insoluble-bound polyphenols of adlay seed ameliorate H2O2-induced oxidative stress in HepG2 cells via Nrf2 signalling[J]. Food Chemistry, 2020, 325: 126865.

[24]DI SOTTO A, LOCATELLI M, MACONE A, et al. Hypoglycemic,antiglycation, and cytoprotective properties of a phenol-rich extract from waste peel of Punica granatum L. var. dente di cavallo DC2[J]. Molecules, 2019, 24(17): 3103.

[25]LI T, YANG C Y, CAO H K, et al. The effect of bergenin on isonicotinic acid hydrazide and rifampicin-induced liver injury revealed by RNA sequencing[J]. Molecules, 2023, 28(14): 5496.

[26]刘先皓, 杨明静, 陈壁, 等. 东紫苏多酚提取物对HepG2 细胞氧化损伤的保护作用研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2021, 12(24): 9499-9506.LIU Xianhao, YANG Mingjing, CHEN Bi, et al. Study on the protective effect of polyphenol extract from Elsholtzia bodinieri Vaniot against oxidative damage of HepG2 Cells[J]. Journal of Food Safety& Quality, 2021, 12(24): 9499-9506.

[27]MA Z M, GAO X Z, RAZA F, et al. Design of GSH-responsive curcumin nanomicelles for oesophageal cancer therapy[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(9): 1802.

[28]KYRIAKAKI P, MAVROMMATIS A, TSIPLAKOU E. Schizochytrium spp. dietary supplementation modulates immune-oxidative transcriptional signatures in monocytes and neutrophils of dairy goats[J]. Antioxidants, 2023, 12(2): 497.

Comparative Study of Polyphenol Content and Biological Activity of Colorful Hulless Barley in
Yunnan Province

ZAO Xingru1,LUO Qin2,HUANG Yonghua3,WANG Hu1,REN Nannan1,LI Yongqiang1 *
（1. College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,Yunnan,China；2. College of Agriculture and Food Engineering,Baise University,Baise 533099,Guangxi,China；3. College of Tea（Pu′er）,West Yunnan University of Applied Sciences,Pu′er 665099,Yunnan,China）

Abstract： A comparative study was conducted to investigate the polyphenol content and biological activity of colorful （blue,white,purple,and black） hulless barley in Yunnan Province. The soluble and insoluble bound polyphenols were extracted from hulless barley,and the contents of polyphenols and flavonoids were determined. The composition of phenolic compounds was analyzed by using high-performance liquid chromatography（HPLC）. In addition,the in vitro antioxidant activity and metabolic syndrome-related enzyme inhibitory activity of polyphenol extracts of hulless barley were measured,and its protective effect on H2O2-induced oxidative damage in HepG2 cells was discussed. The results showed that black hulless barley had significantly higher contents of polyphenols and flavonoids compared to other hulless barley （P<0.05）. There were large differences in the composition of phenolic compounds among the four hulless barley. Black barley had the least types of phenolic compounds in soluble polyphenols （9 types） and the most types of phenolic compounds in insoluble bound polyphenols （18 types）. Furthermore,the soluble and insoluble bound polyphenols in black hulless barley exhibited significantly higher DPPH radical scavenging activity,hydrogen peroxide scavenging activity,and trolox equivalent antioxidant capacity compared to blue,white,and purple hulless barley （P<0.05）.However,there was no significant difference in the ferric reducing antioxidant power （FRAP） between black hulless barley and purple hulless barley （P>0.05）. Among the four types of polyphenol extracts of hulless barley,blue hulless barley showed the best inhibitory effect on α-amylaseand α-glucosidase,while purple hulless barley had the best inhibitory effect on lipase. Additionally,the polyphenol extracts of all four types of hulless barley significantly reduced the production of reactive oxygen species （ROS） and malondialdehyde （MDA） induced by H2O2 in HepG2 cells at high concentrations and increased the content of glutathione （GSH） and catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD） activity （P<0.05）.

Key words： hulless barley；polyphenol extracts；composition of phenolic compounds；antioxidant activity；metabolic syndrome-related enzyme inhibitory activity

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2025.08.001

基金项目：国家自然科学基金项目（32360590）；云南省科技厅科技计划项目（202301BD070001-062）

作者简介：早杏如（1998—）,女（汉）,硕士研究生,研究方向：食品科学。

*通信作者：李永强（1975—）,男（汉）,教授,博士,研究方向：功能食品与天然产物化学。

引文格式：

早杏如，骆琴，黄勇桦，等. 云南省不同颜色青稞中多酚含量及生物活性比较[J]. 食品研究与开发，2025，46（8）：1-13.

ZAO Xingru，LUO Qin，HUANG Yonghua，et al. Comparative Study of Polyphenol Content and Biological Activity of Colorful Hulless Barley in Yunnan Province[J]. Food Research and Development，2025，46（8）：1-13.

责任编辑：张璐

收稿日期：2024-02-06