灵芝（Ganoderma lucidum）属于担子门灵芝属（Ganoderma）[1]，目前已知约有100 种。其中，赤芝（灵芝）和紫芝（G. sinense）干燥子实体是主要的药用种类[2]。东北地区的松杉灵芝常被用作功能食品的原料[3]。此外，其他一些灵芝品种也受到研究关注，例如黑灵芝[3]、树舌灵芝和鹿角灵芝[2-3]等，特别是区域灵芝，包括昆明灵芝、海南灵芝、蒙古灵芝和厦门灵芝等。灵芝科包含4 个属和103 个种，其中灵芝属则有76 个种[3]，因此灵芝的品种非常丰富，分布遍及全国。现阶段药用灵芝主要以栽培品种为主，其中国家及省级审定的品种约有19 个[3]。
由于灵芝富含活性多糖、三萜类化合物、有机酸和生物碱等成分[4]，因此具有多种生理活性，如降低血糖和血脂、抗病毒及抗肿瘤等[5]。现阶段有关灵芝的研究主要集中在分类研究[6]、品种培育、多糖和三萜提取优化[7]、活性成分的发酵调控及产品加工以及灵芝孢子粉的成分和活性研究等方面[8-9]。然而，针对灵芝采摘和加工后产生的大量菌柄及废料的应用研究相对较少。为实现资源的综合利用，本文采用超声波-酶促辅助提取法对灵芝加工废弃物进行活性成分提取研究，并开展相关成分的抗肿瘤和抗氧化性研究，以期为相关废弃物开发功能食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及原料
灵芝加工废料：黑龙江省海林市森宝慧源食用菌有限责任公司，主要为松杉灵芝加工后的菌柄，粉碎（14～20 目）备用。苯酚（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；浓硫酸（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；纤维素酶（2 000 U/g）（分析纯）：北京鸿润宝顺科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津大茂化学试剂厂；齐墩果酸（色谱纯）：四川省维克奇生物科技有限公司；冰乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；香草醛（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；高氯酸（分析纯）：济宁恒泰化工有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（生物试剂）：生工生物工程（上海）股份有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶（均为生物试剂）：上海远慕生物科技有限公司；靶细胞（肝癌细胞HepG2、肾癌细胞CaKi-1）、RPMI-1640 培养基（生物试剂）：上海源叶生物技术有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）、三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]（分析纯）、噻唑蓝（生物试剂）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津博迪化工有限公司。
1.2 主要仪器
GL124-1SCN 电子天平、PB-10 酸度计：德国赛多利斯集团；R210 旋转蒸发仪：瑞士BUCHI 公司；SL-2010N 超声波萃取装置：南京顺流设备仪器有限公司；BenchTop Pro 冷冻真空干燥机：美国VirTis 公司；T6紫外可见分光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HH-4 恒温水浴锅、BPN-50CH（UV）二氧化碳培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YDS-50 液氮储存罐：成都埃欧科技有限公司；SynergyH1 酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；AllegraX-22 离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；BSC-1004IIA2 生物安全柜：苏州安泰空气技术有限公司；Frontier 红外光谱仪：美国PE 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 单因素试验
1.3.1.1 不同乙醇浓度对灵芝菌柄多糖和三萜得率的影响
选取不同乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%），固定固液比1∶10 （g/mL）、pH5.5、酶添加量300 U/g，在45 ℃下进行30 min 的酶促反应后，进行超声辅助提取，超声时间30 min，超声温度为40 ℃，超声功率为500 W，考察不同乙醇浓度对灵芝菌柄多糖和三萜得率的影响。
1.3.1.2 不同超声时间对灵芝菌柄多糖和三萜得率的影响
设定乙醇浓度为40%，其他工艺条件与1.3.1.1 相同，选择超声时间10、20、30、40、50 min 和60 min，考察不同超声时间对灵芝菌柄多糖和三萜得率的影响。
1.3.1.3 不同超声温度对灵芝菌柄多糖和三萜影响
设定乙醇浓度为40%、超声时间30 min，其他工艺条件与1.3.1.1 相同，选择超声温度20、30、40、50、60、70、80 ℃，考察不同超声温度对灵芝菌柄多糖和三萜得率的影响。
1.3.1.4 不同固液比对灵芝菌柄多糖和三萜影响
设定乙醇浓度40%、超声时间30 min、超声温度50 ℃，其他工艺条件与1.3.1.1 相同，选择固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），考察不同固液比对灵芝菌柄多糖和三萜影响。
1.3.1.5 不同酶添加量对灵芝菌柄多糖和三萜影响
设定乙醇浓度40%、超声时间30 min、超声温度50℃、固液比为1∶25 （g/mL），其他工艺条件与1.3.1.1相同，选择酶添加量100、200、300、400、500、600 U/g，考察不同酶添加量对灵芝菌柄多糖和三萜影响。
1.3.2 灵芝菌柄多糖和三萜含量及得率测定
1.3.2.1 灵芝菌柄多糖含量测定
参考文献[10-11]的方法，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量。回归方程为y=0.050 3x+0.003 1，R2=0.996 9。
1.3.2.2 灵芝菌柄三萜含量测定
参考文献[11-13]的方法，并略作改动。采用5%香草醛-高氯酸显色法测定三萜含量。回归方程为Y=0.005 5x+0.084，R2=0.999 4。
1.3.2.3 灵芝菌柄多糖及三萜得率测定灵芝菌柄多糖或三萜得率（Y，%）计算公式如下。
式中：Y 为灵芝菌柄多糖或三萜得率，%；C 为提取液中多糖或三萜含量，g/mL；D 为稀释倍数；V 为样品溶液总体积，mL；M 为灵芝菌柄的质量，g。
1.3.3 正交优化试验
在单因素试验的基础上，选择酶添加量、超声时间、超声温度、固液比、乙醇浓度为影响因素[10，14-15]，以多糖、三萜得率为指标[10，16]，进行L16（45）正交试验，因素与水平见表1。
表1 正交设计的因素和水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal design
水平1234 A 乙醇浓度/%30 40 50 60 B 超声时间/min 30 40 50 60 C 超声温度/℃40 50 60 70 D 固液比/（g/mL）1∶15 1∶20 1∶25 1∶30 E 酶添加量/（U/g）200 300 400 500
为更好地评价工艺优劣，参考文献[10，14]的方法对多糖及三萜得率进行加权处理，综合评分（Z）计算公式如下。
式中：P 为多糖得率，%；T 为三萜得率，%，1.8 为多糖加权系数。
1.3.4 多糖、三萜体外抗肿瘤活性研究
以肝癌细胞HepG2、肾癌细胞CaKi-1 为靶细胞，采用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑溴化物[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]法对多糖、三萜进行抗肿瘤活性研究[17-20]。
1.3.5 多糖红外光谱表征
将优化后的灵芝菌柄提取物用去离子水配制成溶液，通过Sevage 法去除蛋白质，并透析（截留量3 500 Da）。随后进行醇沉，4 000 r/min 离心15 min，将沉淀冷冻干燥，采用红外光谱仪进行分析[10，17，21]。
1.3.6 多糖、三萜体外抗氧化活性研究
以维生素C 为阳性对照，参考文献[19-22]中的方法，采用邻苯三酚法测定超氧阴离子自由基清除率；参考文献[19，21]方法测定羟基自由基清除率；参考文献[21-23]的方法测定1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率。
1.4 数据处理
采用正交设计助手Ⅱ3.1 计算处理正交数据，Excel 2010 计算数据相对标准偏差，Origin 8 制作相关曲线。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇浓度
乙醇浓度对多糖及三萜得率的影响见图1。
图1 乙醇浓度对多糖及三萜得率的影响
Fig.1 Effects of ethanol concentration on the yields of polysaccharide and triterpenoids
由图1 可知，随着乙醇浓度的增加，多糖的得率下降，而三萜的得率则呈现上升趋势。这与两种物质的极性密切相关。多糖易溶于热水，而三萜主要为脂溶性成分。因此，随着溶剂极性的增加，三萜的得率下降。当乙醇浓度达到50%时，多糖和三萜的得率均较高。乙醇浓度为60%时，此时大部分多糖已经溶出，继续增加乙醇浓度，无法提高多糖得率，且会造成试剂的浪费。因此，选择乙醇浓度30%～60%进行正交优化试验。
2.1.2 超声时间
超声时间对多糖及三萜得率的影响见图2。
图2 超声时间对多糖及三萜得率的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic time on the yields of polysaccharide and triterpenoids
由图2 可知，随着超声时间的延长，多糖和三萜的得率均呈现出先增长后下降趋势。在50 min 时多糖得率达到了峰值（1.30%）。随着超声时间的继续延长，三萜和多糖的得率均略有下降。这可能与样品溶液黏度增加导致空化效应的作用力减弱有关[10，24]。同时，多糖的结构破坏及其表面吸附现象也可能起到一定作用[24]。因此，选择超声时间30～60 min 进行正交优化试验。
2.1.3 超声温度
超声温度对多糖及三萜得率的影响见图3。
图3 超声温度对多糖及三萜得率的影响
Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on the yields of polysaccharide and triterpenoids
由图3 可知，随着超声温度的升高，多糖和三萜的得率呈现出不同的变化趋势。当超声温度超过60 ℃时，多糖的得率明显下降；而三萜得率在超声温度达到50 ℃后，增长趋势减缓。这可能与高温导致多糖降解或产生其他杂质有关。温度升高促进了分子运动，增强了扩散能力并加快了扩散速度；而低温则不利于多糖和三萜化合物的溶出。过高的温度可能破坏多糖的结构，或导致其他成分的溶出，从而影响目标产物的含量。因此，选择超声温度40～70 ℃进行正交优化试验。
2.1.4 固液比
固液比对多糖及三萜得率的影响见图4。
图4 固液比对多糖及三萜得率的影响
Fig.4 Effects of solid-to-liquid ratio on the yields of polysaccharide and triterpenoids
由图4 可知，随着溶剂添加量增加，多糖和三萜得率均呈现出增长趋势。在固液比超过1∶30 （g/mL）后，多糖得率开始略微下降，三萜得率增长缓慢。这可能是因为当所用溶剂较少时，溶液浓度较大，多糖溶出不完全，得率较低，而增大溶剂添加量可以增加灵芝菌柄与溶剂的接触面积，有利于多糖析出；继续增大溶剂添加量，会导致蛋白质、脂类和多酚等非多糖物质溶出，从而影响多糖的得率。因此，选择固液比1∶15～1∶30 （g/mL）进行正交优化试验。
2.1.5 酶添加量
酶添加量对多糖及三萜得率的影响见图5。
图5 酶添加量对多糖及三萜得率的影响
Fig.5 Effects of enzyme addition on the yields of polysaccharide and triterpenoids
由图5 可知，在酶添加量达到500 U/g 后，多糖得率出现降低趋势，当酶添加量达到300 U/g 后，三萜得率增长缓慢。这是因为酶的添加有利于破坏细胞壁结构，胞内物质易于释放。得率下降与酶添加量饱和后，部分多糖被水解有关[14]。因此，选择酶添加量200～500 U/g 进行正交优化试验。
2.2 正交优化结果
正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test
试验号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 k1 k2 k3 k4R A 乙醇浓度1111222233334444 2.487 3.690 2.775 2.936 1.203 B 超声时间1234123412341234 3.156 2.956 3.014 2.761 0.395 C 超声温度1234214334124321 2.416 3.316 2.809 3.347 0.931 D 固液比1234341243212143 3.053 2.859 3.222 2.753 0.469 E 酶添加量1234432121433412 3.052 2.946 2.925 2.964 0.127多糖得率/%1.036 0.890 0.912 0.647 1.570 1.118 1.516 1.058 0.650 1.118 0.742 1.008 1.094 0.946 1.076 0.762三萜得率/%0.412 1.074 0.928 1.260 1.635 0.841 1.434 1.379 1.381 1.453 0.805 1.129 1.366 1.128 1.247 1.021综合评分2.276 8 2.676 0 2.569 6 2.424 6 4.461 0 2.853 4 4.162 8 3.283 4 2.551 0 3.465 4 2.140 6 2.943 4 3.335 2 2.830 8 3.183 8 2.392 6
表3 方差分析结果
Table 3 Results of variance analysis
注：*表示影响显著（P＜0.05）。
因素A 乙醇浓度B 超声时间C 超声温度D 固液比E 酶添加量误差偏差平方和3.165 0.322 2.380 0.520 0.038 0.04自由度333333 F 比83.289 8.474 62.632 13.684 1.000 F 临界值9.280 9.280 9.280 9.280 9.280显著性***
由表2 可知，各因素对多糖及三萜得率的影响依次为乙醇浓度＞超声温度＞固液比＞超声时间＞酶添加量，通过比较k 值得到的最佳工艺条件为A2B1C4D3E1，该工艺不在正交设计试验中，且与正交试验中最佳工艺条件（A2B1C2D3E4）不同。因此对两种工艺进行验证，A2B1C4D3E1 条件下，多糖得率（1.399±0.010）%、三萜得率（1.169±0.051）%；而A2B1C2D3E4 条件下，多糖得率（1.570±0.026）%、三萜得率（1.635±0.020）%，综合评分为4.461 0。因此选择A2B1C2D3E4 为最佳工艺参数，即乙醇浓度40%、超声时间30 min、超声温度50 ℃、固液比1∶25 （g/mL）、酶添加量500 U/g。
2.3 多糖、三萜抗肝癌细胞活性研究
2.3.1 三萜和多糖对HepG2 的抑制作用
三萜和多糖对HepG2 的抑制作用见图6。
图6 三萜和多糖对HepG2 的抑制作用
Fig.6 Inhibitory effects of triterpenoids and polysaccharide on HepG2 cells
由图6 可知，灵芝菌柄多糖对HepG2 细胞表现出良好的抗肿瘤活性，抑制率最高可达（81.73±2.20）%。三萜对HepG2 细胞抑制率在浓度1 000 μg/mL 时达到最高，为（70.81±1.37）%，与文献[17]中的结果相似，多糖对HepG2 细胞表现出更强的抑制作用。
2.3.2 三萜和多糖对肾癌细胞CaKi-1 的抑制作用
三萜和多糖对肾癌细胞CaKi-1 的抑制作用见图7。
图7 三萜和多糖对CaKi-1 的抑制作用
Fig.7 Inhibitory effects of triterpenoids and polysaccharide on CaKi-1 cells
由图7 可知，多糖和三萜对CaKi-1 细胞均表现出较好的抑制效果，多糖对CaKi-1 细胞抑制率最高可达（71.39±2.73）%，而三萜对CaKi-1 细胞的抑制率最高可达到（87.61±2.77）%，且两种物质的抑制率均呈现明显量效关系，三萜对CaKi-1 细胞具有更好的抑制效果。
2.4 多糖红外表征结果
多糖红外表征结果见图8。
图8 多糖红外光谱表征结果
Fig.8 Infrared spectroscopy spectrum of polysaccharide
由图8 可知，在3 313.97 cm-1 处观察到—OH 伸缩振动，2 926.32 cm-1 为C—H 伸缩振动，1 409 cm-1为—OH 的弯曲振动，1 655.00 cm-1 则为
的变形吸收峰，1 241.03 cm-1 为C—N 的伸缩振动吸收峰。这些结果表明样品可能为蛋白糖。此外，1 031.04 cm-1的C—O 伸缩振动吸收峰被认为是吡喃糖的特征吸收之一[25-26]。由此可以推断该多糖为β-吡喃糖[25]， 该结果与文献[26]的研究结果基本一致。
2.5 多糖、三萜抗氧化活性研究
2.5.1 超氧阴离子自由基清除能力
多糖、三萜对超氧阴离子自由基的清除作用见图9。
图9 多糖、三萜对超氧阴离子自由基的清除作用
Fig.9 Scavenging effects of triterpenoids and polysaccharide on superoxide radicals
由图9 可知，在较高浓度下，多糖和三萜均表现出明显的自由基清除能力。在2.0 mg/mL 的浓度下，三萜的超氧阴离子自由基清除能力达到51%；而在4.0 mg/mL的浓度下，多糖的超氧阴离子自由基清除能力为47%。结果表明，随着多糖和三萜浓度的增加，超氧阴离子自由基清除率明显提高，且存在明显的量效关系。
2.5.2 羟基自由基清除能力
多糖、三萜对羟基自由基的清除作用见图10。
图10 多糖、三萜对羟基自由基的清除作用
Fig.10 Scavenging effects of triterpenoids and polysaccharide on hydroxyl radicals
由图10 可知，灵芝菌柄三萜对羟基自由基的清除能力随着三萜浓度的增加而增强。当三萜浓度达到4.0 mg/mL 时，其清除率可达到（77.65±0.72）%。相比之下，多糖对羟基自由基的清除能力相对较低，浓度达到4.0 mg/mL 时，羟基自由基清除率为（39.60±2.71）%。多糖和三萜的清除能力均低于维生素C，且略高于文献[23]中报道的结果。
2.5.3 DPPH 自由基清除能力
多糖、三萜对DPPH 自由基的清除作用见图11。
图11 多糖、三萜对DPPH 自由基的清除作用
Fig.11 Scavenging effects of triterpenoids and polysaccharide on DPPH radicals
由图11 可知，多糖和三萜对DPPH 自由基的清除能力较佳。在0.1～0.8 mg/mL 的多糖浓度范围内，清除率与浓度呈现明显的量效关系。整体而言，多糖的DPPH 自由基清除能力高于三萜。在较高浓度下，多糖和三萜的活性基本与维生素C 相当。当三萜浓度达到0.8 mg/mL 时，其DPPH 自由基清除率接近90%，而多糖的DPPH 自由基清除率达到（95.95±2.39）%。由此表明多糖和三萜均具有良好的抗氧化能力。
3 结论
本研究采用超声波-酶促辅助提取法对灵芝菌柄活性成分进行提取研究，经单因素试验及正交优化试验，最终确定灵芝菌柄多糖和三萜最优提取条件为超声时间30 min、固液比1∶25 （g/mL）、乙醇浓度40%、超声温度50 ℃、酶添加量500 U/g，在此最优提取工艺下，多糖得率为（1.570±0.026）%，三萜得率为（1.635±0.020）%，综合评分为4.461 0。
本研究还探讨了在最佳工艺条件下提取的灵芝菌柄多糖及三萜对HepG2 和CaKi-1 细胞的抗肿瘤活性。结果表明，灵芝菌柄多糖对HepG2 细胞的抑制率最高可达（81.73±2.20）%，而三萜对CaKi-1 细胞的抑制率最高达到（87.61±2.77）%。在不同浓度下，两者的抑制率均表现出良好的线性相关性。多糖对HepG2细胞的抑制效果优于三萜，三萜对CaKi-1 细胞的抑制效果更为显著。此外，在抗氧化能力方面，三萜类化合物在4.0 mg/mL 浓度下的羟基自由基清除率达到（77.65±0.72）%，而多糖的清除率为（39.60±2.71）%。在DPPH 自由基清除试验中，灵芝菌柄多糖和三萜均表现出良好的抗氧化活性，尤其在较高浓度下，其活性接近于维生素C。综上所述，灵芝菌柄的多糖和三萜均表现出良好的抗肿瘤和抗氧化活性，与相关灵芝子实体的研究结果基本一致，且略有提高。结果表明，灵芝菌柄的活性成分在新型抗肿瘤药物和抗氧化剂的开发中具有广阔的应用前景。
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