菜芙蓉[Abelmoschus manihot（L.）Medic]又名野芙蓉、金花葵，是锦葵科秋葵属一年生或多年生草本开花植物[1]，广泛分布在东欧、亚洲的温带和亚热带地区，在南太平洋岛国通常被视为一种主要的食用型绿叶蔬菜，并且也被用来制作茶叶。菜芙蓉在200 多种秋葵植物中最具食用、药用和保健功能，被称为植物“大熊猫”[2]，目前在华北地区、江苏、安徽和广东等地广泛种植。菜芙蓉花中的化学成分复杂[3]，包括黄酮类化合物、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素E、核苷类、多糖类和长链烃类等化合物。其中，菜芙蓉主要活性物质黄酮的含量超出黄酮生产的主要原料大豆、银杏等数十倍[4]。菜芙蓉黄酮主要包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、芦丁、杨梅素等，具有镇痛、抗炎、降血脂、免疫调节、抗氧化等功效[5]，在功能性食品和药品等方面具有广阔的应用前景。
目前，菜芙蓉黄酮提取多采用水或乙醇作为溶剂进行提取，水浸提取效率低且提取液易霉变，醇提则存在溶剂用量大、周期长、成分复杂及纯度不高等问题。双水相提取（aqueous two-phase extraction，ATPE）是根据生物活性物质在两相间的溶解性不同而实现高效分离的一种新型提取分离技术，在与水互溶的有机溶剂中加入盐后，由于电解质的水合作用破坏了有机溶剂与水之间弱的作用力，体系分相并形成互不相容的双水相体系，物质在两相间选择性分配，易溶于醇的黄酮成分被提取到上相，水溶性杂质则溶于下相。其具有提取率高、提取条件温和、目标产物活性保持好等优点[6]，被广泛应用于生物黄酮[7]、花青素[8]、多酚[9]等生物活性物质的大规模回收和纯化。超声提取法利用超声空化增加对植物组织细胞壁的破坏，改善从细胞到溶剂的传质，加速目标化合物的释放[10]。将超声和双水相提取协同作用，能够缩短提取时间，降低能耗，提高提取效率和产物纯度，在同一体系内实现提取、分离与纯化的目的。Wei 等[11]利用传统的70%乙醇回流提取菟丝子种子黄酮，得率仅为3.43 mg/g，采用双水相法提取率提高到18.75 mg/g。石统帅等[12]通过超声协同双水相萃取的黑果腺肋花楸果实抗氧化成分对自由基的平均清除率为59.36%，显著高于单一双水相法的48.27%和超声醇提法的49.55%。
目前，应用超声协同乙醇-硫酸铵双水相系统提取菜芙蓉花黄酮未见研究报道。本研究旨在探索超声协同双水相在菜芙蓉花黄酮提取中的应用潜力，获得比传统方法更高的黄酮提取率和具有更高抗氧化活性的黄酮。鉴于此，本研究通过单因素和响应面法优化菜芙蓉花黄酮提取工艺，利用超高效液相色谱-轨道离子阱质谱（ultra-high performance liquid chromatography-orbit ion trap mass spectrometry，UPLC-Orbitrap-MS）对提取的黄酮化合物进行鉴定，评估黄酮提取物的抗氧化活性，分析黄酮单体与抗氧化活性的相关性，以期为实现菜芙蓉花绿色、高效提取高抗氧化活性黄酮的工业应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菜芙蓉花：产自河北省井陉县，2023 年7~9 月盛花期采摘，50 ℃烘干至恒重，粉碎过80 目筛，备用；金丝桃苷（≥98%）、槲皮素（99.1%）、杨梅素（98.31%）、异槲皮素（98%）、芦丁（≥98%）标准品：上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：日本和光纯药工业株式会社；2，2′-联氮二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS]：南京奥多福尼生物科技有限公司；过硫酸钾、硫酸铵、无水乙醇、亚硝酸钠：天津市永大化学试剂有限公司；硝酸铝：上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂。所用试剂除特殊注明外，均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SpectraMAX i3x 酶标仪：美国美谷分子仪器有限公司；1525 型高效液相色谱系统、2998 型光电二极管阵列检测器：美国沃特世科技有限公司；Vanquish 超高效液相系统、Orbitrap Exploris 120 质谱检测器：美国赛默飞世尔科技有限公司；MB-96 型组织研磨器：浙江美壁仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 超声协同双水相提取菜芙蓉花总黄酮
取一定质量的菜芙蓉花粉末加入至50 g 的乙醇-硫酸铵双水相体系中，在一定超声功率下，50 ℃，超声40 min 后，抽滤，滤液置于刻度试管中静置40 min 分液，测定上相和下相体积。参照文献[13]的方法，以芦丁为标准品，绘制标准曲线（Y=10.291X-0.002 3，R2=0.998 5），计算总黄酮浓度（mg/mL）。
1.3.1.1 单因素试验
选择乙醇质量分数（28%、29%、30%、31%、32%）、硫酸铵质量分数（14%、16%、18%、20%、22%）、超声功率（150、180、210、240、270 W）、菜芙蓉花粉末质量（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g）进行单因素试验。
提取结束后室温静置、分液后计算相比（R）、分配系数（K）、提取率（Y，%），计算公式如下。
式中：R 为相比；K 为分配系数；Vt、Vb 分别为上、下相的体积，mL；Ct、Cb 分别为上、下相的总黄酮质量浓度，mg/mL。
1.3.1.2 响应面试验设计
在单因素试验结果的基础上，确定影响菜芙蓉花黄酮提取率的重要因素，利用Design-Expert 13 软件，以硫酸铵质量分数、菜芙蓉花粉末质量和超声功率为变量，以菜芙蓉花黄酮的提取率为响应值，进行三因素三水平的响应面设计。响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests
水平-1 01因素A 硫酸铵质量分数/%18 20 22 B 菜芙蓉花粉末质量/g 0.50 0.75 1.00 C 超声功率/W 180 210 240
1.3.2 与其他提取方法的比较
为评估超声协同双水相法，比较此法与双水相法、超声辅助法、醇提法对菜芙蓉花黄酮的提取效果及其抗氧化能力。
超声协同双水相法：乙醇和硫酸铵的质量分数分别为31%和20%，用去离子水将体系补充至50 g。加入菜芙蓉花粉末0.5 g，超声功率210 W，超声温度50 ℃，提取40 min。
双水相法：乙醇-硫酸铵双水相体系中加入0.5 g菜芙蓉花粉末，搅拌提取40 min。
超声辅助法：将0.5 g 菜芙蓉花粉末按照料液比1∶40（g/mL）溶于75% 的乙醇中，超声功率为210 W，超声提取40 min。
醇提法：将0.5 g 菜芙蓉花粉末按照料液比1∶40（g/mL）溶于75% 的乙醇中，并在70 ℃水浴中浸提2 h。
1.3.3 总黄酮含量的测定
根据1.3.1 芦丁标准曲线得到总黄酮浓度（Cf，mg/mL），总黄酮含量（M，mg/g）计算公式如下。
式中：V 为提取液体积，mL；m 为菜芙蓉花粉末质量，g。
1.3.4 菜芙蓉花黄酮的抗氧化活性测定
收集超声协同双水相黄酮提取液上相，4 ℃冰箱静置过夜，8 000 r/min 离心5 min，收集上清液，真空旋转蒸发浓缩。参照文献[14-17]方法测定黄酮对DPPH∙，ABTS+∙和O2-∙的清除能力以及总还原力，计算半数效应浓度（median effect concentration，EC50）。
1.3.5 UPLC-Orbitrap-MS 分析
1.3.5.1 样品溶液制备
取适量菜芙蓉花粉末于2 mL 离心管中，加入600 μL 甲醇（含4 mmol/L 2-氯-L-苯丙氨酸），涡旋振荡30 s，加入钢珠，放入组织研磨器中，55 Hz 研磨60 s，室温超声15 min，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液过0.22 μm 滤膜，过滤液加入到检测瓶中，用于检测。
1.3.5.2 超高效液相色谱（UPLC）条件
利用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。
正离子模式流动相为0.1%甲酸乙腈（B2）和0.1%甲酸水（A2），梯度洗脱程序：0~1 min，8%B2；1~8 min，8%~98% B2；8~10 min，98% B2；10~10.1 min，98%~8%B2；10.1~12 min，8%B2。
负离子模式流动相为乙腈（B3）和5 mmol/L 甲酸铵水（A3），梯度洗脱程序：0~1 min，8% B3；1~8 min，8%~98% B3；8~10 min，98% B3；10~10.1 min，98%~8%B3；10.1~12 min，8%B3。
1.3.5.3 质谱条件
利用Orbitrap Exploris 120 质谱检测器，电喷雾电离（electrospray ionization，ESI），正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气275.8 kPa，辅助气3.3 L/min。毛细管温度325 ℃，以分辨率60 000 进行一级全扫描，一级离子扫描范围（m/z）100~1 000，并采用高能碰撞解离（high energy collision dissociation，HCD）进行二级裂解，碰撞能量为30%，二级分辨率为15 000，采集信号前4 离子进行碎裂，同时采用动态排除去除不必要的MS/MS 信息。
1.3.6 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析
参照Lai 等[18]的方法并略作改动，取0.5 g 菜芙蓉花粉末按照优化条件提取菜芙蓉花黄酮，取上相进行HPLC 分析。Waters Symmetry C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：体积分数0.1% 磷酸（A）—乙腈（B），梯度洗脱（0~17 min，85%A；18~25 min，84%A；26~34 min，80% A；35~44 min，60% A；45~50 min，85%A），检测波长370 nm、柱温30 ℃、流速1.0 mL/min、进样体积10 μL。
1.4 数据处理
所有试验均重复3 次，数据以平均值±标准差表示。利用Design-Expert 13 软件进行Box－Behnken 试验设计，采用SPSS 27 进行数据分析，Origin 2021 用于作图。物质鉴定过程使用Human Metabolome Database（HMDB）（http：//www.hmdb.ca）、massbank（http：//www.massbank.jp/）、LipidMaps（http：//www.lipidmaps.org）、mzclound（https：//www.mzcloud.org）、KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）数据库进行检索比对。
2 结果与分析
2.1 超声协同双水相体系提取菜芙蓉花黄酮单因素试验
2.1.1 乙醇质量分数对分配系数、相比、提取率的影响
乙醇质量分数对分配系数、相比、提取率的影响见图1。
图1 乙醇质量分数对分配系数、相比、提取率的影响
Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on partition coefficient，phase ratio，and extraction rate
由图1 可知，随着乙醇质量分数的增加，相比逐渐增加，分配系数则表现为先增大后减小的趋势。乙醇质量分数为28%~31%时，提取率持续升高，当乙醇质量分数达31%时，提取率最高，达97.58%。随乙醇质量分数增加，上相结合水的能力增强故体积增大，有利于醇溶性的黄酮在上相富集，但是乙醇浓度过高溶液极性降低，会引起其他有机小分子的溶出而抑制黄酮的萃取[19]。因此，最佳乙醇质量分数为31%。
2.1.2 硫酸铵质量分数对分配系数、相比、提取率的影响
硫酸铵质量分数对分配系数、相比、提取率的影响见图2。
图2 硫酸铵质量分数对分配系数、相比、提取率的影响
Fig.2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on partition coefficient，phase ratio，and extraction rate
由图2 可知，随着硫酸铵质量分数的增加，相比逐渐降低，这是因为随着盐浓度的增加结合水的能力增强，下相体积增大。分配系数则呈先增大后减小的趋势。硫酸铵质量分数为14%~20% 时，随着硫酸铵质量分数的增加，提取率逐渐升高，当硫酸铵质量分数为20% 时，提取率最高，为97.83%。当硫酸铵质量分数继续升高，体系中的盐溶液过饱和导致盐析出，菜芙蓉花黄酮随盐从体系中沉淀出来，导致提取率急剧下降[20]。因此，选择硫酸铵质量分数为18%、20%、22%进行后续试验。
2.1.3 超声功率对分配系数、相比、提取率的影响
超声功率对分配系数、相比、提取率的影响见图3。
图3 超声功率对分配系数、相比、提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on partition coefficient，phase ratio，and extraction rate
由图3 可知，超声功率为150~210 W 时，分配系数和提取率均随着超声功率增加而整体增加，且在210 W时达到峰值，分别为41.52 和97.85%。超声功率继续增加，二者表现为急剧下降的趋势，这可能是由于超声功率过高致使植物细胞内部过热，破坏了黄酮化合物的结构。而相比随超声功率的增加变化不大。因此，选择超声功率为180、210、240 W 进行后续试验。
2.1.4 菜芙蓉花粉末质量对分配系数、相比、提取率的影响
菜芙蓉花粉末质量对分配系数、相比、提取率的影响见图4。
图4 菜芙蓉花粉末质量对分配系数、相比、提取率的影响
Fig.4 Effect of A.manihot flower powder amount on partition coefficient，phase ratio，and extraction rate
由图4 可知，相比随菜芙蓉花粉末质量增加逐渐升高而后略有下降。当菜芙蓉花粉末质量小于0.75 g时，分配系数和提取率逐渐增加，当菜芙蓉花粉末质量为0.75 g 时二者均达到最高值，分别为45.40 和98.02%。黄酮化合物通常与细胞内的蛋白质、多糖等通过疏水键以结合态形式存在，溶剂进入细胞内破坏疏水键进而释放黄酮类物质。当菜芙蓉花粉末质量较低时，上相中的乙醇与菜芙蓉花粉末的接触面积较大，促进黄酮的溶出，当菜芙蓉花粉末质量继续增加，超出了溶剂的萃取能力，甚至溶出的黄酮吸附到待提物中，造成提取率下降[12]。因此，选择菜芙蓉花粉末质量为0.50、0.75、1.00 g 进行后续试验。
2.2 响应面试验
2.2.1 响应面优化结果分析
以黄酮提取率为响应值Y，选取对黄酮提取率影响程度较大的3 个因素（硫酸铵质量分数、菜芙蓉花粉末质量和超声功率）进行响应面试验设计，结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface experimental design and results
试验号1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17因素A 硫酸铵质量分数/%20 22 18 18 20 20 20 18 20 20 22 22 20 20 18 22 20 B 菜芙蓉花粉末质量/g 0.75 1.00 0.75 0.75 0.75 0.75 0.50 1.00 0.50 1.00 0.50 0.75 1.00 0.75 0.50 0.75 0.75 C 超声功率/W 210 210 180 240 210 210 240 210 240 240 210 180 180 210 210 240 210提取率/%97.51 97.64 95.31 97.52 98.35 98.07 97.75 94.96 97.92 97.55 97.85 97.29 96.06 97.87 97.46 97.45 98.34
对表2 的数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程：Y=98.03+0.62A-0.60B+0.46C+0.57AB-0.51AC+0.42BC-0.74A2-0.31B2-0.40C2。利用Design-Expert 13进行回归分析，方差分析结果见表3。
表3 响应面试验设计回归模拟方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface experimental design for regression model
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
差异来源模型ABCA B AC BC A2B2 C2残差失拟项纯误差总离差平方和14.40 3.11 2.83 1.70 1.31 1.05 0.69 2.30 0.41 0.66 0.85 0.35 0.50 15.24自由度91111111117341 6均方1.60 3.11 2.83 1.70 1.31 1.05 0.69 2.30 0.41 0.66 0.12 0.12 0.12 F 值13.21 25.68 23.40 14.06 10.85 8.66 5.74 18.98 3.37 5.45 0.93 P 值0.001 3 0.001 5 0.001 9 0.007 2 0.013 2 0.021 6 0.047 8 0.003 3 0.109 2 0.052 3 0.502 3显著性*************
由表3 可知，回归模型的P=0.001 3＜0.01，表示模型极显著，模型失拟项P=0.502 3>0.05，表明黄酮提取率的实际值与预测值之间具有较高的拟合度。F 值表示菜芙蓉花黄酮提取率受因素影响的强弱，3 个因素对提取率的影响先后顺序为A（硫酸铵质量分数）>B（菜芙蓉花粉末质量）>C（超声功率）。回归模型的一次项A、B、C，二次项A2对提取率的影响均极显著（P＜0.01），交互项AB、AC、BC 对提取率的影响显著（P＜0.05），说明不同因素与响应值之间不是简单的线性关系。
两因素交互作用的响应曲面及其等高线见图5。
图5 硫酸铵质量分数、菜芙蓉花粉末质量和超声功率交互作用的响应曲面和等高线
Fig.5 Response surface and contour map of the interaction of ammonium sulfate mass fraction，A.manihot flower powder amount，and ultrasonic power
由图5 可知，交互项AB、AC、BC 响应曲面较陡，等高线呈椭圆形、颜色变化较快且分布密集，说明交互作用显著[21-22]，与表3 分析结果吻合。
2.2.2 模型诊断
菜芙蓉花黄酮提取率的模型适应性诊断如图6所示。
图6 模型适应性诊断图
Fig.6 Model adaptive diagnostic diagram
由图6a 可知，内部学生化残差与运行次数所有的点分布无规律但都在-3~3 之间，表明模型符合适应性及正态性假设[23]。由图6b 可知，内部学生化残差与正态分布概率数据点分布对称、环绕零波动、无明显异常点且接近一条直线，说明方差没有偏差，模型稳定。综上，该模型具有较高的准确性和可信度。
2.2.3 验证试验
通过Design-Expert 13 对模型优化分析，得到最优工艺条件为硫酸铵质量分数20.13%、菜芙蓉花粉末质量0.54 g、超声功率213.18 W，此条件下菜芙蓉花黄酮的提取率预测值为98.32%。考虑到试验条件的可操作性，最优工艺条件调整为硫酸铵质量分数20%、菜芙蓉花粉末质量0.5 g、超声功率210 W，并进行3 次重复验证试验，提取率为（98.31±0.13）%，此时相比为1.16±0.03，分配系数为50.13±2.50，与预测结果基本一致，说明该回归模型合理可行。
2.3 UPLC-Orbitrap-MS 分析鉴定结果
超声协同双水相提取菜芙蓉花黄酮在正负离子模式下的UPLC-Orbitrap-MS 基峰强度离子流图见图7。
图7 菜芙蓉花超声协同双水相提取黄酮UPLC-Orbitrap-MS 检测的正、负离子模式下的总离子流图
Fig.7 Total ion current diagrams in positive and negative ion modes of UPLC-Orbitrap-MS determine in the A.manihot（L.）Medic flower flavonoids by ultrasound-assisted aqueous two-phase extraction
由图7 可知，正、负离子流均有良好的分离效果和离子化效率。经质谱裂解碎片分析，菜芙蓉花黄酮提取液中黄酮类化合物鉴定结果见表4。
表4 菜芙蓉花黄酮提取物中黄酮类化合物鉴定结果
Table 4 Identification results of flavonoid compounds in A.manihot（L.）Medic flower flavonoid extract
编号1234567891 0 11 12化合物名称金丝桃苷异鼠李素异牡荆素山奈酚杨梅素柚皮素槲皮素芦丁紫云英苷鸡豆黄素A儿茶酚花青素-3-葡萄糖苷保留时间/s 662.9 381.9 464.7 376.8 579.7 373.0 643.3 274.4 292.0 551.3 407.1 227.8分子质量/Da 464.095 5 316.058 3 432.105 6 286.047 7 318.037 6 272.068 5 302.042 7 610.153 4 448.100 6 284.068 5 290.079 0 449.108 4质荷比465.108 9 317.066 0 432.228 8 287.054 7 317.030 5 273.074 7 301.035 5 611.157 0 447.105 5 283.168 2 289.080 2 449.110 7分子式C21H20O12 C16H12O7 C21H20O10 C15H10O6 C15H10O8 C15H12O5 C15H10O7 C27H30O16 C21H20O11 C16H12O5 C15H14O6 C21H21O11离子模式[M+H]+[M+H]+[M]+[M+H]+[M-H]-[M+H]+[M-H]-[M+H]+[M-H]-[M-H]-[M-H]-[M]+
续表4 菜芙蓉花黄酮提取物中黄酮类化合物鉴定结果
Continue table 4 Identification results of flavonoid compounds in A.manihot（L.）Medic flower flavonoid extract
注：*表示菜芙蓉花首次鉴定出的黄酮化合物，#表示菜芙蓉花醇提法未鉴定出的黄酮物质。
编号13 14 15 16*17*18*19*20 21 22 23 24 25*26#27*28 29#30 31 32*33 34 35*#36*37 38*39 40 41 42 43 44 45 46*47*#48 49 50*51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63化合物名称花青素-3-O-（β-D-木糖基-（1→2）-β-D-半乳糖苷）花青素-3-芸香糖苷飞燕草素-3-芸香糖苷香叶木苷表儿茶素圣草酚染料木黄酮染料木素黄豆黄素橙皮素橙皮素7-新橘皮糖苷高圣草酚查尔酮（+）-脱甲氧基天竺葵（2S）-黄烷酮（2S）-甘草素山奈酚胺3-O-甲基槲皮素山柰酚3-麦冬皂苷山奈酚-3-O-芸香糖苷卡利诺A木犀草素木犀草素7-葡萄糖苷3-叔丁基-5-甲基邻苯二酚5，7-二羟基黄酮柚皮素7-O-β-D-葡萄糖苷川陈皮素毒叶素芹菜素槲皮素3-（2G-木糖基芸香苷）槲皮素-3-（6′′-丙二酰基葡糖苷）槲皮素3-O-β-D-葡萄糖基-（1->2）-β-D-葡萄糖苷异槲皮苷芹菜素-7-（6′′-丙二酰葡糖苷）水飞蓟素橘皮素草质素槲皮苷二氢杨梅素鸢尾苷花青素-5-O-葡萄糖苷花青素-3-O-（6-O-丙二酰基-β-D-葡萄糖苷）花青素-3-O-（6′′-葡萄糖基-2′′-木糖基半乳糖苷）槲皮素-3-硫酸酯槲皮素-3-O-[β-D-木糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷]橙皮素7-O-葡萄糖苷鸡豆黄素A-7-（6-丙二酰基葡糖苷）飞燕草素-3-O-β-D-葡萄糖苷-5-O-（6-香豆酰基-β-D-葡萄糖苷）飞燕草素-3-葡萄糖苷-5-咖啡酰基葡萄糖苷飞燕草素-3，5，3′-三葡萄糖苷飞燕草素-3-O-β-D-三丁二糖苷飞燕草素-3-O-（6′′-O-丙二酰基）-β-葡萄糖苷-3′-O-β-葡萄糖苷保留时间/s 226.6 287.8 274.4 311.8 255.9 341.8 348.7 226.3 435.2 334.1 274.4 216.3 495.7 72.1 320.1 383.2 380.1 258.4 287.8 456.2 293.2 293.2 315.8 429.2 304.4 435.8 223.1 437.5 253.3 316.1 229.2 514.8 308.1 614.2 457.3 308.4 303.8 247.5 301.5 293.2 304.9 258.1 310.7 264.8 332.7 320.7 258.4 248.1 248.1 267.0 270.7分子质量/Da 581.150 6 595.166 3 611.161 2 608.174 1 290.079 0 288.063 4 270.052 8 432.105 6 284.068 5 302.079 0 610.189 8 302.079 0 370.141 6 224.083 7 256.073 6 300.063 4 316.058 3 772.206 2 594.158 5 392.223 1 286.047 7 448.100 6 180.115 0 254.057 9 434.121 3 402.131 5 304.058 3 270.052 8 742.195 6 550.095 9 626.148 3 464.095 5 518.106 0 482.121 3 372.120 9 302.042 7 448.100 6 320.053 2 462.116 2 449.108 4 535.108 8 743.203 5 381.999 5 596.137 7 464.131 9 532.121 7 773.192 9 789.187 8 789.208 9 597.145 6 713.156 5质荷比581.146 5 595.171 0 611.127 7 607.161 1 289.074 3 287.056 5 269.045 4 432.102 3 283.063 8 303.081 9 611.184 2 303.085 2 353.143 9 224.091 4 257.080 1 299.055 2 315.047 6 773.237 5 595.158 0 393.233 0 287.053 0 449.121 1 181.120 9 253.050 7 435.126 1 403.138 4 305.065 7 269.045 4 741.178 1 551.098 0 627.144 8 463.093 2 499.075 2 465.120 3 373.129 0 303.047 9 449.106 8 320.049 1 462.113 6 449.092 7 535.103 7 743.207 8 380.989 9 595.124 3 465.134 5 533.125 1 773.188 8 789.184 4 789.204 1 597.141 2 713.144 1分子式C26H29O15 C27H31O15 C27H31O16 C28H32O15 C15H14O6 C15H12O6 C15H10O5 C21H20O10 C16H12O5 C16H14O6 C28H34O15 C16H14O6 C21H22O6 C15H12O2 C15H12O4 C16H12O6 C16H12O7 C33H40O21 C27H30O15 C22H33ClN2O2 C15H10O6 C21H20O11 C11H16O2 C15H10O4 C21H22O10 C21H22O8 C15H12O7 C15H10O5 C32H38O20 C24H22O15 C27H30O17 C21H20O12 C24H22O13 C25H22O10 C20H20O7 C15H10O7 C21H20O11 C15H12O8 C22H22O11 C21H21O11 C24H23O14 C32H39O20 C15H10O10S C26H28O16 C22H24O11 C25H24O13 C36H37O19 C36H37O20 C33H41O22 C26H29O16 C30H33O20离子模式[M]+[M]+[M]+[M-H]-[M-H]-[M-H]-[M-H]-[M]-[M-H]-[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M+H-H2O]+[M]+[M+H]+[M-H]-[M-H]-[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M-H]-[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M-H]-[M-H]-[M+H]+[M+H]+[M-H]-[M-H2O-H]-[M+H-H2O]+[M+H]+[M+H]+[M+H]+[M]-[M]-[M]+[M]+[M]+[M-H]-[M-H]-[M+H]+[M+H]+[M]+[M]+[M]+[M]+[M]+
由表4 可知，两种模式下共鉴定出63 个黄酮类化合物。其中正离子模式下鉴定出金丝桃苷、山奈酚、芦丁、柚皮素等，负离子模式下鉴定出杨梅素、槲皮素、异槲皮苷、二氢杨梅素等。醇提法黄酮共鉴定出59 个黄酮化合物，超声协同双水相提取法增加的4 个化合物分别为川陈皮素、橘皮素、（2S）-甘草素、3-叔丁基-5-甲基邻苯二酚。杨雷[24]利用高效液相串联质谱对甲醇超声提取的金花葵花样品进行分离鉴定，得到46 个化合物。王瑞君等[2]利用甲醇超声提取金花葵干花、花苞和鲜花样品，经超高效液相串联四极杆飞行时间质谱分离鉴定出包括牡荆素、金丝桃苷、槲皮素、红景天苷、芦丁、异槲皮素、杨梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷等在内58 个黄酮类化合物。与已报道的金花葵黄酮类化合物[2，24-25]比对可知，超声协同双水相提取物中有13 种黄酮类化合物首次得以鉴定，分别是香叶木苷、表儿茶素、圣草酚、染料木黄酮、（+）-脱甲氧基天竺葵、（2S）-甘草素、卡利诺A、3-叔丁基-5-甲基邻苯二酚、5，7-二羟基黄酮、川陈皮素、水飞蓟素、橘皮素、二氢杨梅素。综上，菜芙蓉原料和提取工艺的差异可能是导致提取黄酮种类及抗氧化性不同的主要原因。
2.4 不同提取方法制备的菜芙蓉花黄酮抗氧化活性比较
为了评价超声协同双水相法的提取效果，将其与双水相法、超声辅助法和醇提法进行比较，结果见表5。
表5 不同提取方法制备的菜芙蓉花黄酮抗氧化性比较
Table 5 Antioxidant properties of flavonoid from A.manihot（L.）Medic flower prepared by different extraction techniques
注：同列不同小写字母表示组间差异显著，P＜0.05。
提取方法超声协同双水相法双水相法超声辅助法醇提法黄酮含量/（mg/g）43.94±1.48a 39.28±1.74b 35.38±0.77c 34.27±0.36c EC50/（μg/mL）DPPH∙清除率6.37±0.44b 6.83±0.37b 7.60±0.63b 12.75±1.96a ABTS+·清除率17.71±1.41b 21.55±1.49ab 22.15±3.91ab 27.52±4.75a平均清除率12.04±0.48c 14.19±0.56b 14.88±1.64b 20.14±1.40a
由表5 可知，超声辅助法、双水相法和超声协同双水相法提取的黄酮含量均高于传统的醇提法，分别提高3.24%（P＞0.05）、14.62%（P＜0.05）、28.22%（P＜0.05）。抗氧化能力随着黄酮含量的增加而增强。超声协同双水相法提取的黄酮对DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率的EC50 值较醇提法的黄酮分别降低了50.04%和35.65%（P＜0.05），平均清除率EC50 则降低了40.22%（P＜0.05），显示出较强的抗氧化能力。Li 等[26]利用4 种不同方法提取苹果渣中的多酚，发现随着提取温度的升高，多酚单体的种类及抗氧化性都会降低。在本研究中，醇提法提取温度（70 ℃）高于超声协同双水相法（50 ℃），黄酮含量及抗氧化性均下降，可能是由于部分黄酮降解导致。
2.5 菜芙蓉花黄酮主要成分与抗氧化活性的相关性分析
优化工艺条件下提取的菜芙蓉花黄酮HPLC 分离图谱见图8。
图8 HPLC 图谱
Fig.8 HPLC chromatogram
由图8 可知，5 个菜芙蓉花主要黄酮成分色谱峰的分离度和峰形良好，通过HPLC 分析比较标准品与菜芙蓉花黄酮样品的保留时间与峰面积，可以测定菜芙蓉黄酮中主要黄酮成分含量。菜芙蓉花主要黄酮成分定量分析结果见表6。
表6 菜芙蓉花主要黄酮成分定量分析
Table 6 Content of main flavonoid compounds in A.manihot flower extracts analyzed by HPLC
黄酮成分芦丁金丝桃苷异槲皮苷杨梅素槲皮素保留时间/min 20.046 21.711 23.211 32.526 36.501回归方程y=12 052.707x-8 531.083 y=19 839.085x-19 177.875 y=18 954.798x-18 472.500 y=35 934.721x-68 896.667 y=44 075.919x-69 717.167相关系数0.997 1 0.996 9 0.997 3 0.995 1 0.996 9线性范围/（μg/mL）3.14~50.20 2.63~42.10 2.80~44.80 1.55~24.80 1.62~25.85含量/（μg/g）814.54 7 109.03 4 319.32 1 138.73 549.40
由表6 可知，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素和槲皮素含量分别为814.54、7 109.03、4 319.32、1 138.73、549.40 μg/g。
分别以芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素和槲皮素的含量为标准，对黄酮提取液进行梯度稀释，测定不同质量浓度条件下5 种黄酮成分对3 种自由基的清除率以及总还原力，分析相关性系数。主要成分与抗氧化活性的相关性分析见表7。
表7 主要成分与抗氧化活性的相关性分析
Table 7 Correlation between antioxidant activities and main flavonoids content
注：*表示相关性显著，P＜0.05；**表示相关性极显著，P＜0.01。
项目芦丁含量金丝桃苷含量异槲皮苷含量杨梅素含量槲皮素含量DPPH∙清除率ABTS+·清除率O2-∙清除率DPPH∙清除率0.908**0.977**0.965**0.945**0.930**ABTS+·清除率0.998**0.999**0.998**0.999**0.998**0.913**O2-∙清除率0.982**0.997*0.912**0.943**0.979**0.721**0.898**总还原力0.985**0.999**0.998**0.995**0.995**0.948**0.989**0.876**
由表7 可知，5 种组分与DPPH∙、ABTS+∙、和O2-∙清除率和总还原力都表现出较高的正相关性，其中金丝桃苷含量高，且与抗氧化活性的相关性较强，故金丝桃苷可能是菜芙蓉花黄酮发挥抗氧化作用的主要单体。
3 讨论与结论
当机体中的活性氧自由基与抗氧化保护机制之间的关系发生变化时，便会产生氧化应激与损伤，进而导致癌症、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病的产生[27]。黄酮是一类广泛存在于植物中的具有C3-C6-C3 结构的二苯基发色酮化合物。黄酮类化合物具有极强的抗氧化能力，黄酮与其抗氧化活性的构效关系可能与C 环中的C2-C3 双键和4-羰基、羟基、O-甲基化和/或糖基化有关[28]。菜芙蓉花含有丰富的黄酮类化合物，是黄酮类化合物提取的优选原料[29]。采用不同工艺提取的黄酮提取率、单体组成和生物活性也会存在差异[30]。
本研究采用超声协同乙醇-硫酸铵双水相提取菜芙蓉花黄酮，运用单因素试验和响应面试验优化提取工艺，得出最佳提取条件为硫酸铵质量分数20%、乙醇质量分数31%、菜芙蓉花粉末质量0.5 g、超声功率210 W、超声温度50 ℃、超声时间40 min。在此条件下，菜芙蓉花黄酮提取率达98.31%，黄酮含量达（43.94±1.48）mg/g。在此条件下，清除DPPH 自由基和ABTS+自由基的EC50 值分别为（6.37±0.44）μg/mL 和（17.71±1.41）μg/mL。采用此工艺获得的黄酮提取物中含有芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素和槲皮素，其中含量最高的金丝桃苷对DPPH 自由基、ABTS+自由基和超氧阴离子自由基清除率和总还原力表现出较高的相关性。UPLC-Orbitrap-MS 分析结果表明，传统的醇提法鉴定出59 个黄酮类化合物，而超声协同双水相法共鉴定出63 个，增加的4 个化合物分别为川陈皮素、橘皮素、（2S）-甘草素、3-叔丁基-5-甲基邻苯二酚。这些差异化合物可能是赋予超声协同双水相黄酮提取物高抗氧化活性的原因。
超声协同双水相法具有提取率高、成本低廉、操作简便等优势，是一种极具应用潜力的高效提取活性物质的方法，为菜芙蓉花黄酮大规模工业化提取提供参考。本研究目前仅通过自由基清除率来评估超声协同双水相菜芙蓉花黄酮提取物的抗氧化能力，后续将通过分子对接模拟预测黄酮单体与相关蛋白质结合的方式，并进行细胞保护作用试验，以研究黄酮提取物对细胞内氧化应激程度的影响。这将有助于更全面地阐明菜芙蓉花黄酮的抗氧化机制，进一步推动其作为天然抗氧化剂在功能性食品或药品开发等方面的应用。
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