酸豆奶是以豆浆为主要原料，再配以适当的辅料，经乳酸菌发酵而成的活性乳酸菌饮品。因其具有提高免疫力[1-2]、抗癌[3-5]、降低血清胆固醇[6-8]、抗动脉粥样硬化[9]和抗衰老等功能特性以及独特的口感风味和较高的营养保健功能逐渐被大众所关注和喜爱[10]。
乳酸菌为人体益生菌，近年来，利用乳酸菌发酵生产的产品（奶酪、酸奶、酸豆奶、植物乳酸菌饮料等），都因为具有一定的保健功能而受到越来越多的消费者的关注与青睐。研究表明，坚持食用乳酸菌类制品能够抑制致病菌的生长繁殖从而激活肠黏膜免疫系统[9，11]；增强新一代的调节T 细胞[12]；通过激活单核巨噬细胞发挥抗癌作用[13-14]；降低胆固醇含量[15-17]；改善肝脂肪堆积[18]；降低心血管疾病的发生[19]等。因此，将乳酸菌作为辅助发酵剂以增加发酵制品的保健功能已成为业内争先恐后研发的热点。
植物乳杆菌S2-5 和K25 是吉林省农业科学院农产品加工研究所从酸菜和西藏灵菇中自主分离得到的菌株，经鉴定具有较好的降胆固醇功能[20-22]，但目前还未在酸豆奶的发酵过程中应用，因此本研究的目的在于将这两株具有较好的降胆固醇功能的益生菌作为辅助发酵剂，与商品发酵剂复配后发酵酸豆奶，并对酸豆奶产品的品质进行分析评价，同时，用酸豆奶产品对高脂小鼠进行灌胃，研究植物乳杆菌S2-5 和K25 发酵的酸豆奶对小鼠血清胆固醇水平的影响，以期为开发具有降胆固醇功能的酸豆奶产品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌K25：吉林省农业科学院农产品加工研究所从西藏灵菇中分离得到；植物乳杆菌S2-5：由吉林省农业科学院农产品加工研究所从酸菜中分离得到；菌株均保存在MRS 培养基中，-80 ℃冻存于吉林省农业科学院；培养基按照文献[23-24]中的方法配制。
大豆、奶粉、白砂糖：市售；商品发酵剂、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌：科汉森（北京）贸易有限公司；高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒：上海江莱生物科技有限公司。健康雄性ICR 小鼠（60 只，6 周龄，体质量17~20 g）、常规饲料、高脂饲料：长春亿斯实验器材有限公司。
1.2 仪器与设备
P132 型豆浆机：九阳股份有限公司；HR-25D 型高剪切分散乳化机：上海沪析实业有限公司；MP2002 型天平：赛多利斯（上海）贸易有限公司；TA-XT Plus 型物性测试仪：英国Stable Micro Systems 公司；FB20 型台式精密酸度计：奥豪斯仪器（常州）有限公司；D-8pc 型紫外-可见分光光度计：南京菲勒仪器有限公司；DH3600A 型恒温培养箱：河南沃林仪器设备有限公司；HH-4S 型数显恒温水浴锅：上海一恒实验仪器有限公司；DHG-9140A 型电热鼓风干燥箱：上海习仁科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酸豆奶样品的制备
挑选品质良好的大豆，开水漂烫10 min，在20 ℃条件下按料水质量比1∶3 浸泡12 h 左右；取一定量的湿豆，加适量水，用豆浆机磨浆；白砂糖添加量为8%，搅拌均匀后的豆浆与10% 的奶液按9∶1 的质量比混合均匀；均质过滤后95 ℃杀菌15 min；速冷至43 ℃左右，接种；分装压膜后42.5 ℃发酵10 h 后停止发酵；冷却至10 ℃左右放入冰箱，4 ℃放置1 d，进行发酵后熟。接种方案如表1 所示。
表1 接种方案
Table 1 Inoculation condition
样品123发酵剂商品发酵剂商品发酵剂+植物乳杆菌K25商品发酵剂+植物乳杆菌S2-5商品发酵剂添加量/%0.006 0.006 0.006植物乳杆菌K25 添加量/%0 0.006 0植物乳杆菌S2-5 添加量/%00 0.006
1.3.2 酸豆奶样品的感官、理化以及微生物指标测定
1.3.2.1 酸豆奶样品感官评价
酸豆奶样品冷藏1 d 后进行评定。组建一个10人感官评定小组，经过专业系统的培训后对酸豆奶样品分别从组织状态、风味、口感、色泽和黏稠度5 个方面进行评定。评分标准如表2 所示。
表2 酸豆奶样品感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of soy yogurt
项目色泽组织状态风味口感黏稠度评分标准（满分100）黄色（0~＜10）表面不光滑，切面粗糙（0~＜14）有异味（0~＜14）口感欠佳，太甜或太酸（0~＜14）较稀（0~＜10）淡黄（10~＜15）表面光滑度一般，有轻微裂痕，切面状态均一（14~＜17）微微豆香味（14~＜17）口感协调，偏甜或偏酸（14~＜17）一般（10~＜15）微黄（15~20）表面光滑无裂痕，切面光滑（17~20）浓郁豆香味（17~20）口感细腻，酸甜适口，柔和爽口（17~20）较强（15~20）
1.3.2.2 酸豆奶贮存期的理化和微生物指标测定
酸豆奶在4 ℃条件下储存21 d，每隔3 d 取样测定pH 值和滴定酸度，每隔7 d 取样测定活菌数。
滴定酸度测定参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》的方法。微生物指标采用涂布平板计数法进行测定[25]，酸豆奶样品稀释后，分别涂布于各选择培养基进行培养并记录各菌株的活菌数。
1.3.3 酸豆奶样品降胆固醇功能测定
1.3.3.1 小鼠分组及饲喂方案
小鼠随机分为4 组，每组15 只。1 组作为空白对照组，小鼠给予维持饲料；2~4 组作为高脂模型组，小鼠给予高脂饲料。每周称量体质量1 次，并在饲养14 d后采血，检验是否形成高血脂模型[26]。
高脂模型组给予高脂饲料4 周，根据小鼠体质量及外观状况选择体质量增加状态良好的小鼠，模型组按体质量平均分为3 组，每组10 只，各组之间体质量无显著性差异（P＞0.05）。
小鼠饲养期间，保证充足的水和饲料，并于每天上午进行灌胃。小鼠取血前可给水但需禁食12 h。
1.3.3.2 生化指标测定
小鼠眼球取血，37 ℃下孵育1 h，冰箱冷藏室静置3 h 后离心（3 000 r/min，4 ℃，10 min）获得血清，所得血清于-20 ℃保存，备用。取血清，根据相关试剂盒的方法测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 含量，并计算动脉粥样硬化指数（atherosclerotic index，AI），公式如下。
式中：A 为动脉粥样硬化指数；C 为总胆固醇的浓度，mg/100 mL；C1 为高密度脂蛋白的浓度，mg/100 mL。
1.4 数据处理与统计分析
所有实验均重复进行3 次，数据以平均值±标准差表示。使用SPSS 和Duncan 方法，对数据进行方差分析和多重测试分析。在P＜0.05 时表示处理的结果存在显著性差异。采用Origin 9.0 进行作图。
2 结果与分析
2.1 植物乳杆菌S2-5 和植物乳杆菌K25 在酸豆奶中的应用
2.1.1 感官评价
酸豆奶样品的感官评价综合得分见表3。
表3 酸豆奶样品的感官评价综合得分
Table 3 The comprehensive score of soy yoghurt in sensory evaluation
感官指标风味口感组织状态色泽黏稠度商品发酵剂酸豆奶对照组17.35±2.17 18.30±4.21 18.56±1.59 19.72±2.33 18.43±3.11商品发酵剂+植物乳杆菌K25的酸豆奶样品组19.17±3.24 19.23±3.71 18.88±2.11 20.26±2.51 20.16±3.62商品发酵剂+植物乳杆菌S2-5的酸豆奶样品组18.41±2.56 19.67±2.87 19.47±2.03 20.81±2.42 20.55±3.40
由表3 可知，添加了植物乳杆菌K25 和植物乳杆菌S2-5 的酸豆奶样品未产生不良风味，其口感更加绵滑、细腻，且因菌株的相互协同作用而使香气更加浓郁。
2.1.2 冷藏期间酸豆奶的活菌数变化情况
4 ℃冷藏期间酸豆奶的活菌数变化见表4。
表4 4 ℃冷藏期间酸豆奶的活菌数变化
Table 4 Changes of viable bacteria count in soy yoghurt during cold storage at 4 ℃
组别（发酵菌株）对照组（嗜热链球菌）对照组（保加利亚乳杆菌）试验组1（嗜热链球菌）试验组1（保加利亚乳杆菌）试验组1（植物乳杆菌K25）试验组2（嗜热链球菌）试验组2（保加利亚乳杆菌）试验组2（植物乳杆菌S2-5）活菌数/[lg（cfu/mL）]1 d 9.01±0.03 7.03±0.02 9.04±0.10 6.81±0.11 7.49±0.02 9.09±0.07 6.84±0.12 7.31±0.01 7 d 9.21±0.15 7.94±0.06 9.55±0.12 7.46±0.12 7.70±0.03 9.43±0.10 7.55±0.08 7.61±0.03 14 d 9.12±0.07 7.60±0.14 9.36±0.06 7.38±0.07 8.18±0.05 9.26±0.07 7.32±0.06 8.04±0.06 21 d 8.90±0.03 7.02±0.04 8.83±0.10 6.96±0.19 7.49±0.10 8.80±0.11 7.09±0.11 7.33±0.09
由表4 可知，酸豆奶样品经4 ℃冷藏21 d 后，试验组中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数与对照组相比差异不明显，表明植物乳杆菌S2-5 及K25均不影响商业发酵剂的菌株生长。而且植物乳杆菌S2-5 及K25 的活菌数在14 d 时达到最大，分别为8.04 lg（cfu/mL）和8.18 lg（cfu/mL），随后开始降低，21 d时分别达到7.33 lg（cfu/mL）和7.49 lg（cfu/mL）。结果表明，植物乳杆菌S2-5 和K25 在酸豆奶冷藏期间具有较强的存活能力。这与王辑[27] 和于志会[21]的研究结果相一致。
2.1.3 酸豆奶冷藏期间滴定酸度与pH 值的变化
酸豆奶冷藏期间滴定酸度与pH 值的变化如图1和图2 所示。
图1 酸豆奶冷藏期间滴定酸度变化
Fig.1 Changes of titration acidity during storage
图2 酸豆奶冷藏期间pH 值变化
Fig.2 Changes of pH values during storage
由图1 和图2 可知，酸豆奶样品在4 ℃冷藏期间，其滴定酸度随时间的延长呈上升趋势，pH 值呈下降趋势。与对照组相比，其他两组酸豆奶的滴定酸度均稍高于对照组，但差异不明显。这是由于植物乳杆菌S2-5 和K25 的产酸能力较差，而且酸豆奶产品的发酵时间短，导致植物乳杆菌S2-5 和K25 在发酵期间产生的乳酸未达到影响产品的酸度的水平，所以差异不明显。
2.2 酸豆奶产品的降胆固醇功能鉴定
2.2.1 高脂血症小鼠模型的构建
高脂小鼠模型血脂的变化见表5。
表5 高脂小鼠模型血脂的变化
Table 5 Changes of blood lipids in hyperlipidemic mouse models mg/100 mL
注：*表示差异显著，P＜0.05。
组别正常组高脂组TG 71.66±7.83 90.13±11.56*TC 110.62±12.11 130.28±15.32*
如表5 所示，经过14 d 的饲喂后，高脂小鼠组血清TG 和TC 含量与正常组相比均显著升高，说明高脂血症小鼠模型建立成功。
2.2.2 植物乳杆菌S2-5 和K25 对小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 含量及AI 值的影响
饲喂高脂饲料后小鼠血清TC、TG、HDL-C 及LDLC 的含量见表6。
表6 饲喂高脂饲料小鼠血清TC、TG、HDL-C 及LDL-C 的含量
Table 6 Serum TC，TG，HDL-C and LDL-C levels in mice fed with high fat diet
注：*表示与1 组相比差异显著（P＜0.05）；**表示与1 组相比差异极显著（P＜0.01）。
组别1 组（空白对照组）2 组（普通酸豆奶对照组）3 组（添加K25 的酸豆奶组）4 组（添加S2-5 的酸豆奶组）TC 含量/（mg/100 mL）124.26±33.13 124.65±17.67 89.01±22.61*85.52±20.61*TG 含量/（mg/100 mL）63.40±23.88 72.26±21.90 56.42±19.75 55.21±20.01 HDL-C 含量/（mg/100 mL）65.21±14.75 79.48±26.91 86.79±8.21*85.90±9.85*LDL-C 含量/（mg/100 mL）82.65±20.36 77.73±26.12 53.65±16.85*54.25±19.12*AI 值0.69±0.04 0.45±0.03*0.15±0.01**0.18±0.01**
如表6 所示，与1 组相比，3 组和4 组小鼠血清中LDL-C 和TC 的含量显著降低（P＜0.05），LDL-C 分别降低了35.08%和34.36%，TC 分别降低了28.37%和31.18%，AI 值分别降低了78.26%和73.92%，呈极显著降低（P＜0.01），而2 组小鼠血清LDL-C 和TC 的含量降低不显著（P＞0.05）。结果表明添加了植物乳杆菌S2-5 和K25 的酸豆奶可以使血清中的LDL-C、TC 以及AI 值的水平显著降低。这与Zhu 等[28]、Heo 等[29]和Deng 等[30]的研究结果相一致。
在3 组和4 组小鼠血清中，LDL-C 和TG、TC 的含量同时减少，说明LDL-C 的生成量减少导致血清TC 含量也减少，这与Sui 等[31]的研究结果基本一致。她们将植物乳杆菌SM-7 发酵乳对高脂小鼠模型进行灌胃试验后的结果也表明，小鼠血清TC 含量的减少与胆固醇的合成减少或代谢加速及与LDL-C 的减少等有关。
此外，3 组和4 组小鼠血清中的HDL-C 的含量相比1 组显著升高（P＜0.05），2 组与1 组相比虽也有升高，但不显著。3 组和4 组小鼠血清中TG 的含量与1 组相比降低不显著。说明添加植物乳杆菌S2-5 和K25的酸豆奶可以使血清HDL-C 的含量显著升高，而血清TG 含量变化不明显。AI 值是反映心血管疾病易患程度的一个指标，AI 值越高，患心血管疾病的概率越高。HDL-C 对心血管有保护作用，通常称之为“好胆固醇”，因为HDL-C 可以将血液中多余的胆固醇转运回肝脏，并通过酯化作用使胆固醇更容易降解[32]。本研究经植物乳杆菌S2-5 和K25 酸豆奶灌胃的小鼠的AI值与1 组相比下降极显著，这可能是由于HDL-C 水平的升高，导致胆固醇含量降低，从而可预防或改善动脉粥样硬化[33]。
3 结论
本研究分别将西藏灵菇来源的益生性植物乳杆菌K25 和酸菜来源的益生性植物乳杆菌S2-5 作为辅助发酵剂，与商品发酵剂复配发酵酸豆奶，对酸豆奶产品的品质进行分析评价，结果表明：添加益生性植物乳杆菌S2-5 和K25 的酸豆奶未产生不良风味，其口感更加细腻、绵滑、黏稠、均匀，且香气更加浓郁；植物乳杆菌S2-5 和K25 在酸豆奶冷藏期间具有较强的存活能力；酸豆奶样品冷藏期间，其滴定酸度随时间的延长呈上升趋势，pH 值呈下降趋势。
植物乳杆菌S2-5 和K25 发酵的酸豆奶对小鼠血清胆固醇的影响结果表明：与对照组相比，添加了植物乳杆菌S2-5 和K25 的酸豆奶致使血清中HDL-C 的含量显著升高，LDL-C、TC 以及AI 的水平显著地降低，而TG 无显著变化。由此可以判断植物乳杆菌S2-5 和K25 发酵的酸豆奶均具有良好的降胆固醇功效。因此，利用植物乳杆菌S2-5 和K25 开发具有降胆固醇功能的酸豆奶产品将具有广阔的市场前景。
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