刺梨（Rosa roxburghii Tratt）为蔷薇科植物缫丝花的果实，又名文先果、送春归，在我国贵州、云南等地分布广泛，富含蛋白质、多糖、多酚，维生素等多种活性成分。其中刺梨多酚含量可达15.9 mg/g，VC 含量高达2 704 mg/100 g，在水果界被称为VC 之王，具有延缓衰老、抗氧化和抗炎等生物活性[1]。研究表明，刺梨中多酚、VC 等成分是其体外抗氧化活性的主要化学物质基础，是天然抗氧化补充剂的重要来源[2-3]。刺梨多酚、VC 等抗氧化活性成分的提取纯化常采用大孔树脂法、草酸溶液浸提法、超声辅助法和闪式提取法，但由于多酚和VC 等成分不稳定，溶液浸提时间较长易氧化损失，且大孔树脂等方法需消耗乙醇、甲醇等有机溶剂，成本较高而效率低，不适用于大批量工业化生产[4-6]。
膜分离法作为一种以压力为驱动[7]，根据分子量大小进行分离的新型分离技术，可以在较小的设备中连续工作，环保且材料无害。膜分离属于物理过程，不涉及相变，且无需加入其他试剂，尤其适用于分离加热易变性的热敏性物质，如Ghosh 等[8]采用微滤和超滤膜分离技术纯化印度黑莓汁中的花青素类成分。膜分离技术在果汁多酚、花青素、黄酮、VC 等抗氧化活性物质分离纯化领域已有应用，如Avram 等[9]通过纳滤膜分离法提取纯化蓝莓花青素；Arend 等[10]利用纳滤膜浓缩草莓汁中的酚类化合物，但直接采用膜分离技术从刺梨汁中纯化小分子抗氧化活性物质还未见报道。
因此，本研究采用三级组合膜分离技术富集刺梨小分子抗氧化活性成分。将超滤、纳滤和反渗透膜组合直接用于刺梨小分子抗氧化活性成分的分离、纯化和浓缩。从5 种不同截留分子量的聚乙烯膜中筛选合适的超滤膜，并通过单因素结合响应面试验优化超滤工艺参数；从2 种不同截留分子量的纳滤膜中筛选合适的纳滤膜，并通过单因素试验优化纳滤参数；经反渗透膜浓缩得膜分离提取物，并采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）技术分析膜分离提取物的化学组成，建立稳定、高效、适合工业化的刺梨多酚、VC 等小分子抗氧化活性成分的富集工艺，以期为刺梨天然抗氧化活性成分的开发利用提供参考及实践依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刺梨原汁：贵州金维宝生物技术公司；VC 标准品（色谱纯）：贵州迪大科技有限责任公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：安徽天地高纯溶剂有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；乙二胺四乙酸二钠、三（羟甲基）氨基甲烷、水杨酸、邻苯三酚：北京索莱宝科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]：上海梯希爱化成工业发展有限公司；硫酸、苯酚、盐酸（均为分析纯）：重庆江川化工有限公司；氢氧化钠、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津致远化学试剂有限公司；超滤膜、纳滤膜、反渗透膜：山东博纳生物科技集团有限公司。
1.2 仪器与设备
Cary-60-UV-Vis 紫外-可见分光光度计、1100 高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；ZWY-2102 恒温振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；N-1300DWB 旋转蒸发仪：上海爱郎仪器有限公司；YELA 东京理化冻干机：东京理化器械株式会社；BONA-GM-19 膜分离反渗透分离试验机：山东博纳生物科技集团有限公司。
1.3 方法
1.3.1 刺梨汁的制备
取适量刺梨原汁，于5 000 r/min 离心预处理10 min，真空抽滤，得澄清透明的刺梨汁。
1.3.2 膜分离试验
取适量澄清刺梨汁作为进料液加至膜分离设备5 L料液罐中，经高压泵错流通过膜组件，从膜组件外侧出口端流出透过液，截留液循环回料液罐中继续过滤至透过80%时停止，收集相应的截留液、透过液，并记录总体积和膜通量。工艺流程如图1 所示。
图1 膜分离试验流程图
Fig.1 Flow chart of membrane separation
1.3.3 膜清洗和污染指数
参考Arend 等[10]的方法略作改动，每次过滤完样品按以下步骤洗膜：1）去离子水低压循环冲洗去除残留物料，至洗出液无色；2）超滤膜用2%、纳滤膜0.5%的40 ℃氢氧化钠溶液低压循环10～30 min，至洗出碱液无色后测膜通量，恢复至过膜前的90% 即可；3）去离子水清洗至中性，记录去离子水的膜通量和总固体截留率。按下列公式计算膜通量（J，mL/min）、膜污染指数（R，%）和总固体截留率（D，%）。
式中：V 为透过液体积，mL；T 为取样时间，min。
式中：V0 为初始纯水渗透通量，mL/min，V1 为过样后纯水通量，mL/min。
式中：W0 为进料液中总固体含量，mg/g；W1 为透过液中总固体含量，mg/g。
1.3.4 筛选合适截留分子量的超滤膜
取澄清刺梨汁稀释20 倍得3 L 进料液，于常温条件下以0.5 MPa 分别通过截留分子量为100、50、10、5、2 kDa 的超滤膜，收集透过液，并记录体积[11]。以透过液中VC 和多酚的透过率、多糖和蛋白质的截留率及平均膜通量为指标，筛选较合适的超滤膜[12-13]。VC 透过率（P1，%）、多酚透过率（P2，%）、多糖截留率（Q1，%）、蛋白质截留率（Q2，%）、多糖透过率（P3，%）和平均膜通量（J0，mL/min）按下列公式计算。
式中：W2 为进料液中VC 含量，g/mL；W3 为透过液中VC 含量，g/mL。
式中：W4 为进料液中多酚含量，g/mL；W5 为透过液中多酚含量，g/mL。
式中：W10 为进料液中多糖含量，g/mL；W11 为透过液中多糖含量，g/mL。
式中：W6 为进料液中多糖含量，g/mL；W7 为透过液中多糖含量，g/mL。
式中：W8 为进料液中蛋白质含量，g/mL；W9 为透过液中蛋白质含量，g/mL。
式中：J1、J2、J3 分别为过滤过程的前中后时间段的膜通量，mL/min。
1.3.5 超滤操作条件优化
1.3.5.1 超滤单因素考察
通过在料液罐外接冷阱控制循环液的温度，以避免压力泵长时间运行发热引起温度变化。选择跨膜压力、稀释倍数、过滤体积和过膜温度进行单因素试验。考察各因素对小分子VC 透过率、多糖透过率和平均膜通量的影响，试验设计见表1。
表1 超滤单因素试验设计
Table 1 Single factor experimental design of ultrafiltration
单因素条件跨膜压力（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 MPa）稀释倍数（15、20、25、30、35）过滤体积（5、6、7、8、9 L）过膜温度（10、15、20、25、30 ℃）其他固定条件稀释20 倍，过膜温度20 ℃，过滤体积5 L跨膜压力0.4 MPa，过膜温度20 ℃，过滤体积5 L跨膜压力0.4 MPa，稀释20 倍，过膜温度20 ℃跨膜压力0.4 MPa，稀释20 倍，过滤体积5 L
1.3.5.2 超滤响应面试验设计
根据单因素试验所得结果，选择稀释倍数、跨膜压力、过滤体积进行响应面试验，以VC 透过率为指标，设定三因素三水平，优化超滤工艺参数。超滤因素与水平见表2。
表2 超滤因素与水平
Table 2 Factors and levels of ultrafiltration
水平-1 01因素A 稀释倍数15 20 25 B 跨膜压力/MPa 0.2 0.4 0.6 C 过滤体积/L 567
1.3.6 纳滤工艺研究
1.3.6.1 筛选纳滤膜
收集超滤透过液[14-15]，平均分成两份，以0.8 MPa压力分别通过800 Da 和500 Da 的纳滤膜，得到的纳滤透过液由反渗透膜浓缩后冻干。以纳滤截留液、纳滤透过液和反渗透膜浓缩样品的自由基清除率、酪氨酸酶抑制率及平均膜通量为指标，筛选能分离出具有较强抗氧化活性提取物的纳滤膜。DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率参考Lapčík 等[16]和Xu 等[17]的方法测定；酪氨酸酶抑制率参考Alshammari 等[18]的方法测定。
1.3.6.2 纳滤压力单因素考察
使5 kDa 超滤透过液分别以0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 MPa 通过纳滤膜，探讨不同纳滤压力对过膜后VC损失率和膜污染的影响。
1.3.6.3 过滤终点判断
以透过液中VC 损失率为指标确定过滤终点。当透过液体积达到进料液的80%时，加进料液体积10%的去离子水继续过滤，当透过80%时加第1 次水继续过滤至透过80% 时加第2 次水继续过滤，透过80%时再加第3 次水继续过滤，收集全部透过液，测VC 含量并计算损失率（L，%）。
式中：W12 为进料液中VC 含量，g/mL；W13 为取样时透过液中的VC 含量，g/mL。
1.3.7 指标测定
按照Folin-Ciocalteu 福林酚比色法[19]测定多酚含量；采用苯酚-硫酸法测多糖含量[20]；采用凯氏定氮法测蛋白含量[21]；参照钱志瑶等[22]的高效液相色谱法测定刺梨VC 的含量。
1.3.8 LC-MS/MS 分析
参考邝铭晴等[23]的方法将刺梨提取物注入液相串联质谱仪中检测分析。
1.4 数据分析
本试验所有数据均重复测定3 次，并使用Microsoft Excel 365 和 SPSS 18.0 进行统计处理和误差分析，Graphpad prism 8.0 软件作图，试验结果以平均值±标准差表示。采用Design-Expert 8.0.6 响应面模型回归分析。
2 结果与分析
2.1 离心预处理对超滤效率的影响
刺梨原汁的离心和未离心预处理对超滤效率的影响见图2。
图2 离心与未离心对VC 透过率、总固体截留率和膜污染指数的影响
Fig.2 Effects of centrifugation and no centrifugation on VC permeation rate， total solids retention， and membrane contamination index
由图2 可知，离心后超滤VC透过率为（85.60±1.60）%，未离心的VC 透过率较低，为（76.69±1.00）%。离心预处理提高了刺梨汁中VC 的透过率和总固体截留率，同时减少了超滤膜污染指数。这可能是离心去除了部分细小颗粒从而减少了过滤过程中的结垢倾向。因此选择超滤前先离心预处理以提高过滤效率。
2.2 不同截留分子量超滤膜的分离效率
不同截留分子量超滤膜对刺梨进料液主要成分的截留和透过情况见表3，对VC、多糖透过率和平均膜通量的影响见图3。
表3 不同截留分子量超滤膜对主要成分的截留和透过情况
Table 3 Retention and permeation of major components by ultrafiltration membranes with varying molecular weight cut-offs
截留分子量/kDa 100 50 10 52蛋白质截留率/%92.68 94.30 97.37 98.78 98.85多糖截留率/%13.28 17.51 20.46 44.72 55.80多酚透过率/%61.25 60.31 59.77 56.39 47.67
图3 不同截留分子量超滤膜对多糖、VC 透过率和平均膜通量的影响
Fig.3 Effects of ultrafiltration membranes with different molecular weight cut-offs on the permeation rates of polysaccharide and VC and the average membrane flux
由表3 和图3 可知，随着超滤膜截留分子量的减小，大分子蛋白质和多糖的截留率逐渐增加，说明超滤在去除刺梨汁中蛋白质和多糖方面有优势。多酚透过率随截留分子量降低逐渐减少，说明刺梨中的多酚含有部分大分子或与蛋白等其他成分以多分子缔合态形式存在。随着截留分子量减小，VC 透过率先增大后减小，并在5 kDa 时透过率最大，这可能是由于截留分子量较大时，膜孔径大，大分子易进入膜孔将部分小分子VC 阻留在孔内。当截留分子量为2 kDa 时，大量大分子物质无法过膜而堵住膜面，使小分子成分部分截留而降低平均膜通量。当截留分子量由50 kDa 减少到2 kDa 时，平均膜通量随之降低，这可能是由于截留分子量越小越容易造成膜污染，因此选择5 kDa 的超滤膜，在去除大分子蛋白质多糖的同时，保证小分子多酚、VC 以较大膜通量过膜。
2.3 超滤单因素对膜分离效率的影响
2.3.1 不同跨膜压力对超滤分离效率的影响
不同跨膜压力对多糖透过率、VC 透过率和平均膜通量的影响见图4。
图4 不同跨膜压力对多糖、VC 透过率和平均膜通量的影响
Fig.4 Effects of different transmembrane pressure on the permeation rates of polysaccharide and VC and the average membrane flux
由图4 可知，VC 透过率随跨膜压力升高而逐渐增加，在0.5 MPa 时最大，为73.26%，跨膜压力继续增加导致更多大分子沉积堵塞膜孔，使VC 的过滤阻力增加而降低其透过率。膜面沉积物在较高压力下不断增厚、变实，使过滤阻力增加，因此当跨膜压力增加到0.4 MPa后平均膜通量随之降低，当跨膜压力继续增加至0.6 MPa时，由于较高的压力驱动使膜通量增加，但膜污染进一步严重，导致VC 和多糖的透过率均减少。随跨膜压力由0.2 MPa 增加至0.5 MPa，多糖透过率出现先减小后增大的趋势，在0.6 MPa 时多糖透过率降到最低。综合考虑，选择0.2、0.4、0.6 MPa 进行后续响应面试验，以确保在尽可能多去除多糖的同时，保证VC 以较高膜通量过膜。
2.3.2 不同稀释倍数对超滤分离效率的影响
不同稀释倍数对多糖透过率、VC 透过率和平均膜通量的影响如图5 所示 。
图5 不同稀释倍数对多糖、VC 透过率和平均膜通量的影响
Fig.5 Effects of different dilution factors on the permeation rates of polysaccharide and VC and the average membrane flux
由图5 可知，平均膜通量随稀释倍数增加而增大，这可能是因为稀释倍数增加使进料液的黏度减少，膜面发生浓差极化的程度降低。当稀释倍数由15 倍增加到30 倍时，VC 透过率先增大后趋于平稳，在稀释20 倍时透过率最高，当稀释倍数继续增加至35 倍时，稀释的用水量和过滤总体积增加，压力泵运行时间较长使料液温度升高，导致部分VC降解损失，同时会使料液中的一些物质吸附、沉积、凝胶化于膜表面影响VC和多糖的透过效率。多糖的透过率随稀释倍数的增加先增大后减少，在稀释25 倍时，多糖透过率达最大。因此选择稀释倍数为15、20、25 进行后续响应面试验。
2.3.3 不同过滤体积对超滤分离效率的影响
不同过滤体积对多糖透过率、VC 透过率和平均膜通量的影响如图6 所示。
图6 不同过滤体积对VC 透过率和平均膜通量的影响
Fig.6 Effects of different filtration volumes on the permeation rate of VC and the average membrane flux
由图6 可知，平均膜通量和多糖透过率随过滤体积增大而减小，过滤体积越大刺梨中的多糖、蛋白质等成分在膜面积累得越多导致膜污染逐渐增加，从而使多糖透过率降低。过滤体积由5 L 增加到7 L 时，VC的透过率先增加后减小，当过滤体积继续增加至9 L时，压力泵运行时间变长而发热使循环的液体升温，增加了膜表面分子的运动，而使VC 的透过率增加。但过滤8、9 L 时，膜污染严重，平均膜通量较低，因此选择过滤体积为5、6、7 L 进行后续响应面试验，以保障分离结果的重现性和准确性。
2.3.4 不同过膜温度对超滤分离效率的影响
不同过膜温度对VC 透过率和平均膜通量的影响如图7 所示。
图7 不同过膜温度对VC 透过率和平均膜通量的影响
Fig.7 Effects of different transmembrane temperatures on the permeation rate of VC and the average membrane flux
由图7 可知，当过膜温度由10 ℃增加至20 ℃时，循环液的黏度降低使VC 透过率增加。当过膜温度继续升高时，高温环境可能会加速VC 的降解损失，导致其透过率降低。常温过滤过程中，循环液体温度由于压力泵的运行发热从15 ℃逐渐增加至25 ℃，而15～25 ℃时VC 透过率变化不大。同时过膜温度10～30 ℃对刺梨多糖的浸提影响较小因此不考察刺梨多糖的透过率。综合选择过膜温度在常温20 ℃左右过滤即可。
2.4 超滤操作参数响应面优化试验
2.4.1 响应面优化试验
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken 试验，对超滤操作参数进行优化。以稀释倍数（A）、跨膜压力（B）、过滤体积（C）为自变量，以VC 透过率（Y）为响应值，进行三因素三水平响应面优化试验，对试验方案中17 组试验进行研究，得到的结果如表4 所示。
表4 响应面试验设计与结果
Table 4 Response surface design and test results
试验号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 A 稀释倍数15 25 25 20 20 20 20 20 25 20 15 20 15 15 20 20 25 B 跨膜压力/MPa 0.6 0.2 0.4 0.4 0.2 0.4 0.6 0.2 0.6 0.4 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.6 0.4 C 过滤体积/L 66565677666675657 Y VC 透过率/%71.32 66.03 76.87 90.15 59.99 86.70 84.65 63.67 89.36 87.89 56.78 85.83 72.80 66.13 89.60 79.03 81.36
运用Design-Expert 8.0.6 软件对试验结果进行回归分析，得到VC 透过率的回归方程：Y=88.03+5.82A+9.74B+2.56C+2.20AB-0.546 3AC+0.484 3BC-7.35A2 -9.81B2-6.39C2。
2.4.2 响应面模型的方差分析及交互作用
响应面模型的方差分析见表5，稀释倍速、跨膜压力及过滤体积之间的交互作用如图8 所示。
表5 拟合回归模型方程的方差分析
Table 5 Analysis of variance of the regression equation
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源模型ABCA B AC BC A2B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和1 998.62 271.39 758.41 52.34 19.32 1.19 0.938 0 227.74 405.00 171.99 22.56 8.99 13.57 2021.18自由度911111111 17341 6均方222.07 271.39 758.41 52.34 19.32 1.19 0.938 0 227.74 405.00 171.99 3.22 3.00 3.39 F 值68.90 84.21 235.32 16.24 5.99 0.3703 0.291 0 70.67 125.66 53.37 0.882 6 P 值＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.005 0 0.044 2 0.562 0 0.606 3＜0.000 1＜0.000 1 0.000 2 0.521 8显著性***************
图8 跨膜压力、稀释倍数、过滤体积的交互作用
Fig.8 Interactions between transmembrane pressure， dilution factor， and filtration volume
由表5 可知，模型的F 值为68.90，P 值＜0.000 1，说明该模型极显著。失拟项不显著（P=0.882 6，P＞0.05），R2 =0.988，说明该模型拟合度好，可进行响应值的预测。由回归方程可知，交互项AB 的影响显著，一次项A、B、C 和二次项A2、B2 的影响极显著。由表5 和图8可知，3 个因素对VC 透过率的影响大小依次为B 跨膜压力＞A 稀释倍数＞C 过滤体积。
由图8 可知，VC 透过率随稀释倍数、过滤体积呈现先增加后减少的趋势、随跨膜压力增加而增加，表明跨膜压力对VC 透过率的影响较大。采用Design-Expert 8.0.6 软件的响应优化功能对试验结果进行优化，得到超滤工艺为稀释20 倍、跨膜压力0.4 MPa、过滤体积6 L，理论计算VC 透过率为90.15%。在此基础上进行验证试验，实测透过率为88.9%，与预测值较接近。
2.5 纳滤纯化工艺优化结果
2.5.1 不同纳滤膜对活性部位的分离效果
500 Da 和800 Da 纳滤膜分离样品对DPPH·清除率、ABTS+自由基清除率和酪氨酸酶的抑制率如图9 所示。
图9 不同纳滤样品的DPPH·清除率、ABTS+自由基清除率、酪氨酸酶抑制率
Fig.9 DPPH radical scavenging， ABTS+ radical scavenging， and tyrosinase inhibition of different nanofiltration samples
800 D 截、800 D 透分别为800 Da 膜的截留液和透过液；800 D 反截为800 Da 膜透过液的反渗透浓缩液；500 D 截、500 D 透分别为500 Da 膜的截留液和透过液；500 D 反截为500 Da 膜透过液的反渗透浓缩液。
由图9 可知，500 Da 膜的截留液和透过液的DPPH、ABTS+自由基清除率和酪氨酸酶抑制率均高于800 Da膜的截留液和透过液，且800 Da 和500 Da 膜的透过液DPPH、ABTS+自由基清除率都高于其截留液。经过反渗透浓缩的500 Da 和800 Da 膜透过液的反渗透浓缩液浓度升高，对DPPH、ABTS+自由基的清除率也明显增加。不同纳滤样品对酪氨酸酶抑制率的规律与其对DPPH、ABTS+自由基清除率一致，使用500 Da 膜纳滤的样品对酪氨酸酶抑制率高于对应800 Da 膜纳滤样品。由于反渗透膜浓缩过程造成了部分活性小分子的损失使其中500 Da 膜透过液的反渗透浓缩液的酶抑制率略低于500 Da 膜的透过液。结果表明，500 Da纳滤膜分离得到的样品具有更强的自由基清除力和酪氨酸酶抑制活性，因此选择500 Da 膜进行纳滤试验。
2.5.2 不同操作压力对纳滤效率的影响
不同纳滤操作压力对VC 损失率和膜污染指数的影响如图10 和图11 所示。
图10 不同纳滤操作压力对VC 损失率的影响
Fig.10 Effect of nanofiltration pressure on the VC loss rate
图11 不同纳滤操作压力对膜污染指数的影响
Fig.11 Effect of nanofiltration pressure on the membrane contamination index
由图10、图11 可知，随着压力升高，VC 损失率和膜污染指数都呈先减小后增大的趋势。压力升高，大量物质被压力驱动过膜，透过率增加，被截留损失的量少，但当压力增加到1.2 MPa 时，较大分子量的物质在膜面堵塞膜孔，阻碍小分子物质正常过膜，而使其被沉积在膜面或堵在膜孔里使膜污染指数增加，造成VC 损失增加。当压力为0.8 MPa 时VC 损失率和膜污染指数都较低，因此选择0.8 MPa 作为纳滤操作压力。
2.6 过滤终点判断
水洗次数对超滤、纳滤透过液中VC 损失率的影响见表6。
表6 水洗次数对超滤、纳滤透过液中VC 损失率的影响
Table 6 Effect of flushing times on the VC loss rate in ultrafiltration and nanofiltration permeates
水洗次数0123 VC 损失率/%超滤39.59 19.48 20.44 19.46纳滤36.48 31.55 27.98 19.19
由表6 可知，超滤和纳滤经水洗后损失率均显著降低，超滤在加水洗1 次和洗2、3 次后VC 的损失率差异较小，因此选择在超滤后加水冲洗1 次作为过滤终点，即可降低大部分小分子VC 的损失，同时节约用水量。而纳滤由于膜孔径较小，除体系内残留的物质，膜孔内亦有残留，因此再加水冲洗1、2、3 次都有物质被冲洗出来，当加水洗3 次时，大部分的物质已经洗出，因此纳滤冲洗3 次为其过滤终点。
2.7 组合膜分离提取物成分分析
500 Da 截留液和500 Da 透过液中活性成分的LCMS/MS 代表性色谱图如图12 所示，活性成分的定性分析如表7、表8 所示。
表7 刺梨500 Da 截留液中活性成分的LC-MS/MS 定性
Table 7 LC-MS/MS characterization of chemical components in the 500 Da cut-off liquid of Rosa roxburghii Tratt
化合物L-精氨酸γ-氨基丁酸D-葡萄糖酸柠檬酸甘油磷酰胆碱右旋奎宁酸化学式C6H14N4O2 C4H9NO2 C6H12O7 C6H8O7 C8H20NO6P C7H12O6分子量/Da 157.085 121.074 196.057 192.026 219.146 192.062保留时间/min 0.758 0.805 0.819 0.872 0.884 0.985峰面积最大值（×106）13.573 18.149 16.424 31.189 62.537 14.638化合物脱落酸原儿茶醛香豆素柯里拉京党参炔苷鞣花酸化学式C15H20O4 C7H6O3 C9H6O2 C27H22O18 C20H28O8 C14H6O8分子量/Da 264.136 138.031 164.047 634.079 442.183 302.005保留时间/min 9.159 9.272 9.702 9.829 13.373 13.44峰面积最大值（×106）13.887 14.279 21.394 13.293 24.016 70.099
续表7 刺梨500 Da 截留液中活性成分的LC-MS/MS 定性
Continue table 7 LC-MS/MS characterization of chemical components in the 500 Da cut-off liquid of Rosa roxburghii Tratt
化合物乳糖蔗糖L-亮氨酸原花青素B1（+）-儿茶素化学式C12H22O11 C12H22O11 C6H13NO2 C30H26O12 C15H14O6分子量/Da 388.120 342.115 131.095 578.141 290.078保留时间/min 1.033 1.102 1.521 8.459 9.067峰面积最大值（×106）16.264 17.227 13.378 24.454 20.288化合物甘草次酸具栖冬青苷野蔷薇苷苯甲酸化学式C30H46O4 C36H58O10 C36H58O10 C7H6O2分子量/Da 488.350 696.407 650.402 122.036保留时间/min 19.694 20.027 20.027 49.78峰面积最大值（×106）18.852 10.885 87.007 24.495
表8 刺梨500 Da 透过液中活性成分的LC-MS/MS 定性
Table 8 LC-MS/MS characterization of active compounds in the 500 Da permeate of Rosa roxburghii Tratt
化合物三七素5-羟甲基糠醛右旋奎宁酸L-脯氨酸柠檬酸L-亮氨酸L-抗坏血酸表没食子儿茶素原花青素B1表儿茶素苯甲酸原儿茶醛香豆素白果内酯龙胆苦苷7-羟基-4-甲基香豆素鞣花酸具栖冬青苷野蔷薇苷吉马酮化学式C5H8N2O5 C6H6O3 C7H12O6 C5H9NO2 C6H8O7 C6H13NO2 C7H6O5 C15H14O7 C30H26O12 C15H14O6 C7H6O2 C7H6O3 C9H6O2 C15H18O8 C16H20O9 C10H8O3 C14H6O8 C36H58O10 C36H58O10 C15H22O分子量/Da 193.973 126.032 192.062 115.063 192.026 131.095 170.020 306.073 578.141 290.078 105.010 138.032 164.047 326.099 356.110 176.046 302.005 696.406 686.377 218.167保留时间/min 0.693 0.862 0.903 1.018 1.27 1.551 1.917 3.698 8.846 9.163 9.172 9.291 9.717 10.279 10.72 10.753 13.456 19.362 19.691 26.895峰面积最大值（×106）26.698 14.433 11.342 45.708 49.928 17.751 68.462 22.551 34.846 48.616 73.420 66.370 28.657 14.893 10.688 53.777 32.799 57.251 14.933 21.868
图12 500 Da 截留液和500 Da 透过液在正离子和负离子模式下的基峰色谱图
Fig.12 Base peak chromatograms of the 500 Da cut-off liquid and the 500 Da permeate in positive and negative ion modes
A. 500 Da 截留液在正离子模式下的基峰色谱图；B. 500 Da 截留液在负离子模式下的基峰色谱图；C. 500 Da 透过液在正离子模式下的基峰色谱图；D. 500 Da 透过液在负离子模式下的基峰色谱图。
由图12、表7 和表8 可知，500 D 截留液和透过液中分别含有21 种和20 种化合物，500 D 截留液和透过液中都含有VC、柠檬酸、鞣花酸等有机酸和原花青素 B1、儿茶素等黄酮类化合物。这与过膜前后总多酚和VC 的透过率结果一致，刺梨汁经组合膜分离，VC、多酚等小分子抗氧化活性成分被保留和富集。
3 讨论与结论
本试验先通过离心预处理去除部分悬浮的固体颗粒得澄清刺梨汁进料液，再采用超滤去除大分子多糖、蛋白质等成分，随后用纳滤膜分离产生了富含酚类的500 Da 截留液和富含VC 的500 Da 透过液，最后采用反渗透膜浓缩得到富含VC 的浓缩液。试验根据不同成分截留率和透过率筛选出5 kDa 超滤膜，并通过响应面试验优化参数为刺梨汁稀释20 倍，跨膜压力0.4 MPa、过滤体积6 L；根据DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率和酪氨酸酶抑制率筛选出500 Da 纳滤膜，优化操作压力为0.8 MPa，最后通过水洗进一步减少活性成分的损失，利于膜通量的恢复。
试验优化的超滤-纳滤-反渗透三级组合膜工艺对刺梨不稳定成分的提取分离和浓缩有较大优势，全程常温操作，有利于保留刺梨汁中的热敏性物质。纳滤和反渗透浓缩产生富含酚类和VC 的小分子抗氧化活性部成分，可用于后续食品、药品和化妆品的开发。研究结果初步表明组合膜分离技术成本低，易于连续化且常温操作，对刺梨中不稳定的小分子抗氧化活性成分如VC、多酚等的开发利用具有重要的实践意义。
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