芒果（Mangifera indica Linn）又称闷果、蜜望子等[1]，属于漆树科植物，为著名热带水果之一，集热带水果精华于一身，被誉为“热带水果之王”[2-3]。芒果有益胃、止呕、防晕的功效[4-5]。广西芒果资源丰富，栽培面积和产量居全国第二，具有重要的经济和社会价值，但芒果深加工率较低，主要原因在于占原料30%～60%的废弃物芒果核无法加以利用[6]。国内外学者针对芒果果肉及芒果副产物（芒果皮、芒果核等）开展研究发现其大部分多酚物质具有很高的研究价值，如没食子酸、鞣花酸、芒果苷、酚酸、单宁、丁香酸、类黄酮等[7-11]化合物具有抗炎[12-13]、止咳祛痰[14]、抑菌[15]、抗氧化活性[16-18]、抗糖尿病[18]等功效。芒果核是蒙医习用药之一，具有很高的药用价值，最初发现芒果核中富含脂肪酸[19]，继而分析芒果核脂肪酸组成、含量和特征均存在广泛变化，从而延伸至芒果核酚类物质、脂肪酸及氨基酸等营养成分的研究[20]。国内外研究学者对芒果核多酚物质做了部分研究，发现其具有很高的研究价值[12-17]，如强抗氧化性、抗炎症、抗肿瘤、抗癌、抑菌等生理活性，本课题组前期对芒果核多酚化合物成分提取分离鉴定进行研究[5，21]，结果表明芒果核多酚提取物具有抗氧化性、抑菌活性等，同时发现芒果核的某些多酚物质如鞣花酸的含量近似甚至超过抗氧化之王石榴[21]，继而对芒果核多酚提取物（polyphenol extract，PO）及纯度较高的鞣花酸（ellagic acid，EA）进行二甲苯诱导小鼠耳肿胀、足肿胀模型建立时发现，PO 和EA具有较好的抗炎症作用，当给药剂量分别达0.5 g/kg和0.1 g/kg 时，其对小鼠耳肿胀与足肿胀的抑制效果与20 mg/kg 的阳性药吲哚美辛相当。鞣花酸（EA）是鞣质类化合物中最具代表性的单体，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗突变和抗致癌等活性[22]，研究表明EA能够通过抑制核因子激活的B 细胞的κ-轻链增强（nuclear factor-κB，NF-κB）、环氧合酶及炎性因子的释放而发挥显著的抗炎作用，EA 对脂肪细胞脂质代谢具有促进作用。但目前关于EA 对非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）中炎症及氧化应激的研究较少[22-23]，其抗炎作用物质基础及抗炎作用机制仍不明确。本试验以芒果核多酚提取物和鞣花酸为研究对象，建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导RAW264.7 体外炎症模型，评价芒果核多酚提取物（PO）和鞣花酸（EA）的抗炎活性；从分子水平探究PO及EA 抑制NF-κB 信号通路而发挥的抗炎作用，以期为芒果资源的深度开发、PO 及EA 作为天然来源的抗炎活性成分提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7：广州赛库生物技术有限公司；DMEM 培养基（高糖）、10% 胎牛血清、RPMI-1640 培养基（含双抗）、超纯总RNA 提取试剂盒、Bio-RT 逆转录扩增试剂盒：美国Thermo Fisher Scientific 公司；反转录试剂盒、聚合酶链式反应荧光定量试剂盒：日本TaKaRa 公司；脂多糖、吲哚美辛、细胞活力检测试剂（cell counting kit-8，CCK-8）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、地塞米松（dexamethasone，DXMS）、NF-κB 抑制剂Bay-11-7082、酶联免疫吸附检测试剂盒、噻唑蓝[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]检测试剂盒：上海碧云天生物技术股份有限公。
1.2 仪器与设备
数显电热恒温水浴锅（LC-WB-6）：上海析达仪器有限公司；生化培养箱（LRH-150）：上海捷呈实验仪器有限公司；超声波清洗器（SK3310LHC）：上海科导超声仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（D37520）、酶标仪（Varioska）、CO2 恒温培养箱（3111 型）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）仪（CFX96）：美国伯乐公司；奥林巴斯倒置显微镜（CKX31SF）：北京瑞科中仪科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 芒果核多酚提取物、鞣花酸的制备
芒果核多酚提取物、鞣花酸的制备方法参照已有研究内容并进行部分修改[5，24]，将芒果核干燥粉碎后，加入70% 乙醇回流浸提后采用AB-8 大孔树脂纯化、浓缩，喷雾干燥制得芒果核多酚提取物；同样将芒果核干燥粉碎后，加乙醇浸提后经大孔树脂纯化，再利用硅胶柱层析进行分离纯化，浓缩干燥制备得到纯度高于90%的鞣花酸。
1.3.2 RAW264.7 细胞的培养
接种RAW264.7 细胞至含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基（含双抗），于含5% CO2 的恒温培养箱中37 ℃培养至细胞对数生长期后，以2×104 个/mL 接种于96 孔板继续培养，12 h 后弃去培养液。
1.3.3 LPS、芒果核多酚提取物和鞣花酸对细胞的毒性作用
参考安妮[25]的方法将小鼠腹腔巨噬细胞悬液加入到96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，设空白（CK）组、不同浓度LPS 组和不同浓度的试验组，每组设3 个复孔，细胞贴壁纯化后空白组加入100 μL RPMI-1640 培养基。LPS 组每孔加入100 μL 不同浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL）的LPS，试验组PO 每孔加入100 μL 不同浓度的PO 溶液，终浓度分别为0、40、80、120、160、240、320、400 μg/mL，试验组EA 每孔加入100 μL 不同浓度的EA 溶液，终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35 μg/mL，分别在37 ℃、5% CO2 恒温培养箱中继续培养24 h，按照MTT 检测试剂盒说明书进行测定。
1.3.4 PO 和EA 对LPS 诱导RAW264.7 细胞的影响
将RAW264.7 细胞以5×103/孔接种至96 孔板中，100 μL/孔，于倒置显微镜下观察细胞是否铺板均匀，置5% CO2 培养箱中37 ℃培养24 h。设置对照组（未加LPS）作为校正，模型组作为阴性对照，PO（150.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL）组、EA（20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL）组和吲哚美辛（15.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL）组作为试验组，除对照组外，其余各组加入100 μL LPS（1 μg/mL），相同处理设置3 个复孔。继续培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育1 h 后，测定OD450 nm 值，按照以下公式计算细胞存活率（X，%）。采用回归分析计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）[26]。
式中：A0 为对照组吸光度；A1 为试验组吸光度；A2为模型组吸光度。
1.3.5 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测炎性因子水平
取1.3.2 培养的细胞，分别设对照空白组（CK）、模型组（DXMS）、LPS 组和试验组。CK：加入RPMI-1640培养基；DXMS：100 μg/mL 地塞米松预处理后，加入终浓度1 μg/mL 的LPS 诱导细胞；LPS 组：加入1 μg/mL的LPS；试验组PO：0～100 μg/mL PO 预处理后，添加1 μg/mL 的LPS；试验组EA：0～10 μg/mL EA 预处理后，添加1 μg/mL 的LPS，5% CO2 恒温培养箱37 ℃培养24 h 后，收集细胞上清液，用ELISA 试剂盒测定上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）水平。
1.3.6 实时荧光定量PCR 检测TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 mRNA 的表达量
采用荧光定量PCR 测定1.3.5 各处理组（高浓度）细胞中各炎性因子mRNA 表达量。其中模型组改为加入10 μmol/L NF-κB 抑制剂Bay-11-7082，记为Bay组；样品中RNA 提取、反转录、定量方法分别按试剂盒说明书操作。
RNA 逆转录成cDNA：参考Bio-RT 逆转录扩增试剂盒说明书。
引物设计与合成：参照文献[5-6]确定试验引物核苷酸序列，在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行序列比对，引物由上海生工生物技术公司合成。引物信息见表1。
表1 引物信息
Table 1 Primers of information
引物名称TNF-α F TNF-α R IL-1β F IL-1β R COX-2 F COX-2 R IL-6 F IL-6 R IL-10 F IL-10 R引物序列5′-AATGAGGCTGGATAAGAT-3′5′-AGAGGTTCAGTGATGTAG-3′5′-CCTCGTGCTGTCGGACCCAT-3′5′- CAGGCTTGTGCTCTGCTTGTGA-3′5′- AAATGCTGGTGTGGAAGGTG-3′5′- GAAGTTCAGTTCAGCCTGGCAAGTCT-3′5′-ACAAGAAAGACAAAGCCAGAGT-3′5′-TGCCGAGTAGATCTCAAAGTG-3′5′-AAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCA-3′5′-TGAAAGGACACCATAGCAAAGGGC-3′
1.3.7 芒果核多酚提取物和鞣花酸的抑菌作用
参照文献[5-6]进行芒果核多酚提取物和鞣花酸的抑菌圈直径、最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）检测。
1.4 数据分析
所有试验均重复3 次，数据采用Origin 9.0 进行分析。
2 结果与分析
2.1 PO、EA 和LPS 对 RAW264.7 细胞的毒性作用
PO、EA 和LPS 对 RAW264.7 细胞的毒性作用如图1～图3 所示。
图1 PO 对RAW264.7 细胞的毒性作用
Fig.1 Toxicity of polyphenol extract （PO） to RAW264.7 cells
不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
图2 EA 对RAW264.7 细胞的毒性作用
Fig.2 Toxicity of ellagic acid （EA） to RAW264.7 cells
不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
图3 LPS 对RAW264.7 细胞的毒性作用
Fig.3 Toxicity of lipopolysaccharide （LPS） to RAW264.7 cells
不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
当 RAW264.7 细胞暴露于具有细胞毒性的物质时，会呈现出一系列明显的变化，如细胞活力会受到显著影响，具有细胞毒性的物质往往会抑制细胞的代谢过程，降低细胞的增殖速率，甚至导致细胞死亡。当RAW264.7 细胞暴露于高浓度的具有细胞毒性的物质时，细胞的代谢活性可能会急剧下降，增殖能力几乎完全丧失。由图1～图3 可知，当PO 浓度为0～120 μg/mL时，对 RAW264.7 细胞未产生明显毒性作用，浓度为160 μg/mL 时，开始对细胞活力产生了抑制，且在浓度为 400 μg/mL 时，抑制效果更加明显，表明 PO 在较低浓度时相对安全，而随着浓度的升高，其对细胞的毒性逐渐显现。同样，浓度为0～20 μg/mL 的EA 作用于RAW264.7 细胞时，未对细胞产生明显毒性作用，EA浓度达到25 μg/mL 时，对细胞活力产生了抑制。LPS 在0～1.5 μg/mL 范围内单独作用时，也未对 RAW264.7 细胞产生明显毒性作用。当 LPS 浓度为 2.0 μg/mL 时，开始对细胞活力产生了抑制。因此，选取0～120 μg/mL浓度范围内的PO、0～20 μg/mL 浓度范围的EA 和0～1.5 μg/mL 浓度范围内的 LPS 用于后续试验。
2.2 PO 和EA 对LPS 诱导RAW264.7 细胞存活率的影响
炎症是机体针对各类刺激所做出的一种自我防御机制。一般而言，炎症具有积极意义，然而过度的炎症反应则会引发组织损伤并诱发疾病。在细菌感染性炎症反应中，LPS 是最为关键的促炎因子，能够促使单核巨噬细胞等炎症细胞合成并释放诸如TNF-α、IL-6、IL-10等多种炎症因子。已有研究显示多酚物质具有较强的体内外抗炎活性，但对于不同来源、不同提取方式所得多酚物质抗炎差异性较大。吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，在炎症过程中，白细胞会向炎症部位趋化和聚集，释放各种炎症介质，加重炎症反应。吲哚美辛可以抑制白细胞的趋化和聚集，减少炎症细胞在炎症部位的数量，从而减轻炎症反应。通过抑制 COX-2 的活性，能够有效地减少前列腺素的产生，从而减轻炎症反应和疼痛。本试验测定不同质量浓度的PO、EA 和吲哚美辛对LPS 刺激的RAW264.7 细胞活力的影响，结果如图4～图6 所示。
图4 PO 对LPS 诱导的 RAW264.7 细胞活力的影响
Fig.4 Effect of PO on the viability of RAW264.7 cells treated with LPS
###表示与对照组相比，差异高度显著（P＜0.001）；***表示与模型组相比，差异高度显著（P＜0.001）。
由图4、图5、图6 可知， PO、EA 抑制细胞活性的IC50 值分别为58.98、14.23 μg/mL，吲哚美辛的IC50 值为11.33 μg/mL，这表明吲哚美辛在抑制细胞活性方面相对较强，EA 次之，PO 相对较弱。对于 PO 来说，虽然其 IC50 值相对较高，但在12.5～100.0 μg/mL 仍能对LPS 诱导的细胞产生显著抑制。这可能意味着 PO 在一定浓度范围内可以通过特定的机制发挥抗炎作用。可能的机制包括干扰 LPS 与细胞受体的结合、抑制炎症信号通路的激活等。然而，需要进一步的研究来确定其具体的作用机制。EA 在较低浓度范围内就表现出对 LPS 诱导的细胞的显著抑制作用，其 IC50 值也相对较低。这表明 EA 可能具有更高效的抗炎活性。EA 可能通过调节细胞内的信号传导、抑制炎症因子的释放等方式来发挥作用。进一步研究可以深入探讨EA 与炎症相关信号通路的关系，以及其在细胞内的具体作用靶点。
图5 EA 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞活力的影响
Fig.5 Effect of EA on the viability of RAW264.7 cells treated with LPS
###表示与对照组相比，差异高度显著（P＜0.001）；***表示与模型组相比，差异高度显著（P＜0.001）。
图6 吲哚美辛对LPS 诱导的RAW264.7 细胞活力的影响
Fig.6 Effect of indometacin on the viability of RAW264.7 cells treated with LPS
###表示与对照组相比，差异高度显著（P＜0.001）；***表示与模型组相比，差异高度显著（P＜0.001）。
2.3 PO 和EA 对LPS 诱导RAW264.7 细胞炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 的影响
2.3.1 炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2水平的测定
TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6 是重要的前炎细胞因子，在炎症反应中起着非常重要的作用。TNF-α 主要由巨噬细胞产生，当巨噬细胞受到诱导剂LPS 的刺激达30～90 min 后生成TNF-α，进而发生细胞内的级联反应，生成前炎细胞因子和炎性介质[27]。IL-6 可促进T、B 细胞增殖分化，激发肝细胞产生急性期蛋白，并能通过级联反应促进炎症发展； IL-10 作用为减少辅助性T1 细胞（T1 helper cell，Th1）应答及产生炎性因子，削弱巨噬细胞的抗原呈送，并减少合成炎性细胞因子，促进B 细胞的增殖、分化及抗体产生[27-29]。PO、EA 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞释放TNF-α、IL-6 、IL-10、IL-1β 和COX-2 水平的影响如图7、图8 所示。
图7 PO 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞释放TNF-α、IL-6 、IL-10、IL-1β 和COX-2 水平的影响
Fig.7 Effects of PO on the release of TNF-α， IL-6， IL-10， IL-1β， and COX-2 content from RAW264.7 cells treated with LPS
同一指标不同字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
图8 EA 对LPS 诱导的RAW264.7 细胞释放TNF-α、IL-6 、IL-10、IL-1β 和COX-2 水平的影响
Fig.8 Effects of EA on the release of TNF-α， IL-6， IL-10， IL-1β， and COX-2 content from RAW264.7 cells treated with LPS
同一指标不同字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图7、图8 可知，与CK 相比，LPS 刺激后，RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 的含量显著升高（P＜0.05）；用12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的PO和1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL 的 EA 处理后，各炎性细胞因子的含量低于LPS 组，说明TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 的分泌明显受到PO、EA 的处理抑制，随着PO 和EA 的浓度增加，其抑制效果明显增加。
2.3.2 PO 和EA 对RAW264.7 细胞模型中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 的调控作用
NF-κB 信号通路激活后，NF-κB 蛋白家族迅速进入细胞核打开各种κB 依赖性基因的表达，如TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β 和COX-2 等，同时后者也可以反馈调控NF-κB。PO 和EA 对LPS 刺激下RAW264.7 细胞中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β 和COX-2 mRNA 表达量的影响如图9 所示。
图9 PO 和EA 对LPS 刺激下RAW264.7 细胞中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β 和COX-2 mRNA 表达量的影响
Fig.9 TNF-α， IL-6， IL-10， IL-1β， and COX-2 mRNA expression of RAW264.7 cells pretreated with PO and EA before being stimulated with LPS
同一指标不同字母表示存在显著差异（P＜0.05）。
由图9 可知，经过LPS 刺激后，与CK 组相比，PO和EA 均可抑制RAW264.7 细胞内TNF-α mRNA 的表达（P＜0.05）。IL-6、IL-10、IL-1β 和COX-2 是多细胞源、多功能的促炎因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是公认的炎症与免疫抑制因子[27-29]。同样，经过LPS 刺激后，PO 和EA 均可明显降低细胞中上清液中IL-6 、IL-10、IL-1β 和COX-2 mRNA的表达。
2.4 PO 和EA 抑菌试验结果
PO 和EA 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）如表2、表3 所示。
表2 PO 和EA 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径
Table 2 Inhibition zone diameters of PO and EA on Escherichia coli and Staphylococcus aureus
提取物无菌水PO EA浓度/（mg/mL）123456123456抑菌圈直径/mm大肠杆菌0 4.66±0.39 5.96±0.83 7.93±0.25 8.12±0.66 9.91±0.84 11.05±0.68 4.15±0.23 4.58±0.74 5.34±0.55 6.88±0.71 9.24±0.45 10.57±0.16金黄色葡萄球菌0 5.54±0.41 6.31±0.30 7.42±0.33 8.87±0.78 10.15±0.33 11.79±0.34 4.33±0.34 6.01±0.28 6.98±0.32 8.98±0.34 9.45±0.23 11.07±0.22
表3 PO 和EA 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC
Table 3 MIC of PO and EA on E. coli and S. aureus
提取物PO EA MIC/（mg/mL）大肠杆菌1.56 1.56金黄色葡萄球菌0.78 0.78
由表2、表3 可知，PO 和EA 具有明显抑制细菌的活性，且随着浓度的增加，抑制圈的直径增大，这与文献[30]结果相符，两者对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为1.56 mg/mL 和0.78 mg/mL。
3 讨论与结论
本研究探究芒果核多酚提取物（PO）及鞣花酸（EA）抑制NF-κB 信号通路的抗炎作用及分子机制。研究表明，不同质量浓度的PO 和EA 对LPS 刺激的RAW264.7 细胞活力的影响不同，其中，PO、EA 抑制细胞活性的IC50 值分别为58.98、14.23 μg/mL，吲哚美辛的 IC50 值为11.33 μg/mL。PO 浓度为12.5～100.0 μg/mL、EA浓度为1.25～20.00 μg/mL时，对LPS 诱导的RAW264.7细胞存活率均有高度显著的抑制作用。与CK 相比，LPS刺激后，RAW264.7 细胞释放TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 水平显著升高；用12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的PO 和1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL 的 EA 处理后，处理炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2水平低于LPS 组，说明TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、COX-2 的分泌明显受到PO、EA 的处理抑制，随着PO 和EA的浓度增加，抑制效果明显增加。最后从分子水平探究芒果核多酚提取物（PO）及鞣花酸（EA）抑制NF-κB信号通路的抗炎作用，发现经过LPS 刺激后，PO 和EA 均可明显降低细胞上清液中5 种炎性因子的mRNA 表达，抑制细胞中炎症因子释放。PO 和EA 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较好抑制作用，最小抑菌浓度（MIC）分别为1.56 mg/mL 和0.78 mg/mL。然而，研究中未对提取物单个成分进行对比研究，此外尚未开展反证试验确认该提取物及鞣花酸抗炎作用与TLR4/NF-κB 信号通路的直接关系。因此，后续研究中应对该提取物的单个成分及鞣花酸抗炎作用与TLR4/NF-κB 信号通路的关系进一步深入探究、明确，同时开展提取物有效成分的定量分析及对比研究，以期为芒果核副产物抗炎作用提供更为丰富的依据。
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