核苷酸是广泛存在于各种组织以及微生物体中的重要化合物。它们是由核苷和磷酸通过酯键连接而成的非蛋白质氮化合物，主要包括胞嘧啶核苷酸（cytidine 5´-monophosphate，CMP）、尿 嘧 啶 核 苷 酸（uridine 5´-monophosphate，UMP）、腺嘌呤核苷酸（adenosine 5´-monophosphate，AMP）、鸟嘌呤核苷酸（guanosine 5´-monophosphate，GMP）以及次黄嘌呤核苷酸（inosine 5´-monophosphate，IMP）[1]。近年来的研究表明，核苷酸是人体细胞DNA 合成过程中的重要辅助因子，适量摄入核苷酸不仅有助于调节肠道功能、维持体内微生物环境平衡，还有利于提高免疫功能、调控脂质代谢等，有婴幼儿健康研究者认为，核苷酸是维持正常机体免疫功能的必要营养成分，可以增强婴幼儿机体免疫力和抗感染能力[2-6]。研究发现，母乳中含有一定量的游离核苷酸[7]。为了最大化模拟母乳的营养组成，常采用额外添加核苷酸的方式来强化特殊医学用途配方奶粉的营养功能[8]。然而，奶粉样品基质成分复杂，含有多种蛋白质，容易干扰奶粉中核苷酸的提取和分离鉴定，现有检测方法无法有效排除干扰，复杂样品基质中不同类型核苷酸的同步定性和准确定量一直是特殊医学用途配方食品检测领域亟需解决的问题。因此，需要开发简单高效低成本的样品前处理方法，以快速高质量去除蛋白质等杂质并提取出复杂基质样品中的游离核苷酸[9]，而后进行准确定性和定量。
目前，检测奶粉中核苷酸含量的常用方法包括荧光比色法[10]、毛细管电泳法[11]、高效液相色谱法[12-16]、离子色谱法[17]等。然而，上述方法均存在不足，例如：荧光比色法操作过程复杂且目标核苷酸容易受到干扰；毛细管电泳法对试验条件要求高，且重现性不佳；离子色谱法对离子对流动相的pH 值要求高且需要较长的操作时间，严重影响设备使用寿命，并且检测时目标核苷酸易受奶粉中复杂成分的干扰；高效液相色谱法中采用常规反相色谱柱对奶粉中核苷酸吸附效果较差，容易受到基质干扰[18]，而采用正相色谱柱会随着检测样品数量的增加而使峰型和重复性变差，难以分离相对分子量接近的核苷酸。本研究以市售特殊医学用途配方奶粉基质为原料，以超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法为支撑，优化样品前处理方法（筛选最优的沉淀剂、优化提取的pH 值条件），优化色谱条件（优化色谱柱种类、优化流动相条件），旨在开发一种前处理方法简单、高效，检测效果可靠、稳定，对特殊医学用途配方奶粉中的5 种不同类型核苷酸具有良好分离效果并能够准确定性定量的方法，以适应复杂基质中核苷酸高质量分析检测的需要。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
GMP、UMP、CMP、AMP、IMP（纯度≥99.9%）：美国Stanford analytical chemicals 公司。
乙腈（质谱纯）、甲醇（色谱纯）、超纯水：默克化工技术（上海）有限公司；高氯酸、盐酸、氢氧化钠、乙酸（均为优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙酸铵、甲酸（均为色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；特殊医学用途配方奶粉基质（20 g）：中国检验检疫科学研究院测试评价中心。
1.2 仪器与设备
ACQUITY BEH C18 色 谱 柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）、ACQUITY BEH Shield RP18 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）、UPLC/XEVO TQ-S 型超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；3-18KS 型冷冻离心机：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；MS403TS/02 型电子天平：梅特勒-托利多科技（中国）有限公司；pHS-3C 型pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；88882010 型数字旋涡混合器：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；KQ-800DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HYCD-205 型医用冷藏冷冻箱：青岛海尔股份有限公司。
1.3 标准溶液配制
分别准确称取10.0 mg GMP、UMP、CMP、AMP、IMP标准品，用超纯水溶解并定容至10 mL 容量瓶中，得到浓度为1.0 mg/mL 的标准中间液，4 ℃避光保存。使用时经超纯水稀释为5.0、10.0、50.0、100.0、250.0 ng/mL的标准曲线工作溶液（4 ℃保存可使用1 周）。
1.4 样品前处理优化
1.4.1 前处理步骤
准确称取0.80 g 特殊医学用途配方奶粉基质样品，加入5 种核苷酸混合标准溶液，高速涡旋混匀10 min，静置3 min，40 mL 温水溶解，涡旋混匀3 min，超声辅助提取20 min，用酸溶液调节pH 值以沉淀蛋白质，在4 ℃下9 000 r/min 离心10 min。吸取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，经超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪分析检测。
1.4.2 pH 值的优化
通过调节溶剂或溶液的pH 值可以去除特殊医学用途配方奶粉中容易干扰核苷酸检测的蛋白质，当pH 值低于5.0 时，开始有絮状沉淀形成，高速（9 000 r/min、10 min）离心后获得澄清的上清液。通过测定不同pH 值条件下5 种核苷酸的回收率以确定最优pH 值范围。
1.4.3 沉淀剂的筛选
选择25%乙酸溶液、13%高氯酸溶液、1%甲酸溶液和1%盐酸溶液作为特殊医学用途配方奶粉中蛋白质沉淀剂进行优化，pH 值调节至最优范围。通过测定5 种核苷酸的回收率以确定最优沉淀剂。
1.5 仪器条件
1.5.1 液相条件
色 谱 柱：ACQUITY BEH C18 色 谱 柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）、ACQUITY BEH Shield RP18 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）；柱温：38 ℃；进样体积：2 μL；流动相A 为乙酸铵-甲酸水溶液，流动相B 为乙腈；流速：0.280 mL/min。梯度洗脱程序详见表1。
表1 液相洗脱程序
Table 1 Elution procedure of liquid phase
时间/min 0 2.00 2.50 3.00 5.00流速/（mL/min）0.280 0.280 0.280 0.280 0.280乙酸铵-甲酸水溶液/%95.0 75.0 10.0 95.0 95.0乙腈/%5.0 25.0 90.0 5.0 5.0
1.5.2 质谱条件
离子源：电喷雾电源（electrospray ionization，ESI）；质谱扫描方式：多反应离子监测（multiple reaction monitoring，MRM）；扫描模式：正离子扫描；毛细管电压：2.5 kV；离子源加热温度：500 ℃；雾化器流速：1 000 L/h；碰撞气流速：150 L/h。5 种核苷酸对应离子对及质谱条件见表2。
表2 5 种核苷酸的MRM 离子对信息
Table 2 MRM ion pair information for five nucleotides
核苷酸GMP母离子（m/z）364.1 UMP 325.0 CMP 324.4 AMP 348.2 IMP 349.0子离子（m/z）152.0 97.0 113.0 97.0 112.1 97.0 136.2 97.0 136.7 97.0锥孔电压/kV 12 12 14 14 14 14 15 15 16 16碰撞电压/kV 20 25 15 18 12 18 18 18 20 20
1.6 数据处理
采用MassLynx 4.1 质谱软件自动采集数据并积分，采用OriginPro 软件形成矢量图。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法优化
2.1.1 pH 值确定不同pH 值对5 种核苷酸回收率的影响见表3。
表3 不同pH 值对5 种核苷酸回收率的影响
Table 3 Effect of different pH values on recovery rates of five nucleotides
核苷酸GMP UMP CMP AMP IMP回收率/%pH4.0 90.5 88.2 91.1 87.1 85.6 pH4.2 98.4 97.5 98.9 98.0 97.1 pH4.4 103.9 104.5 106.2 104.1 101.6 pH4.7 108.5 107.3 109.9 106.4 105.5
pH 值降至5.0 以下时，蛋白质开始沉淀，当pH 值调至4.0 以下时，沉淀物开始出现复溶，沉淀物的量明显减少，高速离心后上清液仍然浑浊，经检测，此时5 种核苷酸回收率均低于92%。当pH 值调至高于4.3 时，5 种核苷酸的回收率开始高于100%，pH 值在4.7 时，5 种核苷酸回收率可接近110%。因此，最终确定样品前处理pH 值调节范围为4.2±0.1。
2.1.2 沉淀剂筛选
不同提取剂对5 种核苷酸回收率的影响见表4。
表4 不同提取剂对5 种核苷酸回收率的影响
Table 4 Effect of different extractants on recovery rate of five nucleotides
核苷酸GMP UMP CMP AMP IMP回收率/%25%乙酸溶液98.7 97.2 97.9 98.0 96.8 13%高氯酸溶液97.8 89.5 95.8 109.5 101.9 1%甲酸溶液98.1 83.6 100.4 111.5 99.6 1%盐酸溶液98.4 87.1 101.6 115.2 100.8
由表4 可知，4 种无机酸溶液可作为蛋白沉淀剂提取奶粉中的GMP、CMP、IMP 3 种核苷酸，且回收率范围稳定在95.8%～101.9%内，13%高氯酸溶液、1%甲酸溶液、1%盐酸溶液对AMP 的提取效果影响较大，回收率均超过109%，而25%乙酸溶液作为沉淀剂可以将UMP的回收率由另外3 种酸溶液提取时的83.6%～89.5%提高至97.2%。综合表4，对比4 种无机酸溶液作为沉淀剂时5 种核苷酸的回收率结果，最终确定25%乙酸溶液为提取特殊医学用途配方奶粉中核苷酸的沉淀剂。
2.2 色谱条件优化
2.2.1 色谱柱的选择两种色谱柱分离5 种核苷酸结果见图1～图2。
图1 BEH C18 柱分离5 种核苷酸MRM 图谱
Fig.1 MRM spectra of five nucleotides separated by BEH C18 column
图2 BEH Shield RP18 柱分离5 种核苷酸MRM 图谱
Fig.2 MRM spectra of five nucleotides separated by BEH Shield RP18 column
BEH C18 柱与BEH Shield RP18 柱常用于分离特殊医学用途配方奶粉中5 种核苷酸，二者分离5 种核苷酸的峰型结果显示，BEH Shield RP18 柱能够有效分离5 种核苷酸，在相同浓度下相对离子丰度响应值更高，峰型尖锐对称、更流畅更集中、无前延无拖尾。而BEH C18 柱分离5 种核苷酸时，除相对离子丰度响应较低外，UMP、GMP 和IMP 3 种核苷酸的目标峰峰型不对称，且有较明显的拖尾现象，AMP 的目标峰前则有倒峰出现，CMP 的分离受两种色谱柱的影响最小。以上结果说明，BEH Shield RP18 柱能够在复杂基质的干扰下完成5 种核苷酸的高质量分离。
2.2.2 流动相的选择
使用不同流动相分离5 种核苷酸结果见图3～图6。
图3 5 mmol/L 乙酸铵-乙腈为流动相分离5 种核苷酸MRM 图谱
Fig.3 MRM spectra of five nucleotides separated by using 5 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile as mobile phase
图4 0.1%甲酸-乙腈为流动相分离5 种核苷酸MRM 图谱
Fig.4 MRM spectra of five nucleotides separated by using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase
图5 5 mmol/L 乙酸铵-0.1%甲酸-乙腈为流动相分离5 种核苷酸MRM 图谱
Fig.5 MRM spectra of five nucleotides separated by using 5 mmol/L ammonium acetate-0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase
以5 mmol/L 乙酸铵溶液、0.1%甲酸溶液、5 mmol/L乙酸铵-0.1% 甲酸溶液作为水相[19-20]，选择乙腈、甲醇为有机相，分别优化流动相条件。由图5～图6 可知，相同浓度下，单独使用5 mmol/L 乙酸铵溶液为水相时，5 种核苷酸相对离子丰度均较低，GMP 和IMP 目标峰响应不明显，UMP 与AMP 目标峰也出现拖尾现象；单独使用0.1% 甲酸水溶液为水相时，5 种核苷酸与基质峰分离不彻底，峰型不流畅，峰型宽而扁；当5 mmol/L 乙酸铵-0.1%甲酸水溶液作为水相，5 种核苷酸MRM 图谱峰型对称，尖锐且流畅，相对离子丰度较高。此外，传统分离方法通常以甲醇作为有机相[21]，该条件下AMP 与IMP 相对离子丰度低，且有较高的流动相溶剂效应，溶剂峰响应过高掩盖了目标峰，而采用乙腈作为有机相时可避免此问题。通过比较5 种核苷酸在不同水相和有机相中的分离结果，发现CMP 最为稳定，不易受到流动相种类的影响，而GMP 最易受到流动相的影响，IMP 次之。综合水相和有机相的筛选，最终确定流动相条件如下：5 mmol/L 乙酸铵-0.1% 甲酸为水相，乙腈为有机相。
图6 5 mmol/L 乙酸铵-0.1%甲酸-甲醇为流动相分离5 种核苷酸MRM 图谱
Fig.6 MRM spectra of five nucleotides separated by using 5 mmol/L ammonium acetate-0.1% formic acid-methanol as mobile phase
2.3 线性关系及检出限
以不同浓度的核苷酸混合标准溶液为目标物，经UPLC-MS/MS 测定，获得对应的标准曲线。其中，测定结果以信噪比S/N=10 时对应的各标准物质的进样量为方法检测限，以信噪比S/N=30 时对应的各标准物质的进样量为方法定量限。得到线性回归方程、检出限、定量限，结果见表5。
表5 5 种核苷酸线性回归方程及方法检出限、定量限
Table 5 Linear equations and detection limit and quantitative limit of methods for five nucleotides
核苷酸GMP UMP CMP AMP IMP线性范围/（ng/mL）5～250 5～250 5～250 5～250 5～250回归方程y=788.092x+2 527.96 y=365.484x+1 483.78 y=945.361x+1 345.95 y=4 915.36x-12 966.7 y=481.761x+189.704相关系数（R）0.999 05 0.999 22 0.999 26 0.997 29 0.999 56检出限/（mg/kg）0.030 0.025 0.018 0.022 0.035定量限/（mg/kg）0.042 0.035 0.028 0.032 0.048
由表5 可知，5 种核苷酸在5～250 ng/mL 浓度范围内呈现良好的线性，GMP、UMP、CMP、IMP 线性相关系数（R）均大于0.999，AMP 线性相关系数（R）大于0.997。其中，CMP 在此方法下响应最灵敏，检出限和定量限均为最低值，而5 种核苷酸的检出限和定量限均在同一数量级，使用时可以配制成相同浓度的混合标准溶液进行试验。
2.4 加标回收率与精密度
以不含5 种核苷酸的特殊医学用途配方奶粉基质为样品，采用外标法定量分析，平均加标回收率（n=6）和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）详见表6。
表6 5 种核苷酸加标回收及相对标准偏差
Table 6 Spiked recovery and relative standard deviation of five nucleotides
核苷酸GMP UMP CMP AMP IMP添加量/（μg/100 g）25 250 1 000 25 250 1 000 25 250 1 000 25 250 1 000 25 250 1 000平均加标回收率/%97.076 98.754 98.546 94.456 97.864 91.865 100.815 99.589 98.467 98.211 97.753 98.456 92.877 96.654 98.877 RSD/%0.467 2.865 3.657 6.043 2.977 3.576 1.592 3.102 2.864 2.031 1.545 4.356 2.787 3.578 4.578
由表6 可知，在3 个不同浓度的加标量下，5 种核苷酸平均加标回收率均在91.865%～100.815%，其中，GMP、CMP、AMP 3 种核苷酸的添加量对应的回收率结果稳定，均维持在97%～100%之间，而UMP 在添加量达到1 000 μg/100 g 时回收率会明显降低，而IMP 的回收率则随着添加量的增加而增大。5 种核苷酸的RSD 为0.467%～6.043%。
3 结论
研究获得的样品前处理方法（40 ℃温水溶解0.8 g样品，25%乙酸溶液调节pH 值至4.2±0.1，9 000 r/min 4 ℃离心10 min）更适合从特殊医学用途配方奶粉这类复杂基质样品中提取5 种核苷酸，平均回收率可达91.865%～100.815%。经UPLC-MS/MS 分析检测，借助ACQUITY BEH Shield RP18 色谱柱，优化筛选出的5 mmol/L 乙酸铵-0.1%甲酸溶液与乙腈作为流动相梯度洗脱能够辅助准确定性和定量特殊医学用途配方奶粉中的5 种核苷酸，且在5～250 ng/mL 浓度范围内具有良好的线性关系以及较高的准确度和精密度。该前处理方法和定性定量方法可为特殊医学用途配方奶粉中核苷酸的提取、鉴定和监测提供一定参考。
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