藏羊（Tibetan sheep）又叫西藏羊，是我国现存原始绵羊之一，也是青海省的主要畜种资源[1]。羊血是藏羊屠宰加工的主要副产物，目前往往作为废弃物丢弃，不仅造成了珍贵资源的大量浪费，也带来了环境污染。因此，充分开发利用藏羊血液资源，变废为宝，是提高藏羊产业附加值的重要方式。
羊血富含蛋白质、铁、氨基酸、脂肪酸等，营养丰富，具有良好的功效，其中84.7% 为粗蛋白[2]，以血细胞内含的血红蛋白为主，还有血浆中的纤维蛋白、白蛋白和各类球蛋白等，是优质的天然蛋白质来源，具有较大的开发潜力。近年来利用动物血液制备生物活性肽的研究较多：以鸡血为原料，以木瓜蛋白酶和黄酮酶酶解鸡血血红蛋白得到鸡血多肽，具有较好的抗氧化效果[3]；利用胰蛋白酶水解新鲜鹿血制备鹿血多肽，在高浓度时对羟自由基和DPPH 自由基清除效果较好，可能含有抗氧化活性血肽[4]；Nikhita 等[5]采用酶和酸水解法对鸡血红蛋白进行水解，通过单因素和响应面试验优化得到最佳条件为加酸量0.03%、温度50 ℃、时间32.0 h，并通过DPPH 自由基清除试验和血管紧张素转化酶抑制试验，验证其具有抗氧化和降压的活性。
目前，我国在羊血资源的开发利用方面，主要开展了血红素提取[6]、血肽制备[7]、超氧化物歧化酶分离[8]等方面的研究。研究表明，羊血具有抗氧化、补血等功效，开发潜力较大，但对于高原特种藏羊血液的研究较少，且关键技术和活性尚不清晰，还需进一步探索。本研究以藏羊血液为原料，在筛选适宜水解酶基础上，以单因素筛选酶的适宜条件范围，采用响应面分析法优化酶解工艺条件，确定最佳酶解工艺，并对藏羊血多肽进行分离纯化，探讨其体外抗氧化活性，以期为藏羊血液资源的综合利用、提高产品附加值、促进青海省藏羊产业高质量发展提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 主要材料与试剂
藏羊血液：海晏金藏生态高原藏羊养殖繁育专业合作社提供。胰蛋白酶（25 万U/g）、木瓜蛋白酶（80 万U/g）、风味蛋白酶（1.5 万U/g）、中性蛋白酶（5 万U/g）：北京索莱宝科技有限公司；碱性蛋白酶（10 万U/g）、胃蛋白酶（3 万U/g）、邻苯二甲醛：上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：美国Sigma 公司；亚硫酸钠：山东奥创化工有限公司；水杨酸、FeSO4、H2O2：长春赛奥克生物科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.1.2 主要仪器与设备
L530R 医用离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；雷磁PHSI-5 实验室pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；GHH-1 数显恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；PIONEER™准微量天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；Spark 酶标仪：TECAN 公司；SCIENTZ-10N 冷冻干燥机、BCG-16A 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；NS4210 汉邦制备型高效液相色谱仪：江苏汉邦科技有限公司；N-1100V 旋转蒸发仪：日本东京理化公司；LC16 型高效液相色谱仪：日本岛津公司；Reprosil C18 AQ 色谱柱、SpHerical C18 色谱柱（50 μm，50 mm×500 mm）：迈德施（上海）分析仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 藏羊血的预处理
收集新鲜屠宰藏羊血液，加入4%柠檬酸钠抗凝，经2 层纱布过滤，放入-80 ℃超低温冰箱预冷冻，在冷冻干燥机冻干为血粉，备用。
1.2.2 藏羊血多肽的最适水解酶筛选
从中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中筛选最适水解酶。称取1 g 血粉于烧杯，以料液比为1∶7（mg/mL）加入去离子水，置于恒温水浴锅中，调节至各酶适宜温度，以0.1 mol/L 的NaOH 或HCl 溶液调节至酶最适pH 值，加酶量均为4%，在恒温水浴锅中酶解。各酶适宜酶解条件如表1 所示。
表1 不同蛋白酶的水解条件
Table 1 Hydrolysis conditions of different proteases
序号123456蛋白酶种类中性蛋白酶风味蛋白酶木瓜蛋白酶碱性蛋白酶胃蛋白酶胰蛋白酶适宜温度/℃50 50 50 37 37 37最适pH 值7.0 5.0 6.0 10.0 2.0 8.0酶解时间/h 555555
反应期间不断向反应液中加入NaOH 或HCl 溶液，使酶解液的pH 值基本稳定（±0.1），反应5 h 后，迅速转移到沸水浴中灭酶10 min，终止水解反应。酶解液于3 500 r/min 离心20 min，取上清液，测定水解度，确定最适蛋白酶。
1.2.3 藏羊血多肽的酶解条件优化
称取适量血粉，在筛选最佳蛋白酶的基础上，以水解度为指标，依次考察pH 值（5、6、7、8、9）、酶解时间（4、5、6、7、8 h）、酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）、料液比[1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（mg/mL）]和加酶量（300、600、900、1 200、1 500 U/g）对水解度的影响[9]。
1.2.4 响应面优化试验
根据单因素试验结果，以酶解时间（A）、酶解温度（B）、料液比（C）和加酶量（D）为自变量，水解度为响应值（Y）设计四因素三水平响应面试验，试验的因素和水平见表2。
表2 响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface test
水平-1 01因素A 酶解时间/h 456 B 酶解温度/℃50 55 60 C 料液比/（mg/mL）1∶6 1∶8 1∶10 D 加酶量/（U/g）600 900 1 200
1.2.5 藏羊血多肽色谱分离
将藏羊血多肽酶解液冷冻干燥制备成粉，由于藏羊血多肽黏度较大，对色谱柱影响较大，故取215.52 g藏羊血多肽，将其加入硅胶层析柱进行滤过，去除其中黏度较大的杂质，溶剂为二氯甲烷∶甲醇∶水（7∶3∶0.5，体积比），经旋转蒸发仪干燥得到72.32 g 藏羊血多肽粗样。使用中高压制备液相色谱，称取72.02 g 粗滤样品，采用固体上样法进行测定，使用SpHerical C18 色谱柱，甲醇（流动相B）线性上升溶于0.10% 三氟乙酸色谱级水溶液（流动相A），在60 min 内5% B 等度洗脱，在60~720 min 以5% B 至100% B 梯度洗脱，在720~960 min，使用100% B 等度洗脱，洗脱液流速为50.00 mL/min，在210、254 nm 处监测洗脱液吸光度。
1.2.6 水解度的测定
采用邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）法测定蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）[10-11]。根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，采用凯氏定氮法测定藏羊血粉以及藏羊血多肽水解液的蛋白质含量，取藏羊多肽水解液1 μL，用去离子水稀释1 000 倍，取40 μL 稀释液加入到300 μL 的OPA 试剂中，反应2 min，在340 nm 处测定吸光度。
以丝氨酸为对照品制备标准曲线[12]。配制0.8 mg/L丝氨酸标准溶液，采用倍比稀释法将其浓度分别稀释为0.40、0.20、0.10、0.05、0.01 mg/mL，各吸取40 μL，分别加入OPA 试剂300 μL，混合均匀，反应2 min 后，在340 nm 下测定吸光度，以丝氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。根据丝氨酸的标准曲线回归方程，计算酶解液中游离氨基的浓度。水解度计算公式如下。
式中：H 为水解度，%；C 为水解液游离氨基浓度，mg/mL；N 为水解液氮含量，mg/mL。
1.2.7 抗氧化能力测定
采用体外抗氧化模型对最优工艺条件下制备的藏羊血多肽进行抗氧化能力测定。以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照，分别配制不同浓度的多肽样品和VC 溶液，研究多肽对DPPH·和ABTS+·的清除能力。
1.2.7.1 DPPH·清除能力测定
参考文献[13]方法，略有修改。配制浓度为2 mmol/L的DPPH 乙醇溶液，避光存储。取不同浓度的藏羊血多肽溶液或VC 溶液100 μL 至96 孔板中，加入DPPH储备液100 μL 混合，室温条件下避光反应30 min，在517 nm 处检测吸光度。DPPH·的清除能力（X，%）计算公式如下。
式中：A1 为藏羊血多肽或VC 溶液的吸光度；A2 为藏羊血多肽或VC 与无水乙醇混合反应后的吸光度；A3为去离子水与DPPH 溶液混合反应后的吸光度。
1.2.7.2 ABTS+自由基清除能力测定
将5 mmol/L 的ABTS 溶液与7 mmol/L 的K2S2O8溶液混合振荡，在室温下避光放置12 h 以稳定自由基，用去离子水稀释50 倍，制备自由基试剂[14]。取不同浓度的藏羊血多肽溶液或VC 溶液50 μL 于96 孔板中，分别加入ABTS 储备液200 μL，混合，避光反应6 min，测定734 nm 处的吸光度。ABTS+自由基的清除能力（Y，%）计算公式如下。
式中：A1 为藏羊血多肽或VC 溶液的吸光度；A0 为以去离子水替代藏羊血多肽或VC 溶液后的吸光度。
1.3 数据统计与分析
试验数据采用SPSS 进行数据分析、Graph Pad.Prism.9.0.0.121 软件进行单因素试验作图，Design-Expert 11 软件进行响应面试验和方差分析，P＜0.01 表示影响极显著。
2 结果与分析
2.1 藏羊血多肽最佳水解酶的筛选
不同酶对藏羊血多肽水解度的影响见图1。
图1 不同酶对藏羊血多肽水解度的影响
Fig.1 Effect of different enzymes on the degree of hydrolysis of Tibetan sheep blood peptides
按照GB 5009.5—2016 方法，采用凯氏定氮法测得藏羊干燥血粉中蛋白含量为91.6%。由图1 可知，各酶对血粉的水解度不同。以风味蛋白酶最佳，酶解5 h 水解度可达48%，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶次之，依次为31%和27%，高于碱性蛋白酶（26.97%）[15]和胃蛋白酶（23.41%）[16]对藏羊血血清蛋白酶解后的水解度。本研究采用风味蛋白酶对藏羊血进行酶解，水解度更高，对蛋白质的解离效果更好。同时，许多酶的活性容易受环境特别是pH 值影响，而风味蛋白酶适宜的pH值较为稳定，且具有天然安全、可去除苦味、改善口感等优点[17]，因此本研究选用风味蛋白酶进行后续试验。
2.2 最佳酶解条件筛选
不同酶解条件对水解度的影响见图2。
图2 不同酶解条件对水解度的影响
Fig.2 Effect of different enzymatic conditions on the degree of hydrolysis
由图2a 可知，在pH5~9，随着碱性增强，水解度变化幅度不大，波动范围在28%~31%，因此后续试验可忽略pH 值的影响。
由图2b 可知，酶解时间在4~5 h，水解度随酶解时间延长明显升高，5 h 时水解度达到最大，为29.87%。酶解时间继续延长，可反应的底物量减少，反应趋于平稳[18]，水解度波动不大。因此选用4~6 h 进行响应面试验。
由图2c 可知，酶解温度在40~55 ℃，水解度随酶解温度升高而增大，55 ℃时水解度达到最大，为45.42%。继续升高温度，酶逐渐变性而失活，使酶解效率下降，水解度降低[19]。因此选用50~60 ℃进行响应面试验。
由图2d 可知，料液比在1∶6~1∶8（mg/mL）时，随着溶剂用量增加，水解度增大。在料液比为1∶8（mg/mL）时，水解度达到最大，为44.53%。进一步增加溶剂用量，水解度下降明显。可能因为随着溶剂的增加，酶的比例减少，酶与底物接触受限，从而降低了酶促反应效率[20]。因此，选取料液比1∶6~1∶10（mg/mL）进行响应面试验。
由图2e 可知，加酶量在300~900 U/g 时，随着加酶量提高，水解度升高明显，加酶量为900 U/g 时，水解度达到最大，为58.3%。继续提高酶量，水解度降低，可能是由于藏羊血蛋白分子与酶分子结合的位点有限，当结合位点被酶分子全部占用后，增加酶量意义不大。同时，从成本角度考虑，酶用量不宜过多[21-22]。因此，选取加酶量600~1 200 U/g 进行响应面试验。
2.3 响应面试验优化与验证结果
在单因素试验的基础上，以酶解时间、酶解温度、料液比和加酶量为考察因素优化酶解条件，结果如表3 所示。
表3 试验方案及结果
Table 3 Experimental program and results
序号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29因素A 酶解时间/h 54454456555556555565665555644 B 酶解温度/℃55 55 55 60 55 55 50 50 50 55 55 60 55 60 55 55 55 50 55 50 55 55 60 60 55 55 55 50 60 C 料液比/（mg/mL）1∶6 1∶8 1∶6 1∶8 1∶10 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶8 1∶10 1∶8 1∶8 1∶10 1∶10 1∶6 1∶6 1∶8 1∶10 1∶8 1∶10 1∶6 1∶8 1∶8 1∶8 1∶6 1∶8 1∶8 D 加酶量/（U/g）600 600 900 600 900 1 200 1 200 900 600 900 900 900 900 900 600 1 200 1 200 900 1 200 900 600 900 900 1 200 900 900 900 900 900水解度/%40.07 33.46 41.49 43.87 24.83 38.11 49.72 42.49 34.97 48.62 50.44 30.69 50.35 37.05 33.16 33.25 54.66 40.33 43.36 35.70 41.57 34.04 48.98 43.61 50.70 51.03 43.41 31.74 33.51
水解度模型方程为Y=52.08+2.95A+0.743 4B+6.44C+3.51D-1.8AB-1.86AC-0.715 0AD+3.45BC-3.75BD+3.66CD-8.4A2-4.95B2-8.31C2-2.81D2。
方差分析见表4。
表4 回归方程方差分析
Table 4 ANOVA for regression equation
注：*表示影响显著（p＜0.05）；**表示影响极显著（p＜0.01）。
方差来源模型A 酶解时间B 酶解温度C 料液比D 加酶量AB AC AD BC BD CD A2B2 C2D2残差失拟项纯误差总和自由度14 111111111111111 4 10 4 28均方113.07 98.45 6.23 497.55 139.07 13 14.31 2.04 49.25 56.33 55.37 457.8 159 393.6 51.12 1.97 2.4 0.877 9 F 值57.53 50.09 3.17 253.15 70.75 6.61 7.28 1.04 25.06 28.66 28.17 232.92 80.9 200.25 26.01 2.73 p 值＜0.000 1**＜0.000 1**0.096 7＜0.000 1**＜0.000 1**0.022 2*0.017 3*0.325 0 0.000 2**0.000 1**0.000 1**＜0.000 1**＜0.000 1**＜0.000 1**0.000 2**0.172 3
由表4 可知，模型的总回归极显著（p＜0.01），决定系数R2 为0.982 9，R2Adj 为0.965 8，R2 与R2Adj 接近于1且差值较小，说明响应面的优化程度好，失拟项不显著（p>0.05），说明该模型可用于藏羊血多肽的最优制备工艺的模拟。模型中一次项A、C、D 和二次项A2、B2、C2、D2 对试验结果影响极显著（p＜0.01）。根据F 值大小可知，各因素对藏羊血多肽水解度影响的主次顺序为C＞D＞A＞B，即料液比>加酶量>酶解时间>酶解温度。
两因素交互作用响应面图见图3。
图3 两因素交互作用对水解度的影响
Fig.3 Effect of the interaction of two factors on the degree of hydrolysis
由图3 可知，BC、BD、CD 的交互作用强于其余各组，BC 相互作用时，料液比3D 结构陡峭且2D 结构呈椭圆形，变化程度高于酶解温度，表明料液比相较于酶解温度更显著；BD 相互作用时，加酶量3D 结构陡峭且2D 结构呈椭圆形，幅度变化明显高于酶解温度，表明加酶量相较于酶解温度更显著；CD 交互作用时，料液比3D 结构陡峭变化程度高于加酶量，且2D 结构呈较为密集的椭圆状，表明料液比对水解度的影响远高于加酶量。
通过拟合回归方程计算，理论水解度最大可达54.97%，制备藏羊血多肽的最佳工艺为酶解时间5.12 h、酶解温度55.67 ℃、料液比1∶6.75（mg/mL）、加酶量1 053.78 U/g。
为便于试验操作，将最佳酶解条件修正为酶解时间5 h、酶解温度56 ℃、料液比1∶7（mg/mL）、加酶量1 050.00 U/g。在该条件下开展验证试验，测得水解度为（54.90±0.32）%，与预测值接近，表明此模型预测的最优工艺条件与实际相符。
2.4 藏羊血多肽粗样抗氧化能力
藏羊血多肽粗样抗氧化能力见图4。
图4 藏羊血多肽抗氧化能力
Fig.4 Antioxidant capacity of Tibetan sheep blood peptides
由图4 可知，藏羊血多肽浓度在5~25 mg/mL 时，对DPPH·和ABTS+·清除能力与阳性对照VC 趋势一致，均随浓度升高而增大，清除率分别从35.45%升高到70.68%，从40.32%升高到63.75%。浓度为25 mg/mL时，对DPPH·和ABTS+·清除能力分别达到VC 的77%和87%，IC50 分别为（17.97±1.07）mg/mL 和（14.36±0.63）mg/mL，说明高浓度的多肽具有较好的抗氧化能力。
2.5 藏羊血多肽各组分抗氧化活性
使用旋转蒸发仪干燥后得到样品共47.85 g，回收率为66.5%。使用SpHerical C18 色谱柱分离制备，分离得到10 个组分（Fr1~Fr10），其液相色谱图和抗氧化试验结果如图5 和图6 所示。
图5 藏羊血多肽粗样液相色谱图
Fig.5 Liquid chromatography of crude samples of Tibetan sheep blood peptides
图6 藏羊血多肽粗样及各组分抗氧化能力
Fig.6 Antioxidant capacity of crude samples of Tibetan sheep blood peptides and each component
如图6 所示，组分Fr2~Fr5 与阳性对照相比，DPPH·清除能力超过阳性对照90%以上，组分Fr2~Fr5的ABTS+·清除率均达阳性对照的95%。其中Fr3 的抗氧化活性在不同浓度时，DPPH·和ABTS+·清除能力均高于阳性对照，显示出较好的抗氧化活性。
3 结论
本研究以藏羊血液为原料，采用单因素和响应面法优化藏羊血多肽的制备工艺，并进行体外抗氧化能力测定。结果显示，最佳蛋白酶为风味蛋白酶，最佳酶解条件为酶解时间5 h、酶解温度56 ℃、料液比1∶7（mg/mL）、加酶量1 050.00 U/g。经测定，藏羊血肽粗样在高浓度时对DPPH·和ABTS+·的清除率分别可达阳性对照（VC）的77%和87%，IC50 分别为（17.97±1.07）mg/mL 和（14.36±0.63）mg/mL，分离后的组分Fr3 显示出较好的抗氧化活性。本研究可为进一步探究藏羊血多肽的生物活性、开发和综合利用废弃畜血资源提供参考。
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