普鲁兰酶（pullulanase，EC.3.2.1.41）是一种能够特异性水解α-1，6-糖苷键的淀粉脱支酶，支链淀粉占淀粉总量的75%～85%，其中含有4%～5% 的α-l，6-糖苷键，该酶可以显著提高淀粉的利用率[1]。目前普鲁兰酶的开发和生产主要来源于国外公司，国内大多依赖进口，酶的种类较少[2]。近年来，生物酶法制备多孔淀粉受到关注。然而，生物酶法的酶解时间过长，且不同种类的淀粉对酶具有选择性。将酶法与超声波、微波法相结合还可以增加淀粉孔隙，缩短酶解时间[3]。多孔淀粉安全、无毒、绿色环保，可用于食品添加剂、香精、益生菌、抗氧化剂和药物的载体，也可用于吸附重金属、污水处理、消除异味等[4]。
海洋是具有高盐、高压、低温等的生态环境，海洋微生物酶与陆源微生物酶的性质存在较大差异[5]。Wallenfels 等[6]首次从Aerobacter aerogene 中发现了普鲁兰酶。Saha 等[7]从温泉中分离得到了嗜热厌氧菌（Thermoaoaero bacter sp. B6A），其产生耐热、耐酸的普鲁兰酶，最适作用温度和pH 值分别为75 ℃和5.0。Rüdiger 等[8]分离到一株产普鲁兰酶的伍氏火球菌（Pyrococcus woesei），酶最适作用温度和pH 值分别为100 ℃和6.0。普鲁兰酶是进一步提高淀粉利用率的关键酶之一，从海泥样品中筛选产酶微生物是挖掘具有新颖性质普鲁兰酶的重要手段[9]。
本研究从海泥样品中筛选产普鲁兰酶菌株，对其进行鉴定，并对菌株的生长特性、产酶特性和酶的性质进行研究。通过将酶解法与超声波辅助法相结合对不同种类淀粉进行水解，以期为酶法制备玉米多孔淀粉提供新的方法参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 样品与试剂
海泥样品：产自山东青岛；红色普鲁兰多糖（生化试剂）：爱尔兰Megazyme 公司；细菌基因组提取试剂盒（50 次）：天根生化科技（北京）有限公司；通用引物27F、1492R：北京索莱宝科技有限公司；酵母浸膏（分析纯）：宜兴市江山生物制剂有限公司；鱼粉蛋白胨、氯化钠、大豆蛋白胨（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；戊二醛（分析纯）：濮阳盛华德化工有限公司；琼脂（生化试剂）：厦门市赫凯生物科技有限公司；普鲁兰多糖（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；氯化锌（分析纯）：沈阳市试剂五厂；氯化钡（分析纯）：天津渤海化工集团有限责任公司；氯化铵（分析纯）：湖南江海环保实业有限公司；氯化钠（分析纯）：河北唐山市腾展商贸有限公司；氯化锰（分析纯）：湖北兴恒业科技有限公司；氯化钾（分析纯）：藏格矿业股份有限公司；氯化镁、氯化钙（均为分析纯）：山东海徽化工有限公司；氯化亚铁、六水氯化镍、二氯化铜（均为分析纯）：易金稀有金属制品有限公司；玉米淀粉（食品级）：佛山市海天调味食品有限公司；小麦淀粉、马铃薯淀粉（均为食品级）：京山杰祥食品有限公司；绿豆淀粉（食品级）：新乡良润全谷物食品有限公司；红薯淀粉（食品级）：阜阳市福旺食品股份有限公司。
1.1.2 培养基
LB 液体培养基：0.5%酵母浸膏，1%鱼粉蛋白胨，1% NaCl，pH7.0， 装液量20%。
筛选培养基：0.5% 酵母浸膏，1% 鱼粉蛋白胨，1% NaCl，0.1% 红色普鲁兰多糖，2% 琼脂，陈海水配制，pH7.0。
产酶培养基：0.1% 酵母浸膏，0.5% 鱼粉蛋白胨，1%普鲁兰多糖，陈海水配制，pH7.0。
普鲁兰酶酶活力测定平板：0.1% 红色普鲁兰多糖，1.5%琼脂，浓度为0.1 mol/L、pH 值为7.0 的磷酸盐缓冲液。
1.1.3 仪器与设备
生化培养箱（SPX-250B-Z）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温摇床（Innova 44R）、酶标仪（Multiskan Go）、高速冷冻离心机（Multifuge X3R）、扫描电子显微镜（Axia ChemiSEM）：美国Thermo 公司；冷冻干燥机（Freezone6 Plus）：美国Labconco 公司；聚合酶链式反应仪（T100TM Thermal Cycler）：美国BIO RAD 公司；无菌超净台（SW-CJ-JCU）：苏州净化设备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 产普鲁兰酶菌株的筛选与鉴定
海泥样品按10 倍梯度稀释，选10-3～10-5 梯度涂布于筛选培养基， 30 ℃培养24 h， 挑取有透明圈的菌落在筛选培养基上三区划线纯化，纯化菌株在斜面保藏。
菌株的形态学观察：取菌涂布于盖玻片， 戊二醛、磷酸盐缓冲液固定， 不同浓度乙醇脱水处理， 干燥后喷金， 用扫描电子显微镜观察[10]。
分子生物学鉴定：细菌基因组提取，选用原核微生物通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTACGACTT-3′）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR 扩增体系为50 μL（基因为模板 1 μL、PCR Mix 25 μL、27F 2 μL、1492R 2 μL、MgCl2 2 μL、dd H2O 17μL），扩增条件：94 ℃变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保藏[11]。PCR 产物送上海生工生物工程公司测序。将测序结果提交美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库比对，用MEGA7.0软件通过邻接（neighbor-joining）法构建系统发育树。
1.2.2 菌株的生长特性测定
基础培养基为LB 液体培养基，分别以麸皮、葡萄糖、乳糖、糊精、蔗糖、木薯、马铃薯、可溶性淀粉、麦芽糖替代原酵母浸膏为碳源；2%接种量、180 r/min、40 ℃培养24 h，测定菌悬液吸光度值（OD600 nm）。选用最适碳源，再分别以大豆蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、酵母浸膏、尿素、干酪素替代鱼粉蛋白胨为氮源，在初始pH值为 4.0～9.0 和培养温度为 30～50 ℃条件下，研究以上因素对菌株生长的影响。
1.2.3 菌株产酶条件研究
在产酶培养基的基础上，研究添加量为0.1%的不同碳源（葡萄糖、乳糖、糊精、蔗糖、麸皮、木薯、马铃薯、酵母浸膏、可溶性淀粉、麦芽糖），在接种量2%，装液量为20%，转速180 r/min、温度30 ℃培养48 h 的条件下对菌株发酵产酶的影响。取培养液12 000×g 离心5 min，检测上清液中普鲁兰酶的活力。然后，研究不同氮源（大豆蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、酵母浸膏、鱼粉蛋白胨、尿素、干酪素、豆粕）（添加量为0.5%），不同温度培养条件（30～50 ℃）和不同初始pH 值（4.0～9.0）对菌株发酵产酶的影响。
1.2.4 普鲁兰酶酶活力的测定方法
采用牛津杯法[12]测定。将牛津杯放置在酶活测定平板上，加入100 μL 酶液，放置恒温培养箱保温12 h，检测透明圈直径，计算相对酶活（M，%），其计算公式如下。
式中：d 为任意一组透明圈直径平均值，mm；D 为透明圈直径平均值的最大值，mm。
1.2.5 酶学性质
普鲁兰酶的最适温度和热稳定性：将酶液置于不同温度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）下测定酶活力。将酶液分别放置在35、40、45、50 ℃分别保温1、3、5 h后，测定相对酶活，比较酶的热稳定性。
普鲁兰酶的最适pH 值和pH 值稳定性：将普鲁兰酶液分别放置在不同pH 值（乙酸-乙酸钠缓冲液5.0～6.0；磷酸盐缓冲液6.0～8.0；Tris-HCl 缓冲液8.0～9.0）缓冲液配制的平板上，35 ℃条件下测定酶活力。酶液分别在35 ℃、pH5.0～9.0 条件下保温1 h 后测定酶的稳定性，测定相对酶活，比较酶的pH 值稳定性。
金属离子对普鲁兰酶活力的影响：将Zn2+、Ba2+、NH4+、Na+、Mn2+、K+、Mg2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Ca2+等离子盐以1 mmol/L 和5 mmol/L 终浓度添加到固体平板中，在35 ℃保温12 h，测定相对酶活。
1.2.6 多孔淀粉的制备
取玉米、小麦、红薯、绿豆、马铃薯淀粉各2 g 后加入pH6.0、0.1 mol/L 磷酸盐酸缓冲溶液25 mL，超声处理30 min 后加入20 mL 酶液，30 ℃下酶解24 h。加入95%乙醇终止反应，4 000×g 离心5 min，弃去上清液，冷冻干燥[13]，研磨后室温密封保藏备用。
1.2.7 淀粉颗粒观察
将导电胶涂在样品台上，在导电胶中加入适量的样品粉末，并用氮气吹掉多余的样品粉末，使样品均匀地分布在导电胶表面，通过扫描电子显微镜观察淀粉颗粒形态[14]。
1.3 数据处理与统计分析
所有试验均设置3 组平行；数据结果用SPSS 26.0软件计算并进行显著性分析；柱状图、折线图均采用Origin 2018 软件进行制作；琼脂糖凝胶图使用Image Lab 图像软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选与鉴定
2.1.1 菌株形态学观察
菌株的形态学特征见图1。
图1 菌株A2 的形态
Fig.1 Morphology of strain A2
A.菌落形态； B.革兰氏染色形态扫描电子显微镜图。
经过多轮筛选，共得到6 株产透明圈菌株，编号分别为A2、A3、A4、A5、A6、A7。由图1A 可知，菌株A2产普鲁兰酶的活力最高，该菌菌落为淡黄色，黏稠，边缘整齐，表面平整中央微凸起；由图1B 可知，该菌株为革兰氏阳性杆菌。
2.1.2 菌株A2 的分子生物学鉴定
菌株A2 的PCR 扩增结果与进化树见图2。
图2 菌株A2 的PCR 扩增结果电泳与进化树
Fig.2 PCR amplification result and phylogenetic tree of strain A2
A.PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；B. 菌株A2 的16S rDNA 系统进化树。M. DNA Marker；2. 菌株A2 的16S rDNA 基因。
由图2A 可知，菌株A2 的16S rDNA 序列PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，其16S rDNA 碱基长度为1 465 bp；由图2B 可知，菌株A2 序列在NCBI 上BLAST 分析后，其16S rDNA 与Bacillus nitratireducens 的同源性为100%，综合形态特征，鉴定菌株A2 为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
2.2 菌株A2 的生长特性
不同碳源、氮源、温度和初始pH 值对菌株A2 生长的影响结果见图3。
图3 碳源、氮源、温度和初始pH 值对菌株A2 生长的影响
Fig.3 Effects of carbon source， nitrogen source， temperature， and initial pH on the growth of strain A2
A.碳源；B.氮源；C.温度；D.初始pH 值。不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图3A 可知，菌株A2 在多种碳源中均生长良好，其中酵母浸膏最佳，木薯和可溶性淀粉次之；由图3B 可知，菌株A2 在几种不同氮源中均能生长，其中大豆蛋白胨为最适氮源；由图3C 可知，菌株A2 在30～50 ℃均能生长，其最适生长温度为40 ℃；由图3D 可知，菌株A2 在初始pH4.0～9.0 条件下均能生长，其中pH7.0 条件下生长效果最佳。
2.3 菌株A2 的产普鲁兰酶条件
不同碳源、氮源、温度和初始pH 值对菌株A2 产酶的影响结果见图4。
图4 碳源、氮源、温度和初始pH 值对菌株A2 产酶的影响
Fig.4 Effects of carbon source， nitrogen source， temperature，and initial pH on the enzyme production of strain A2
A.碳源； B.氮源； C.温度；D.初始pH 值。不同小写字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
由图4A、图4B 可知，菌株A2 在多种不同碳氮源作用下均可产酶，其中，最适碳源为蔗糖，最适氮源为大豆蛋白胨。由图4C、图4D 可知，其最适产酶温度和初始pH 值分别为45 ℃和7.0。朱金峰等[15]研究表明从浓香型烤烟根际土壤中分离到的陆源产普鲁兰酶菌株产酶温度为35 ℃，多数海洋微生物的培养温度较低；王藏等[16]报道的产磷脂酶B 海洋细菌产酶温度为25 ℃；王芳芳等[10]从海洋分离得到的产右旋糖酐酶菌株产酶温度为25 ℃；李驰等[17]从龙须菜表面筛选得到的产琼胶酶海洋细菌产酶温度为25 ℃。菌株A2 是从海泥中筛选的微生物，最适产酶温度较高，推测与海泥样品取自潮间带、夏季落潮海泥在阳光下温度高有关。目前，鲜见从海洋样品中筛选到产普鲁兰酶的芽孢杆菌的相关文献报道。
2.4 普鲁兰酶的酶学性质
温度和pH 值对普鲁兰酶活力的影响结果见图5。
图5 温度和pH 值对普鲁兰酶活力的影响
Fig.5 Effects of temperature and pH on pullulanase activity
A.温度；B.热稳定性；C. pH 值； D. pH 值稳定性。
由图5A 可知，该酶最适作用温度为35 ℃，在20～50 ℃之间，可以保持70%以上的相对酶活；由图5B 可知，该酶在35 ℃保温5 h，仍然保留95% 以上的相对酶活，在40～50 ℃保温5 h 仍有90%以上的相对酶活；由图5C 可知，该酶在初始pH5.0～9.0 的条件下均可检测到酶活，其最适pH 值为 6.0；由图5D 可知，该酶在pH5.0～9.0 缓冲液中保存1 h 后，酶活仍然保持稳定。
目前相关研究报道的普鲁兰酶最适作用温度普遍较高。来自极端环境的古细菌普鲁兰酶最适作用温度达到105 ℃[18]，Bukhari 等[19]从土壤中分离筛选得到产普鲁兰酶细菌的最适作用温度为75 ℃，其酶的活性在90 ℃时也保持稳定，但在100 ℃时其活性降低了10%；Yang 等[20]在大肠杆菌中表达的重组FN-普鲁兰酶在最适作用温度80 ℃；高兆建等[21] 、常帆等[22]报道的普鲁兰酶最适温度均为60 ℃；严芬等[11]从闽江入海口海泥中筛选到的菌株，所产普鲁兰酶的最适温度为50 ℃；Rajaei 等[23]从嗜冷性Exiguobacterium sp. SH3 中克隆普鲁兰酶，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达的重组酶在45 ℃下具有最大活性；Wei 等[24]从菌株Paenibacillus polymyxa Nws-pp2 中获得的普鲁兰酶基因，在大肠杆菌中表达得到重组普鲁兰酶，最适作用温度为35 ℃。菌株A2 产普鲁兰酶最适温度为35 ℃，相对作用温度较低，可以在相对较低作用温度下水解支链淀粉的α-1，6-糖苷键，具有低温下实用性高的特性。
不同金属离子对普鲁兰酶活性的影响见表1。
表1 金属离子对普鲁兰酶活性的影响
Table 1 Effects of metal ions on pullulanase activity
金属离子空白Zn2+Ba2+NH4+Na+Mn2+K+Mg2+Fe2+Ni2+Cu2+Ca2+相对酶活/%1 mmol/L 100.00±6.84 102.99±4.48 110.45±5.17 110.45±5.17 100.00±6.84 97.01±2.59 104.48±6.84 105.97±2.59 95.52±2.59 94.03±4.48 104.48±2.59 102.99±4.48 5 mmol/L 100.00±3.14 91.11±3.13 95.56±3.14 113.33±9.43 111.11±6.29 95.56±3.14 100.00±3.14 108.89±3.14 100.00±3.14 95.56±3.14 91.11±3.14 95.56±3.14
由表1 可知，1 mmol/L Ba2+、NH4+、Zn2+、K+、Mg2+、Cu2+和Ca2+可以提高酶活，其他离子对酶活的影响较小。5 mmol/L NH4+、Na+和Mg2+均能不同程度提高酶活，其他离子条件下，酶活均能保持90% 以上。该结果与高兆建等[25]报道的Ba2+、Zn2+和K+的促进结果相似。
2.5 酶解淀粉的扫描电子显微镜检测
天然淀粉与普鲁兰酶处理后淀粉颗粒的结果见图6。
图6 天然淀粉与普鲁兰酶处理后淀粉颗粒扫描电子显微镜图（×6 000）
Fig.6 SEM images of natural starch and pullulanase-treated starch （×6 000）
A.天然玉米淀粉；B.酶解后玉米淀粉；C.天然小麦淀粉；D.酶解后小麦淀粉；E.天然马铃薯淀粉；F.酶解后马铃薯淀粉；G.天然绿豆淀粉；H.酶解后绿豆淀粉；I.天然红薯淀粉；J.酶解后红薯淀粉。
由图6 可知，未经处理的天然淀粉为球形或椭圆形颗粒，表面光滑，微孔极少。经酶解后，玉米淀粉颗粒表面布满蜂窝状小孔，有一定的深度。在小麦、马铃薯、绿豆、红薯淀粉颗粒表面则形成了不规则的碎片，改变了淀粉表面的形貌。淀粉颗粒表面多孔，甚至形成空腔，有利于增大其比表面积，提高淀粉颗粒的吸附能力。酶法制备多孔淀粉多为复合酶，如Zhang 等[26]用淀粉葡萄糖苷酶和α-淀粉酶复合制备玉米多孔淀粉，本研究使用超声辅助酶法制备玉米多孔淀粉。超声处理可以促进酶的水解作用。超声波设备简单且操作方便，可以缩短制备多孔淀粉的时间。本研究与Li等[27]通过超声辅助酶法水解制备枇杷仁多孔淀粉的结果相似。用单一的普鲁兰酶制备玉米多孔淀粉的相关报道鲜见，制备条件及该玉米多孔淀粉的特性需进一步研究。
3 结论
本研究从山东青岛海泥样品中筛选了产普鲁兰酶的菌株A2，经鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。该菌生长的最佳碳源、氮源、温度和pH 值分别为酵母浸膏、大豆蛋白胨、40 ℃和7.0。其产酶所需的最佳碳源、氮源、温度和初始pH 值分别为蔗糖、大豆蛋白胨、45 ℃和7.0，该酶的最适温度和初始pH 值分别为35 ℃和6.0，在35～50 ℃、pH5.0～9.0 范围内稳定性好，1 mmol/L 和5 mmol/L 金属离子对该酶的活性影响较小。30 ℃下酶解24 h 条件下分别水解玉米、小麦、马铃薯、绿豆和红薯淀粉，均可以改变淀粉颗粒表面的形貌。其中，在玉米淀粉表面可以形成均匀的多孔形态，因此该酶具有制备玉米多孔淀粉的应用前景。
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