禽蛋因其味道鲜美、营养丰富而广受消费者青睐，是功能性食品的主要来源之一，可以为人体补充丰富的蛋白质、脂肪、矿物质和维生素等营养物质[1]。目前我国蛋类消耗量日益剧增，人均消费量为世界第一。2023 年禽蛋产量3 563 万t，较去年增长3.1%，因此需进一步关注其食品安全[2]。氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones， FQs）对多种细菌具有广谱的抗菌活性，对一些引起家禽呼吸道、肠道及泌尿道感染的病原菌有着良好的抗菌效果。FQs 通常能够通过饲喂给药，对于饲养者来说较为方便[3-4]。通过有效控制和治疗感染，FQs药物有助于减少因疾病引起的死亡率，提高家禽的生长率和生产效益[5]。然而，在家禽饲养的过程中过量使用会导致家禽的肉以及蛋中残留过量的氟喹诺酮药物，食用后会引发人体一些不适症状[6]。另一方面药物残留可能通过粪便等途径排放到环境中，污染水源和土壤，对周围环境和生态系统造成潜在威胁[7-8]。通过准确检测禽蛋中的氟喹诺酮类药物残留，可以确保禽蛋食品安全，降低对人体健康的负面影响，并使食品生产商和加工商能够识别确定潜在的药物污染源，采取适当措施防止污染[9]。因此，建立一种简单快捷、准确高效的FQs 检测方法对禽蛋食品安全有积极作用。
检测禽蛋中FQs 药物残留的方法包括微生物法[10]、荧光免疫法[11]和传感器法等[12-13]。然而，这些方法往往存在试剂消耗大、样品处理难且时间长等缺点，不能满足市场需求[14]。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 法以其灵敏度高、选择性好、准确度高等优点在FQs 检测中得到了广泛的应用[15]。HPLC 能够分辨和分离样品中的复杂成分，有助于准确测定氟喹诺酮药物的含量，避免干扰物质的影响，适用于禽蛋及食品样品的检测[16-17]。而且HPLC 方法可以根据需要进行调整，以适应不同种类FQs 的检测[17]。喹诺酮类药物是一种有效的抗菌药物，其基本化学结构为双环。C-6 位的氟原子和喹诺酮基础结构上的各种置换产生了氟喹诺酮类药物，即诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和许多其他药物[18]。FQs 结构相似但极性不同，可在磷酸水溶液中加入乙腈使其分离。C18 柱是一种十八烷基硅烷键合硅胶填料，出峰的顺序是由被检测物质分子的极性大小决定的，化合物中疏水性较强的化合物更牢固地保留在C18 色谱柱上，高极性的分子往往会被先洗脱出来[19-20]。相对于其他类型色谱柱而言，C18 反向色谱柱具有分离时间短、分离度高等特性。王成真等[21]将样品经低浓度乙腈结合加热促使蛋白质快速沉淀，正己烷脱脂，分离清液后通过高效液相色谱仪使用C18反向色谱柱分析，建立了HPLC 快速检测鸡蛋中5 种氟喹诺酮类药物的方法，检测效果突出，故本次试验选用C18 反向色谱柱。在禽蛋样品的制备净化步骤中，根据不同的样品类型，使用不同吸附剂的固相萃取小柱进行去除杂质[22]。目前常用于检测氟喹诺酮的固相萃取柱有HLB 柱[23]、C18 固相萃取柱[24]和聚苯乙烯-二乙烯基苯（primary and secondary amines，PSA）小柱[25]。在这些吸附剂中，最常用的是PSA，其主要是用来除去样品中的脂肪酸、色素、糖类和离子脂质等成分。C18纯化含有大量脂肪样品的效果则非常好[26]。HLB 柱可耐受pH 值范围大，兼容大多数溶剂，由于材料亲水和亲脂平衡特性使其可保留多种具有不同极性、不同油水分布系数的化合物。
本研究以市场上售卖的鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋为对象，根据农业部781 号公告-6-2006 《鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定高效液相色谱法》，在样品净化、色谱条件、固相萃取等方面进行验证及优化。以期为提高禽蛋中的FQs 药物残留检测效率以及检测灵敏度提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋：市售；甲醇、乙腈、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、正己烷、三乙胺（均为色谱纯）、磷酸（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司；恩诺沙星（enrofloxacin，ENR，99.5%）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL，97%）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR，95%）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP，95%）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM，97%）、氟罗沙星（fleroxacin，FLE，99.5%）、麻保沙星（marbofloxacin，MAR，97%）：上海西格玛奥德里奇公司。
1.2 仪器
CT15RE 台式微量高速离心机：日立工机株式会社；STARTER 2100/3C pH 计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；Arc HPLC 系统配可变波长紫外检测器、XTerra MS C18 色谱柱（4.6 cm×250 mm，5 μm）、C18 萃取小柱（200 mg/3 mL）、HLB 小柱（200 mg/6 mL）：沃特斯科技（中国）有限公司；PSA 小柱（250 mg/6 mL）：常德比克曼生物科技有限公司；XU-SPE-12 多通道固相萃取仪：绍兴析牛仪器科技有限公司；SN-HP-02 无油隔膜真空泵：上海尚普仪器设备有限公司。
1.3 样品制备及前处理
称取蛋液匀浆2.0 g 于50 mL 离心管，加入提取液磷酸盐缓冲液（1%磷酸氢二钠+0.1%磷酸二氢钠水溶液）8.0 mL，在 8 000 r/min 的条件下离心30 min。离心完毕后，用一次性注射器吸取上清液立即转入另一离心管中，弃去下面沉淀物。再用提取液磷酸盐缓冲液4.0 mL 重复提取1 次，再吸取上清液，搅匀，振荡并以8 000 r/min 离心10 min。然后用10 mL 的水饱和正己烷对两次合并的上清液再进行除脂，振荡，8 000 r/min离心10 min，用注射器将上层正己烷弃置，絮凝状固体仔细吸净弃去，在下层溶液中再次加入水饱和正己烷10 mL，振荡，8 000 r/min 离心10 min。同样，再弃去上层正己烷，下层为备用液。
将C18 萃取小柱和HLB 小柱、PSA 小柱固定在多通道固相萃取仪并依次用乙腈5 mL、乙腈（30%） -缓冲液5 mL 和磷酸盐缓冲液5 mL 润洗过柱，取备用液全部过柱，再用水5 mL 过柱冲洗。加1 mL 0.3% 磷酸+5%乙腈水溶液洗脱过柱，收集洗脱液作为试样溶液，供高效液相色谱测定，外标法定量。
1.4 色谱条件
使用的色谱柱为XTerra MS C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm），采用Arc HPLC 系统配可变波长紫外检测器，其波长设置为278 nm。流动相A：0.3% 磷酸+5% 乙腈水溶液 （pH 值为4.0±0.1）。流动相B：甲醇。洗脱方案见表1。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure
时间/min 053 0磷酸乙腈水溶液体积分数/%85 85～60 60～85甲醇体积分数/%15 15～40 40～15
1.5 标准曲线、线性范围和检测限的测定
取10 mg 氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星、洛美沙星、麻保沙星7 种标准品，配制成浓度1 mg/mL 的储备液。然后将其分别用流动相A稀释成浓度为20、50、100、500、1 000、2 000 μg/kg 的标准品溶液，供液相分析，以峰面积-标准品浓度作图，得到标准曲线回归方程。将测定的样品进样分析，信噪比为3 时的浓度视为检测限（limit of detection，LOD）。
1.6 回收率试验
选择鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋作为空白基质样品，分别添加10、50 μg/kg 浓度水平7 种FQs，每个浓度做6 个平行试验，按样品的处理步骤分析，考察方法的回收率和精密度。
回收率的计算公式如下。
式中：P 为加标回收率，%；C1 为样品中所含FQs的量，μg/kg；C2 为样品中FQs 标准品的添加量，μg/kg。
1.7 数据处理分析
数据采集和处理采用Excel 软件，绘图使用Origin软件。
2 结果与分析
2.1 除脂条件的选择
禽蛋含有很高的脂质，提取液浑浊、黏稠，如不进行预处理往往会导致液相色谱仪管道堵塞，提取后去除脂肪能保证通过固相萃取柱时的通畅也能更好地富集分析物。通常使用水饱和正己烷去除脂质，实际操作发现，由于正己烷振荡后容易产生乳化现象，在液面分层处形成絮状物质使得分层不明显，在去除絮状物质过程中不易操作。采用一次性注射器针头吸取下层溶液转移到另一小管效果较好，研究比较采用高速离心机8 000 r/min 分别离心5、10、20、30 min。结果表明离心5 min 分层不明显，下层溶液黄色浑浊物残留明显，10、20、30 min 则无明显差距，溶液皆为澄清状态。因此对不同处理时间的4 种样液进行加标液相分析，回收率见图1。
图1 不同离心时间对FQs 回收率的影响
Fig.1 Extraction recovery of FQs by after centrifugation for different centrifugation time periods
由图1 可知，10 min 的离心效果能达到较高的回收率。综合考虑选择高速离心机8 000 r/min 离心10 min。
2.2 固体萃取柱对禽蛋中FQs 回收率的影响
禽蛋类营养物质丰富，蛋清含有维生素和微量元素还有大量蛋白质，蛋黄含有大量的脂质和叶酸，这些组分在后续的液相分析中会产生不良影响，固相萃取小柱可以去除大部分杂质组分。取鸡蛋样品进行20 μg/kg回收试验，对C18 萃取小柱和HLB 小柱、PSA 小柱进行富集净化能力比较，结果见图2。
图2 不同固相萃取柱对FQs 回收率的影响
Fig.2 Effects of different solid-phase extraction columns on the recovery of FQs
由图2 可知，C18 萃取小柱对7 种FQs 的添加回收率为91.3%～101.1%，HLB 小柱对7 种目标物的回收率为82.6%～93.7%，PSA 小柱则对FQs 的回收率最低，为73.9%～83.8%。C18 萃取小柱的回收率高是因为应用场景大多是非极性和弱极性化合物的提取与净化，C18 萃取小柱和HLB 小柱均作为通用性反相吸附剂，其适用样品不尽相同，HLB 小柱则广泛应用于药物残留和药物代谢分析样品前处理。PSA 具备正相阴离子交换多种作用模式，多用于极性物质的吸附洗脱。禽蛋中的蛋白质、脂质等有机物极性相对较弱，可能是导致PSA 小柱在富集净化过程中效果低于C18 和HLB 的原因。结果表明，C18 富集能力最强、效果最好、回收率最高，因此选择C18 萃取小柱进行后续试验。
2.3 流动相pH 值的选择
在高效液相色谱法分析过程中，流动相的pH 值是影响提取效果的因素之一。pH 值对保留时间的影响见图3。
图3 pH 值对保留时间的影响
Fig.3 Effects of pH on retention time
由图3 可知，随着pH 值的增大，氟喹诺酮组分在色谱柱中的保留时间逐渐延长[27]，pH 值为5 时NOR、CIP、LOM 的回收率有较明显的下降，可能是pH 值增加，这3 种物质的结构导致在色谱柱上的保留能力下降，故选择pH4.0 流动相进行后续分析。
2.4 标准曲线、线性范围和检测限结果
7 种氟喹诺酮类药物线性方程、相关系数、检测限及线性范围见表2。
表2 7 种氟喹诺酮类药物线性方程、相关系数、检测限及线性范围
Table 2 Linear equations， correlation coefficients， limits of detection， and linear ranges of seven fluoroquinolones
化合物MAR FLE OFL NOR CIP LOM ENR回归方程y=53.16x+461.37 y=68.63x+338.54 y=39.06x+108.66 y=70.96x+454.12 y=104.20x+2 034.61 y=47.50x+584.48 y=82.29x+1 283.48相关系数（R2）0.999 9 0.999 9 0.999 7 0.999 6 0.999 4 0.999 2 0.999 6 LOD/（μg/kg）5.2 3.3 6.7 3.3 1.5 5.9 2.8线性范围/（μg/kg）10～200 0 10～200 0 10～200 0 10～200 0 10～200 0 10～200 0 10～200 0
由表2 可知，7 种FQs 在线性范围10～2 000 μg/kg中，线性相关系数R2 均大于0.999 0，LOD 为1.5～6.7 μg/kg。该方法表现出良好的重复性和精密度，方法的检测限（LOD）也较低，能够满足FQs 的微量检测需求。且该方法对FQs 具有良好的选择性，能够有效区分7 种FQs 与禽蛋基质干扰物。线性范围宽且准确性高，适用于大批量样品的快速检测。
2.5 实际样品检测
对鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋在上述条件下进行FQs 检测，在样品中均未检出FQs。取3 种禽蛋进行加标回收试验，加标浓度分别为10、50 μg/kg，回收率结果见表3。
表3 3 种固相萃取柱对禽蛋中7 种氟喹诺酮的回收率（n=6）
Table 3 Recovery of seven fluoroquinolones in poultry eggs by three solid-phase extraction columns （n=6）
注：-表示无检出。
化合物MAR FLE OFL NOR CIP LOM ENR加标量/（μg/kg）0 10 50 0 10 50 0 10 50 0 10 50 0 10 50 0 10 50 0 10 50鸡蛋回收率/%-93.5 98.5-89.2 92.8-86.8 88.2-92.5 99.8-93.0 103.1-87.2 91.9-100.6 96.8 RSD/%-4.8 5.0-1.9 3.0-3.5 4.2-5.8 2.0-3.3 6.2-5.2 1.6-2.6 2.7鸭蛋回收率/%-93.6 95.0-84.6 87.1-82.0 84.4-89.8 99.5-94.6 96.0-88.1 95.5-96.5 95.6 RSD/%-3.0 2.3-6.3 3.4-1.4 1.9-3.1 5.9-4.4 3.3-4.8 4.3-1.8 4.5鹅蛋回收率/%-95.7 96.2-88.0 94.2-89.8 83.8-87.8 94.1-91.0 100.3-92.3 97.9-97.2 97.4 RSD/%-3.1 2.1-2.5 5.6-4.7 2.6-3.1 3.8-4.4 3.0-5.1 3.3-2.5 5.4
由表3 可知，MAR 的回收率为93.5%～98.5%，FLE的回收率为84.6%～94.2%，OFL 的回收率为82.0%～88.2%，NOR 的回收率为87.8%～99.8%，CIP 的回收率为93.0%～103.1%，LOM 的回收率为87.2%～97.9%，ENR 的回收率为96.5%～100.6%。7 种FQs 检测结果的RSD 为1.4%～6.3%。结果表明，本研究优化条件下检测禽蛋中7 种FQs 的回收率高、精密度好，可用于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋实际样品中7 种FQs 的分析。
3 结论
本文以氟喹诺酮为研究对象，将磷酸盐正乙烷除脂、固体萃取柱净化富集和高效液相色谱检测相结合，优化了流动相pH 值、离心条件，比较3 种不同的固相萃取柱对鸡、鸭、鹅3 种禽蛋的影响，建立的固相萃取-高效液相色谱法可以同时测定7 种不同FQs。经过试验对比发现，以0.3%磷酸水溶液（ pH4.0 ）中加入5%乙腈为流动相，高速离心机8 000 r/min 离心10 min可以有效地去除禽蛋中的脂质。此条件下，7 种FQs在22 min 内完全分离，在质量浓度10～1 000 μg/kg 范围内，各目标药物呈良好的线性关系，相关系数 R2≥0.999 0，检出限为1.5～6.7 μg/kg，相对标准偏差低于6.3%。相对于农业部781 号公告-6-2006 《鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定高效液相色谱法》，本研究在检出限、检测宽度、检测目标物种类、检测时间上都优于其标准。综上所述，本研究构建的固相萃取-高效液相色谱法可应用于禽蛋产品中氟喹诺酮类抗生素残留的准确检测。同时，本方法也为其他禁用的农兽药残留、非法添加剂等的快速检测方法提供了参考。
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