蘑菇引起的食物中毒一直是国际食品安全的重点关注问题[1-4]。食用毒蘑菇引起的食物中毒后死亡率较高，其中含鹅膏毒肽蘑菇中毒死亡人数超过蘑菇中毒总死亡人数的90%[3-5]，鹅膏毒肽主要包括有α-鹅膏毒肽（α-amanita，α-AMA）、β-鹅膏毒肽（β-amanita，β-AMA）和γ-鹅膏毒肽（γ-amanita，γ-AMA），对人的口服半数致死量（median lethal dose，LD50）分别为0.3、0.5、0.2 mg/kg[6-7]。鹅膏毒肽毒性强、致死率高，会导致肝衰竭和肾损伤[7-9]，误食医疗花费大，鹅膏毒肽中毒是影响公众健康的突出食品安全和公共卫生问题之一。
目前，鹅膏毒肽的检测方法主要有快速检测方法[10-11]、毛细管电泳质谱联用法[12]、高效液相色谱法[13]、液相色谱-离子阱质谱法[14]、液相色谱-串联质谱法[15-18]、液相色谱-四极杆飞行时间质谱法[19-20]、基因扩增法[21-22]等。仪器方法是近年来应用最为广泛的检测方法，具有灵敏度高、准确性好等优点，但是仪器方法操作繁琐、价格昂贵，不适用大批量样品的现场检测，且对人员的操作技术要求较高，很难实现广泛的推广使用。相较于其他方法，酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）作为一种操作简便、灵敏度高、检测时间短的快速检测方法，在蘑菇毒素检测中备受关注。
因此，基于鹅膏毒肽蘑菇中毒具有发作紧急的特点，亟需现场快速对鹅膏毒肽进行检测，开发基于酶联免疫的快速检测方法具有很好的市场应用前景。建立一种可以在现场及初级实验室开展鹅膏毒肽类的检测方法，为突发毒蘑菇中毒事件的快速诊断提供一种简单、快速、可靠的检测技术手段，对保障人们群众的食品安全和生命健康具有重要意义。
本研究基于原料抗体性能、调研预期性能等指标对原料抗体进行筛选，确认反应体系并建立试剂盒方法，通过调整浓度、反应条件等各项参数，初步建立方法，同时开展样品处理方法开发与验证、产品单一条件稳定性验证，以期使其适用于鹅膏肽类蘑菇毒素的检测，并具备良好的准确性、重现性及稳定性。
1 材料和设备
1.1 材料与试剂
蘑菇样品（24 份）：云南省昆明市、玉溪市、楚雄市野外采集。α-AMA 标准品、β-AMA 标准品、γ-AMA 标准品、鬼笔环肽标准品（纯度≥90%）：上海安谱璀世标准技术服务有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、钥孔帽贝血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）：美国Amresco 公司；弗氏完全佐剂（Freund′s complete adjuvant，FCA）、弗氏不完全佐剂（Freund′s incomplete adjuvant，FICA）：美国Sigma 公司；Balb/c 小鼠：北京实验动物研究中心，实验动物许可证号SYXK（京）2020-0038；SP20 骨髓瘤细胞、DMEM 培养基、胎牛血清：上海酶联生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液[tris（hydroxymethyl）aminomethane buffered saline，TBS]、HAT 培养基、HT 培养基、细胞培养板、细胞培养皿（均为优级纯）：上海普飞生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱-串联质谱仪（1290-6460QQQ）：美国Agilent 公司；二氧化碳培养箱（CHW-80L）：上海航佩仪器有限公司；酶标仪（multiskan skyhigh）：美国赛默飞世尔科技公司；电融合仪（Voltaintmep-1）：澳大利亚CryoLogic 公司。
1.3 方法
1.3.1 β-AMA 抗原制备
鹅膏毒肽是小分子，不具备免疫原性，需偶联蛋白后才具备免疫原性。本试验采用N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐[N-（3-dimethylaminopropyl）-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]作为活化剂，活化β-AMA，制备鹅膏毒肽半抗原，然后将鹅膏毒肽半抗原偶联到KLH 蛋白上，制备出免疫原β-AMAKLH；将鹅膏毒肽半抗原偶联到BSA 蛋白上制备出包被原β-AMA-BSA。
1.3.2 β-AMA 单克隆抗体的制备
通过制备的β-AMA 抗原β-AMA-KLH 对小鼠进行注射，获得免疫小鼠。经免疫方法确认、免疫及血清检测、融合、筛选、单克隆制备、筛选、注射，获得腹水提纯，筛选出满足要求的原料抗体，为持续产出建立基础。
1.3.2.1 免疫程序
将β-AMA-KLH 抗原免疫Balb/c 小鼠，免疫程序如表1 所示。
表1 小鼠免疫程序
Table 1 Mouse immune program
免疫次数初次免疫二次免疫（28 d 后）加强免疫（间隔14～21 d）冲击免疫（14 d 后）佐剂弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂免疫剂量/（μg/只）100 50 25 25免疫方式腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射
初次免疫采用抗原与弗氏完全佐剂乳化免疫小鼠，之后采用免疫抗原与弗氏不完全佐剂乳化免疫小鼠；细胞融合前冲击免疫抗原用生理盐水稀释免疫小鼠。首次免疫采用100 μg 抗原对小鼠进行皮下多点注射，二次免疫与首次免疫间隔28 d，免疫剂量减半为50 μg，之后加强免疫（间隔14～21 d），进行大腿肌肉注射，免疫剂量减为25 μg。免疫期间定时采血进行效价测定[23-24]。冲击免疫与最后一次加强免疫间隔大于14 d，冲击免疫后3 d 进行融合。
1.3.2.2 细胞融合
脾细胞制备：选取效价不低于10 万的小鼠，冲击免疫后3 d，无菌条件下取脾脏，研磨过70 μm 筛网，用红细胞裂解液裂解红细胞，制成单细胞悬液，进行细胞计数。将SP20 骨髓瘤细胞和脾细胞按照1∶4 数量比混合，用电融合缓冲液洗涤2 次，最后用电融合缓冲液重悬细胞混合液，调整细胞密度1×107 个/mL加入融合池内，设置好电融合仪参数进行电融合。融合完成后用含有20% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的HAT 完全培养基重悬细胞，进行铺板。融合3 d 后用20% FBS 的HT 培养基换液，换液后7 d 进行ELISA初筛检测。
1.3.2.3 细胞融合后的筛选
采用β-AMA-BSA 检测抗原包被及细胞上清液。将阳性克隆转入24 孔内培养3 d 后进行复检。分别用α-AMA、β-AMA 和γ-AMA 标准品进行细胞上清液抑制实验，筛选出目的阳性细胞株进行亚克隆。
1.3.2.4 亚克隆
连续亚克隆2 次，最终得到具有免疫抑制的阳性克隆细胞株，进行细胞扩大培养并冻存（-18 ℃）。
1.3.2.5 单克隆抗体的生产
将阳性细胞株按照接种密度0.5×106～1×106 个/mL接种200 mL，进行无血清滚瓶培养驯化，设置滚瓶培养箱转速12 r/min，CO2 浓度5%，培养7～10 d 收集细胞上清液进行亲和纯化。
1.3.2.6 抗体纯化
将纯化样品、protein G 纯化柱、平衡缓冲液、洗脱缓冲液及中和缓存液从冰箱（0～8 ℃）内取出恢复室温。加入 5 mL 平衡缓冲液至纯化柱中，按约 1 mL/min 的流速流出平衡缓冲液。将样品按照约1 mL/min 的流速上样至层析柱中。用 30 mL 的平衡缓冲液洗涤纯化柱，流速维持约 2 mL/min，洗至流出液的A280 达到稳定。用 10～15 mL 洗脱缓冲液洗脱抗体，流速维持约1 mL/min，收集含有目的免疫球蛋白的洗脱液，并立刻加入Tris-HCl 中和缓冲液（1 mol/L，pH9.0），调节pH值至7.4。用pH7.4 的磷酸盐缓冲液透析抗体，最后抗体于-20 ℃保存。
1.3.3 鹅膏毒肽酶联免疫检测方法的建立
1.3.3.1 抗原包被浓度以及酶标抗体浓度的优化
选择β-AMA-BSA 抗原包被浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL，酶标抗体浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.30 μg/mL，检测吸光度（OD450 nm）。
1.3.3.2 样品提取液的选择
选取鹅膏毒肽阴性的4 种新鲜蘑菇样本各1 g，每种样品8 份，分别不添加以及添加2.5 ng/mL 的 β-鹅膏毒肽标准品，然后加入5 mL 的PBS、PBST（含Tween 20的磷酸盐缓冲液）、TBS 以及TBST（含Tween 20 的Tris缓冲盐溶液）4 种稀释液进行提取，振荡混匀5 min，然后室温4 000 r/min 离心5 min，取上清液进行检测，每组测3 个平行，取平均值。
1.3.3.3 样品前处理
称取（1.00±0.05） g 经烘干、均质后的蘑菇样品于50 mL 离心管中，加入30 mL 去离子水，振荡混合5 min；4 000 r/min 离心5 min，取500 μL 上清液，加入300 μL PBS，混匀，得样品待测液。
1.3.3.4 鹅膏毒肽单克隆抗体性能鉴定
选择与β-AMA 具有类似结构的α-AMA、γ-AMA和鬼笔毒肽进行酶联免疫吸附方法试验，通过标准曲线分别得到半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50），根据下式计算β-鹅膏毒肽结构类似物的交叉反应率（J，%）。
式中：I1 为鹅膏毒肽的IC50，ng/mL；I2 为结构类似物的IC50，ng/mL。
以α-AMA、β-AMA、γ-AMA 和鬼笔环肽作为标准品，用酶联免疫吸附方法对 β-AMA 及其类似物进行检测，以测定所制备β-鹅膏毒肽单克隆抗体的特异性。
1.3.3.5 鹅膏毒肽酶联免疫检测方法
加入β-AMA 标准溶液或样品待测液50 μL/孔，每个样品做2 孔平行。然后加0.1 μg/mL 酶标抗体50 μL/孔，加盖板膜，室温下反应 20 min。去盖板膜，甩干孔液，加PBST 溶液300 μL/孔，充分洗涤30 s；弃去孔液。重复洗涤3～4 次，最后1 次用吸水纸拍干。加TMB 底物溶液100 μL/孔，加盖板膜，置于室温避光环境中反应 10 min。加0.5 mol/L 硫酸溶液50 μL/孔，终止反应，颜色从蓝色变成黄色。轻轻振荡，充分混匀，于450 nm 下读取吸光度。
1.3.3.6 标准曲线的建立
配制β-AMA 标准溶液的浓度分别为 0、0.1、0.2、0.5、1.2、3.6 ng/mL，充分混匀后，按照 1.3.3.4 进行样本处理。采用所建立的酶联免疫检测方法进行检测，每个添加量分别重复3 次，取其 OD450 nm 平均值，并绘制标准曲线，以β-AMA 浓度（ng/mL）为X 轴，吸光度OD450 nm 为Y 轴。
1.3.3.7 试剂盒重复性分析验证
批内重复性验证：同一批次包被板随机取6 条进行检测，采用鹅膏毒肽阴性的新鲜蘑菇样本，添加2.0 μg/kg 的β-鹅膏毒肽，测得OD450 nm，计算板内变异系数（精密度）。
批间重复性验证：随机取不同批次6 块包被板，分别取1 条进行检测，采用鹅膏毒肽阴性的新鲜蘑菇样本，添加2.0 μg/kg 的β-鹅膏毒肽，测得OD450 nm，计算板间变异系数（精密度）。
1.3.3.8 试剂盒稳定性分析验证
将制备好的试剂盒置于4 ℃冷藏柜以及37 ℃烘箱，分别放置7、14、21、28 d 后进行检测，考察试剂盒稳定性。试剂盒稳定性通过降幅（F，%）来进行评价。
式中：A 为4 ℃时β-AMA 浓度浓度平均值，μg/kg；B 为37 ℃时β-AMA 浓度平均值，μg/kg。
1.3.3.9 试剂盒准确性验证（样品检测结果）
新鲜采集的蘑菇样本24 份，分别用本项目试剂盒（按照1.3.3.3～1.3.3.5 进行检测）和BJS 202008《蘑菇中α-鹅膏毒肽等6 种蘑菇毒素的测定》[25]中的方法进行检测。
1.4 数据处理
利用 Excel 2016 软件对试验数据进行整理与分析，采用 ELISA 数据分析专业软件（版本V1.0）拟合四参数竞争标准曲线。
2 结果与分析
2.1 抗原包被浓度和酶标抗体浓度的优化
抗原包被浓度和酶标抗体浓度的优化结果如表2所示。
表2 不同抗原包被浓度和酶标抗体浓度下样品吸光度
Table 2 Sample absorbance at different antigen coating concentrations and enzyme-linked antibody concentrations
抗原包被浓度/（μg/mL）0.5 1.0 1.5 2.0酶标抗体浓度/（μg/mL）0.05 0.632 1.156 1.613 2.123 0.10 1.226 2.112 2.656 2.837 0.20 1.899 2.667 3.112 3.687 0.30 2.533 3.558 3.666 3.656
由表2 可知，固定包被浓度时，吸光度与酶标抗体浓度呈正关系，当β-AMA-BSA 抗原包被浓度为1.0 μg/mL，酶标抗体浓度为0.10 μg/mL，吸光度接近2.0，确定该组合作为最佳包被浓度和酶标抗体浓度。
2.2 β-鹅膏毒肽标准曲线建立
以β-AMA 浓度（ng/mL）为横坐标，OD450 nm 吸光度为纵坐标，拟合得到四参数竞争标准曲线，如图1 所示。
图1 β-鹅膏毒肽的标准工作曲线
Fig.1 Standard working curve of β-amanitin
由图1 可知，标准工作曲线方程式为Y=0.080 61+1.878 2/[1+（X/0.438 86）0.985 18]，相关系数R2 为0.999 9，线性范围为0.1～3.6 ng/mL，IC50 为0.5 ng/mL，其最低检出浓度为0.1 ng/mL。
2.3 鹅膏毒肽单克隆抗体性能鉴定
鹅膏毒肽单克隆抗体的特异性结果如表3 所示。
表3 鹅膏毒肽单克隆抗体的特异性
Table 3 Specificity of amanitin monoclonal antibody
蘑菇毒素α-AMA β-AMA γ-AMA鬼笔环肽分子结构images/BZ_146_1470_1467_1895_1780.pngimages/BZ_146_1465_1803_1899_2116.pngimages/BZ_146_1463_2140_1901_2456.pngimages/BZ_146_1467_2480_1897_2792.pngIC50/（ng/mL）1.55 0.50 1.30＞100交叉反应率/%32 100 38＜0.50
由表3 可知，α-AMA、γ-AMA 和鬼笔环肽IC50 分别为1.55、1.30、＞100 ng/mL，因此试剂盒对于α-AMA、γ-AMA 的交叉反应率分别为32% 和38%，而鬼笔毒肽的交叉反应率＜0.50%，这种交叉反应率的差异是由其分子结构的不同造成的[26]。综上，本研究所制备的β-鹅膏毒肽单克隆抗体具有良好的特异性，可应用于免疫学快检方法的开发。
2.4 样品提取液的选择
样品提取液的选择结果如图2 所示。
图2 样品提取液的选择
Fig.2 Selection of sample extraction solution
由图2 可知，采用PBS、PBST、TBS、TBST 提取样本中β-鹅膏毒肽，回收率分别为88.8%～104.4%、76.0%～94.4%、66.0%～72.4% 和93.2%～110.0%。样品提取液为PBS 和TBS 时，未检出β-鹅膏毒肽，样品提取液为PBST 和TBST 时，检出β-鹅膏毒肽。因此，选择PBS作为样品提取液，其效果满足检测要求。
2.5 试剂盒重复性分析验证
试剂盒重复性验证试验结果如表4 所示。
表4 试剂盒重复性验证试验结果
Table 4 Results of repeatability verification test for reagent kit
批次平行1平行2平行3平行4平行5平行6批内重复性验证平均值±标准差/（μg/kg）2.04±0.09 2.04±0.12 2.05±0.09 2.08±0.09 2.08±0.10 2.03±0.10回收率/%102.0 102.0 102.5 104.0 104.0 101.5变异系数/%4.60 5.22 4.19 4.19 4.99 4.78批间重复性验证平均值±标准差/（μg/kg）2.12±0.11 2.06±0.18 2.02±0.17 2.05±0.17 2.11±0.20 2.07±0.10回收率/%106.0 103.0 101.0 102.5 105.5 103.5变异系数/%5.10 8.49 8.36 8.12 9.24 4.81
由表4 可知，批内重复性验证结果表明，批内回收率为102.0%～104.0%，变异系数≤5.22%，批内重复性良好。批间重复性验证结果表明，批间回收率为101.0%～106.0%，变异系数≤9.24%，批间重复性良好。
2.6 试剂盒稳定性分析验证
试剂盒稳定性验证结果如表5 所示。
表5 试剂盒稳定性验证结果
Table 5 Validation of reagent kit stability
时间/d 7 14 21 28 4 ℃OD450 nm 2.114 2.169 2.235 2.065 1.998 1.969 2.221 2.136 2.115 2.118 2.146 2.059平均值2.173 2.011 2.157 2.108 37 ℃OD450 nm 2.212 2.159 2.116 2.123 1.966 1.978 1.915 1.966 1.973 1.791 1.763 1.893平均值2.162 2.022 1.951 1.816降幅/%0.51-0.55 9.55 13.85
由表5 可知，试剂盒37 ℃放置7 d 和14 d 后相比4 ℃冷藏存放来说，试剂盒性能降幅小于5%，试剂盒37 ℃放置21 d 后相比4 ℃冷藏存放来说，试剂盒性能降幅小于10%，放置28 d 后降幅小于15%，表明试剂盒具有良好的稳定性，在常温状态下短期的存储及运输对其性能影响较小。
2.7 试剂盒准确性验证结果
试剂盒准确性验证结果见表6。
表6 试剂盒准确性验证结果
Table 6 Verification of reagent kit accuracy
样本编号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24试剂盒结果/（μg/kg）未检出未检出未检出未检出未检出未检出1 216.5未检出未检出未检出未检出352.3未检出未检出606.9未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出BJS 202008 试验结果/（μg/kg）未检出未检出未检出未检出未检出未检出1 387.6未检出未检出未检出未检出331.2未检出未检出652.5未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出
由表6 可知，试剂盒与BJS 202008《蘑菇中α-鹅膏毒肽等6 种蘑菇毒素的测定》[25]两种方法具有很好的一致性，检测结果准确、可靠。
3 结论
为研制鹅膏毒肽快速检测酶联免疫试剂盒，建立一种基于酶联免疫的快速检测蘑菇中鹅膏毒肽的方法，弥补目前蘑菇毒素快速检测方法的空缺。通过鹅膏毒肽合成了β-AMA 半抗原，并制备了β-AMA 单克隆抗体，抗原最佳包被浓度为1.0 μg/mL，酶标抗体浓度为0.10 μg/mL。该试剂盒的线性范围为0.1～3.6 ng/mL，半抑制浓度（IC50）为0.5 ng/mL。试剂盒对于α-AMA、γ-AMA 的交叉反应率分别为32% 和38%，而结构类似物鬼笔毒肽的交叉反应率＜0.50%，试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒对于β-鹅膏毒肽的添加回收率为101.0%～106.0%，批内变异系数≤5.22%，批间变异系数≤9.24%。综上，本研究研制的鹅膏毒肽酶联免疫试剂盒具有较高的灵敏度、正确度、精密度，可用于蘑菇中α-AMA、β-AMA、γ-AMA 的检测分析，为保障蘑菇及其制品的食用安全提供参考。
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