桑叶（Mori Folium）为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶[1-3]。1993 年被国家卫生部确认为“药食同源”植物，被国际食品卫生组织列入“人类21 世纪十大保健食品之一”，成为人类绿色新食品源[4-5]。研究表明，桑叶可以能疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血，常被应用于清热解毒的方剂中，用于治疗发热、感染等症状[6-7]。
桑叶中含有很多活性天然产物，包括多种黄酮类、多酚类、多糖类、生物碱类化合物、芳香烃、氨基酸、维生素等。桑叶提取物作为一种绿色、无污染、无残留的食物添加剂，具有良好的抗氧化活性、免疫调节和促进生长作用而受到广泛的关注。同时桑叶提取物在食品、医疗、化妆品、无公害农药等许多应用领域均已取得显著成果，尤其在饮料中发挥了良好的功能性作用[8-12]。目前，低糖、低热量功能性饮料的消费已成为人们关注的焦点。市场上关于将霜桑叶提取物与糖结合研制共结晶粉末，以糖基原料包覆霜桑叶活性化合物苦味的技术研究鲜见。
因此，本试验以霜降后的桑叶提取物为原料，搭配苹果浓缩物、蜂蜜、薄荷、甜叶菊[13-15]、柠檬酸、水，采取共结晶法使其微胶囊化[16-17]，开发霜桑叶提取物共结晶粉末功能性饮料，以期为霜桑叶在功能性饮料市场中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
霜桑叶：夏津素源生物科技有限公司；甜叶菊：广东永兴生物科技有限公司；薄荷：安徽爱迪香料股份有限公司；柠檬酸：山东英轩实业股份有限公司；蔗糖：河南万邦化工科技有限公司；苹果浓缩物：山东果仙尼生物科技有限公司；乙醇、浓硫酸（均为分析纯）：无锡腾盛化学有限公司；蒽酮、氢氧化钠、酚酞（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；纯净水：农夫山泉股份有限公司。
RE-3000A 旋转蒸发浓缩仪：上海亚荣生化仪器厂；SJ3592 磨粉机：浙江绍兴苏泊尔家居用品有限公司；SK3200HP 超声波清洗器：上海科导仪器有限公司；ZDJ-4A 自动电位滴定仪：上海精密科学仪器有限公司；DRHH-S4 数显恒温水浴锅：上海程捷仪器设备公司；722 可见分光光度计、UV759 紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；YP10002 电子天平：上海光正医疗仪器有限公司；HWG-2 远红外干燥箱：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；PAL-1 便携式数显水果糖度计：日本ATAGO 公司 。
1.2 方法
1.2.1 霜桑叶提取物共结晶粉末功能性饮料生产工艺流程
原辅料预处理→提取→提取物微胶囊化→优化功能性饮料的配方→巴氏灭菌→成品。
1.2.1.1 原辅料预处理
取适量的霜桑叶清洗，并放入远红外干燥箱干燥，直至桑叶处于干燥的状态，测定水分含量为5.6%。将一定量霜桑叶放入磨粉机粉碎，过80 目筛，得到细腻的霜桑叶粉。
1.2.1.2 提取
称取10 g 霜桑叶粉，料液比为1∶15 （g/mL），70%乙醇浸提30 min，然后将霜桑叶-乙醇浸提样品放在超声波设备中，超声辅助提取40 min 后使用滤纸过滤，然后将滤液在真空旋蒸40 ℃下浓缩40 min，经25 ℃低温烘干、研钵磨碎即获得提取物固体粉末。
1.2.1.3 提取物微胶囊化
将6 mg 霜桑叶提取物与50 g 蔗糖混合均匀。将获得的混合物在加热器中连续搅拌直至121～130 ℃。当糖浆中出现轻微浑浊时停止加热，继续搅拌直到混合物达到环境温度。然后，将共结晶产物在40 ℃干燥箱中干燥36～40 h，研磨筛分并保存于防潮的塑料包装中（产品休止角保持在40°～45°），得到共结晶粉末。
1.2.1.4 优化功能性饮料的配方
取适量共结晶粉末、薄荷、甜叶菊、苹果浓缩物、柠檬酸、蜂蜜、水混合调配，将原辅料混匀，装入聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）塑料瓶中密封。
1.2.1.5 杀菌
采用巴氏杀菌法进行杀菌，在75 ℃下对所得样品巴氏杀菌10 min，然后待样品自然冷却至35 ℃，封瓶后即可得到桑叶提取物共结晶粉末功能性饮料成品[18-19]。
1.2.2 单因素设计
该试验单因素设计以PET 塑料瓶容量225 mL 为标准，固定纯净水的添加量为200 mL，考察甜叶菊添加量、柠檬酸添加量、共结晶粉末添加量、薄荷添加量、苹果浓缩物添加量、蜂蜜添加量对饮料品质的影响。
1.2.2.1 甜叶菊添加量对饮料品质的影响
固定柠檬酸添加量0.500 g、共结晶粉末添加量2.000 g、薄荷添加量0.100 g、苹果浓缩物添加量1.00 mL、蜂蜜添加量1.00 mL，考察甜叶菊添加量（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 g）对饮料品质的影响。
1.2.2.2 柠檬酸添加量对饮料品质的影响
固定甜叶菊添加量0.500 g、共结晶粉末添加量2.000 g、薄荷添加量0.100 g、苹果浓缩物添加量1.00 mL、蜂蜜添加量1.00 mL，考察柠檬酸添加量（0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 g）对饮料品质的影响。
1.2.2.3 共结晶粉末添加量对饮料品质的影响
固定甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、薄荷添加量0.100 g、苹果浓缩物添加量1.00 mL、蜂蜜添加量1.00 mL，考察共结晶粉末添加量（0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 g）对饮料品质的影响。
1.2.2.4 薄荷添加量对饮料品质的影响
固定甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g、苹果浓缩物添加量1.00 mL、蜂蜜添加量1.00 mL，考察薄荷添加量（0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 g）对饮料品质的影响。
1.2.2.5 苹果浓缩物添加量对饮料品质的影响
固定甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g、薄荷添加量0.100 g、蜂蜜添加量1.00 mL，考察苹果浓缩物添加量（0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL）对饮料品质的影响。
1.2.2.6 蜂蜜添加量对饮料品质的影响
固定甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g、薄荷添加量0.100 g、苹果浓缩物添加量4.00 mL，考察蜂蜜添加量（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL）对饮料品质的影响。
1.2.3 正交试验设计
根据单因素试验结果，选取六因素三水平设计正交试验，以感官评分结果为指标，对结果进行分析处理，得到最优饮料配方。饮料正交试验因素与水平见表1。
表1 饮料正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal design for the beverage
水平123因素A 苹果浓缩物添加量/mL 2.00 4.00 8.00 B 蜂蜜添加量/mL 0.50 1.00 2.00 C 薄荷添加量/g 0.050 0.100 0.200 D 甜叶菊添加量/g 0.250 0.500 1.000 E 柠檬酸添加量/g 0.125 0.250 0.500 F 共结晶粉末添加量/g 1.000 2.000 4.000
1.2.4 功能性饮料感官评价
功能性饮料制作完成并冷却后，由10 人（5 男5 女）组成的感官评价小组进行感官评价，参照GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》感官要求，结合功能性饮料自身特性，从外观、滋味、组织状态、香气4 个方面制定感官评分标准，对功能性饮料进行感官评分，取其平均值，具体评分标准见表2[20-23]。
表2 桑叶提取物共结晶粉末功能性饮料感官评分标准
Table 2 Sensory scoring criteria for co-crystallized powder of mulberry leaf extract
评价项目外观滋味组织状态评分标准色泽清亮，纯正均匀色泽较清亮，较均匀色泽基本清亮，色泽均匀，局部带有少量杂色色泽不清亮，局部不均匀，杂色明显色泽极不均匀，杂色很深酸甜苦适中且回甘的甜味适中酸甜苦较适中，且回甘甜味较适中酸甜不适中，回甘过甜，苦味不适中甜味或酸味较淡，苦味不适中苦味重且过酸澄澈透明，无杂质沉淀较澄澈透明， 无沉淀无沉淀分层且浑浊物质较少沉淀分层不明显有较少明显浑浊物质有明显沉淀分层且较多明显浑浊物质分数20～25 15～＜20 10～＜15 5～＜10 0～＜5 20～25 15～＜20 10～＜15 5～＜10 0～＜5 20～25 15～＜20 10～＜15 5～＜10 0～＜5
续表2 桑叶提取物共结晶粉末功能性饮料感官评分标准
Continue table 2 Sensory scoring criteria for co-crystallized powder of mulberry leaf extract
评价项目香气评分标准具有适中的苹果、薄荷等混合清香，无其他异味苹果、薄荷等混合物味道过重苹果、薄荷等混合物味道过淡无明显香味有明显异味分数20～25 15～＜20 10～＜15 5～＜10 0～＜5
1.3 饮料理化指标测定
1.3.1 饮料中还原性总糖含量的测定
参考GB 5009.8—2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》[24]，采用蒽酮比色法测定饮料中还原性总糖含量。
1.3.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制
称取0.1 g 经105 ℃烘干至恒重的无水葡萄糖，加纯净水溶解，并于1 000 mL 容量瓶中定容至刻度，混匀备用。分别取标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于试管中，立即在每支试管中加入蒽酮试剂4.0 mL，迅速浸入冰水浴中冷却，然后放入沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10 min 取出，用冰水浴冷却至室温，在620 nm 波长下以第1 支试管作为空白，迅速测其余各管吸光度。以标准葡萄糖含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线y=0.010 9x-0.02，R2=0.999 2。
1.3.1.2 总糖含量的测定
称取饮料5.0 g，加纯净水25 mL，沸水浴1 h，冷却后过滤，残渣加适量纯净水继续置于锥形瓶中沸水浴0.5 h，冷却后过滤，并反复洗涤残渣，滤液收集在100 mL容量瓶中，定容至刻度，得到提取液。吸取提取液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀。吸取1 mL 已稀释的提取液于试管中，加入4.0 mL 蒽酮试剂，平行3 次；空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同1.3.1.1 标准曲线制作。根据 A620 平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（μg），样品中总糖含量的计算公式如下。
式中：X 为样品总糖含量，%；C 为在标准曲线上查出的葡萄糖含量，μg；V 总为提取液总体积，mL；W 为样品质量，g；V 测为测定体积，mL；D 为稀释倍数；106 为样品质量单位由克换算成微克的换算系数。
1.3.2 饮料中总酸含量的测定
总酸含量参考GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[25]中方法测定。
1.3.2.1 样品处理称取5.000 0 g（精确至0.000 1 g） 饮料用水洗入250 mL 容量瓶；将装样品的容量瓶置于80 ℃水浴锅浸提30 min，并摇动数次促使溶解，冷却后加水定容至刻度。摇匀，用滤纸过滤。吸取50 mL 滤液于烧杯中。
1.3.2.2 总酸含量测定
采用自动电位滴定仪测定总酸含量，样品中总酸含量的计算公式如下。
式中：X 为总酸含量，%；C 为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；V1 为滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2 为空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；5 为试液的体积换算系数；m 为试样质量，g；K 为苹果酸换算系数，0.067。
1.3.3 饮料中维生素C（VC）含量的测定
参考GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》[26]，采用紫外分光光度计，结合维生素C 的标准曲线y=0.064 8x-0.010 2，测定饮料中维生素VC 含量。
1.3.3.1 维生素C 标准曲线的绘制
准确称取抗坏血酸10 mg，加2 mL 1% HCl，加纯净水定容至100 mL，混匀。此抗坏血酸溶液的浓度为100 μg/mL。分别取标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，加入蒸馏水定容至10 mL，在243 nm 处测定其吸光度，绘制标准曲线，方程为y=0.064 8x-0.010 2，R2=0.999 3。
1.3.3.2 样品测定
称取20.00 g 样品于研体中，加入20 mL 1% HCl，匀浆，转移到50 mL 容量瓶中，稀释至刻度，取0.2 mL提取液，置于含0.4 mL 1% HCl 的10 mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在243 nm 处测定其吸光度。样品的维生素C 含量计算公式如下。
式中：X 为维生素C 的含量，μg/g；A 为从标准曲线上查得的抗坏血酸的含量，μg；W1 为测吸光度时吸取样品溶液的体积，mL；V 总为样品定容体积，mL；W 总为样品质量，g 。
1.3.4 可溶性固形物含量测定
采用便携式数显水果糖度计测定可溶性固形物含量。
1.3.5 微生物检测
参考GB/T 4789.21—2003《食品卫生微生物学检验 冷冻饮品、饮料检验》[27]、GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》[28]中的方法对成品饮料进行微生物检测。
1.4 数据处理
每个样品重复3 次平行，采用SPSS 26.0 对数据进行单因素方差分析，P＜0.05 被认为具有统计学显著性，结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2021 和Microsoft Excel 进行绘图与数据分析[29]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 甜叶菊添加量对饮料感官品质的影响
甜叶菊添加量对饮料感官品质的影响见图1。
图1 甜叶菊添加量对桑叶饮料感官品质的影响
Fig.1 Effect of stevia addition on the taste quality of mulberry leaf beverage
由图1 可知，不同的甜叶菊添加量可以影响饮料的品质，甜叶菊的添加量超过0.500 g 之后感官评分开始下降。当甜叶菊添加量为0.125～0.500 g 时，饮料的感官评分逐渐增加；当甜叶菊添加量为0.500 g 时，饮料的感官评分最高，此时，其组织状态、口感及外观最佳。因此，选择甜叶菊的添加量为0.250～1.000 g 进行后续试验。
2.1.2 柠檬酸添加量对饮料感官品质的影响
柠檬酸添加量对饮料感官品质的影响见图2。
图2 柠檬酸添加量对桑叶饮料感官品质的影响
Fig.2 Effect of citric acid addition on the taste quality of mulberry leaf beverage
由图2 可知，不同的柠檬酸添加量可以影响饮料的品质，当柠檬酸添加量超过0.250 g 之后感官评分开始下降。当柠檬酸添加量为0.125～0.250 g 时，饮料的感官评分逐渐增加；当柠檬酸添加量为0.250 g 时，饮料的感官评分最高，此时，其组织状态、口感及外观最佳。因此，选择柠檬酸添加量为0.125～0.500 g 进行后续试验。
2.1.3 共结晶粉末添加量对饮料感官品质的影响
共结晶粉末添加量对饮料感官品质的影响见图3。
图3 共结晶粉末添加量对桑叶饮料感官品质的影响
Fig.3 Effect of co-crystallized powder addition on the taste quality of mulberry leaf beverage
由图3 可知，不同的共结晶粉末添加量可以影响饮料的品质，当共结晶粉末添加量超过2.000 g 后感官评分开始下降。当共结晶粉末添加量为0.250～2.000 g时，饮料的感官评分逐渐增加；当共结晶粉末添加量为2.000 g 时，饮料的感官评分最高，此时，其组织状态、口感及外观最佳。因此，选择共结晶粉末添加量为1.000～4.000 g 进行后续试验。
2.1.4 薄荷添加量对饮料感官品质的影响
薄荷添加量对饮料感官品质的影响见图4。
图4 薄荷添加量对桑叶饮料感官品质的影响
Fig.4 Effect of mint addition on the taste quality of mulberry leaf beverage
由图4 可知，不同的薄荷添加量可以影响到饮料的品质，当薄荷添加量超过0.100 g 之后感官评分开始下降。当薄荷添加量为0.025～0.100 g 时，饮料的感官评分逐渐增加；当薄荷添加量为0.100 g 时，饮料的感官评分最高，此时，其组织状态、口感及外观最佳。因此，选择薄荷添加量为0.050～0.200 g 进行后续试验。
2.1.5 苹果浓缩物添加量对饮料感官品质的影响
不同苹果浓缩物添加量对饮料感官品质的影响见图5。
图5 苹果浓缩物添加量对桑叶饮料感官品质的影响
Fig.5 Effect of apple concentrate addition on the taste quality of mulberry leaf beverage
由图5 可知，不同的苹果浓缩物添加量可以影响饮料的品质，苹果浓缩物添加量为0.50～8.00 mL 时，感官评分整体呈现先上升后下降的趋势，当苹果浓缩物添加量为4.00 mL 时，饮料的感官评分最高，此时，其组织状态、口感及外观最佳。 因此，选择苹果浓缩物添加量为2.00～8.00 mL 进行后续试验。
2.1.6 蜂蜜添加量对饮料感官品质的影响
不同蜂蜜添加量对饮料感官品质的影响见图6。
图6 蜂蜜添加量对桑叶饮料感官品质的影响
Fig.6 Effect of honey addition on the taste quality of mulberry leaf beverage
由图6 可知，不同的蜂蜜添加量可以影响饮料的品质。当蜂蜜添加量超过1.00 mL 之后感官评分开始下降；当蜂蜜添加量为0.25～1.00 mL 时，饮料的感官评分逐渐增加；当蜂蜜添加量为1.00 mL 时，饮料的感官评分最高，此时它的组织状态、口感及外观最佳。因此，选择蜂蜜添加量为0.50～2.00 mL 进行后续试验。
2.2 正交试验
正交试验结果见表3，方差分析见表4。
表3 正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 A 苹果浓缩物添加量332122122133211331 B 蜂蜜添加量132331332122122131 C 薄荷添加量111222313132321233 D 甜叶菊添加量321331122131323212 E 柠檬酸添加量133312221123312213 F 共结晶粉末添加量312121331113332222感官评分47.00 75.00 52.00 48.00 53.00 79.00 80.00 87.00 78.00 58.00 77.00 53.00 56.00 69.00 70.00 86.00 89.00 79.00
续表3 正交试验结果
Continue table 3 Orthogonal test results
序号k1 k2 k3R主次因素最优组合A 苹果浓缩物添加量67.33 67.50 71.17 3.84 D＞E＞C＞F＞B＞A A3B3C3D2E2F2 B 蜂蜜添加量67.50 66.50 72.00 5.50 C 薄荷添加量64.84 64.67 76.50 11.83 D 甜叶菊添加量68.50 79.00 58.50 20.50 E 柠檬酸添加量65.67 79.83 60.50 19.33 F 共结晶粉末添加量69.17 71.50 65.33 6.17感官评分
表4 正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance for the orthogonal test
注：*表示影响显著（P＜0.05）。
因素苹果浓缩物添加量蜂蜜添加量薄荷添加量甜叶菊添加量柠檬酸添加量共结晶粉末添加量自由度28.167 51.500 276.167 630.500 601.167 58.167 F 值0.590 1.079 5.786 13.209 12.594 1.219 P 值0.589 0.408 0.050 0.010 0.011 0.589显著性**
由表3 和表4 可知，饮料的感官评分与甜叶菊、柠檬酸添加量显著相关（P＜0.05）。6 个因素对桑叶提取物共结晶粉末饮料品质的影响程度顺序为D＞E＞C＞F＞B＞A，综合这些因素的k 值可以得到最优方案为A3B3C3D2E2F2，即苹果浓缩物添加量8.00 mL、蜂蜜添加量2.00 mL、薄荷添加量0.200 g、甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g，与表3 中最高评分组合A3B3C3D1E1F2 不符，因此需进行对比验证试验。
2.3 验证试验
由正交试验得出评分最高为苹果浓缩物添加量8.00 mL、蜂蜜添加量2.00 mL、薄荷添加量0.200 g、甜叶菊添加量0.250 g、柠檬酸添加量0.125 g、共结晶粉末添加量2.000 g；根据数据处理极差分析得出的最优组合为苹果浓缩物添加量8.000 mL、蜂蜜添加量2.000 mL、薄荷添加量0.200 g、甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g。经3 次平行试验得到，感官评分为92。因此，霜桑叶提取物功能性饮料最佳配方为苹果浓缩物添加量8.000 mL、蜂蜜添加量2.000 mL、薄荷添加量0.200 g、甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g，根据此配方，即可得到酸甜可口、口感清新的饮料[30]。
2.4 理化分析
对最佳饮料配方进行理化分析，结果见表5。
表5 饮料理化分析
Table 5 Physical and chemical properties of the beverage
总糖含量/%4.28总酸含量/%0.832 VC 含量/（μg/g）7.5可溶性固形物含量/%4.40细菌总数/（CFU/mL）7大肠杆菌/（MPN/100 mL）2酵母菌/（CFU/mL）5霉菌/（CFU/mL）3沙门氏菌/（CFU/mL）未检出志贺氏菌/（CFU/mL）未检出金黄色葡萄球菌/（CFU/mL）未检出
由表5 可知，产品符合食用安全标准。
3 结论
本试验以霜桑叶为原料，采取创新型共结晶法使其微胶囊化，制备霜桑叶提取物共结晶粉末。通过感官评分指标分析霜桑叶提取物共结晶粉末饮料的品质，对苹果浓缩物添加量、蜂蜜添加量、薄荷添加量、甜叶菊添加量、柠檬酸添加量、共结晶粉末添加量进行单因素试验、正交试验优化工艺。结果表明，桑叶提取物共结晶粉末饮料的最优工艺配方为苹果浓缩物添加量8.00 mL、蜂蜜添加量2.00 mL、薄荷添加量0.200 g、甜叶菊添加量0.500 g、柠檬酸添加量0.250 g、共结晶粉末添加量2.000 g。在此工艺配方下，感官评分为92，总糖含量为4.28%，总酸含量为0.832%，VC 含量为7.50 μg/g，可溶性固形物含量为4.40%，微生物检测符合国家安全标准。本试验为桑叶资源的综合利用和功能性饮料产品的开发提供了理论依据。
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