猪血浆蛋白（porcine plasma protein，PPP）作为血浆的主要成分，是一种廉价且丰富的动物蛋白资源，由于其高营养价值、保水性、乳化能力和凝胶形成特性而广泛用于食品领域[1]，尤其是用作肉制品中可增强其凝胶性[2]。然而，PPP 的研究和应用还是以热凝胶为主[3]，与热凝胶相比，蛋白质冷凝胶的制备在常温下进行，条件相对温和且所需蛋白浓度较低，弥补了传统热凝胶不能荷载热敏性生物活性物质或益生菌等的不足，并降低了成本[4]。但是蛋白质冷凝胶存在硬度低、持水力差的缺陷，因此利用多糖和蛋白质形成复合凝胶由于具有良好的机械强度和生物相容性受到广泛关注[5-6]。
卡拉胶（carrageenan，CG）是分离自海藻的一种天然亲水性多糖，通过双螺旋交联形成热可逆凝胶，具有良好的凝胶特性和流变特性[7]；魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是一种天然大分子杂多糖，具有增稠能力及良好的持水性和凝胶特性，是一种优良的膳食纤维[8]。 研究发现CG 和KGM 单独和复配使用都可以提高凝胶网络的稳定性和强度[9-13]。但是CG 与KGM 复配的研究主要在改善蛋白质热凝胶功能特性方面，关于改善蛋白冷凝胶功能特性及其对猪血浆蛋白冷凝胶特性的影响规律的研究鲜见。
本研究以PPP、CG 和KGM 作为原料，用葡萄糖酸内酯（glucono-δ-lactone，GDL）作为酸诱导剂制备PPPCG-KGM 复合凝胶，研究CG 和KGM 含量对PPP-CGKGM 凝胶性能的影响，并将PPP-CG-KGM 凝胶作为姜黄素（curcumin，Cur）的递送载体，检测Cur 在模拟胃肠道的释放情况，探讨凝胶化过程中的相互作用和可能机理，以期为猪血浆蛋白在食品工业中的应用提供新的思路和应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪血浆蛋白：襄阳维恩生物科技有限公司；κ-卡拉胶（食品级）：滕州市香凝生物工程有限责任公司；魔芋葡甘聚糖（食品级）：湖北强森魔芋科技有限公司；葡萄糖酸内酯（食品级）：安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
ME204 型分析天平、FE28 型pH 计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；UPT-Ⅱ-5T 型纯水机：四川优普超纯科技有限公司；DH.WMS03060 多点磁力搅拌器：大韩科学有限公司；TGL-18M 台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；TA-XT plus 质构分析仪：英国Stable Micro System 公司；T6-1650F 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Zetasizer Nano ZS 纳米粒度电位仪：英国Malven 仪器有限公司；MCR92 流变仪：奥地利安东帕仪器有限公司；JSM-6039LV 场发射扫描电子显微镜：日本日立公司；FA25-D 高剪切分散乳化机：上海弗鲁克流体机械制造公司。
1.3 方法
1.3.1 PPP-CG-KGM 复合溶液的制备
取10 g 的PPP，在室温下溶于100 g 水中并搅拌30 min 配制成质量浓度为10%的PPP 溶液，用1 mol/L HCl 调整PPP 溶液pH 值为8.0。取2 g CG 和KGM 分别溶于10 g 水中配制成2%的CG 和KGM 溶液，调节溶液pH 值为8.0。然后按一定比例混合3 种溶液和超纯水配制成复合溶液，其中PPP 质量浓度为6%，CG和KGM 浓度为0%、0.1%、0.2%、0.3%。
1.3.2 PPP-CG-KGM 复合凝胶的制备
取1.3.1 制备的复合溶液，将复合溶液于85 ℃水浴加热30 min 后，于冰水浴中迅速冷却至室温，再加入0.5%的GDL 在25 ℃放置4 h 制备冷凝胶，挑选出能形成凝胶的样品进行后续试验。
1.3.3 凝胶质构测定
采用配备P/0.5R 圆柱形探头的质构分析仪测定冷凝胶的机械性能，使用空白玻璃皿和1 000 g 砝码进行高度校正和质量校正。通过两次压缩方式确定凝胶的硬度和弹性，压缩度为30%，使用触发力为5 g、测试前速度为1.0 mm/s、测试速度为0.5 mm/s 和测试后速度为1.0 mm/s 的自动触发类型。
1.3.4 流变特性测定
流变学测定参考Chen 等[14]的方法并作适当修改。使用流变仪在平行板（直径50 mm）测量流变，温度由底盘的Peliter 系统控制。通过带有直径为35 mm、间隙1 mm 平板的流变仪记录冷固化胶凝过程中的动态模量，设置应力为0.5 Pa，频率为1 Hz，持续监测4 h。每3 s 读取一次。
1.3.5 凝胶持水性测定
参考文献[15]中的方法并稍加修改。称取定量的凝胶10 000 r/min 离心15 min，持水力（water holding capacity，WHC）即为离心前后的凝胶的质量比。
1.3.6 作用力分析
参考Yan 等[16]的方法测量凝胶的作用力并稍作修改，将0.05 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素+0.5 mol/L 2-β-巯基乙醇溶液（各10 mL）分别加入至2 g 凝胶中并用高剪切分散乳化机剪切1 min。将上述混合物在4 ℃下搅拌1 h，然后将混合物以8 000 r/min 离心10 min 取上清液。使用Bradford 方法测定每种溶液上清液的蛋白质浓度。
1.3.7 PPP 聚集体的表征
为揭示PPP-CG-KGM 的聚集体特性与凝胶性质之间的相关性，测定pH5.5 时能成胶样品的PPP-CGKGM 聚集体的特征。取1.3.1 制备的复合溶液，稀释至其中的PPP 浓度为0.2%，用1.0 mol/L HCl 将pH 值分别调节至5.5，对其平均粒径及Zeta-电位进行测定。
1.3.7.1 平均粒径
通过纳米粒度电位仪测量平均粒径。折射率为1.45，吸收率为0.001，粒径以表面加权平均直径得出。
1.3.7.2 Zeta-电位
通过纳米粒度电位仪测定Zeta-电位。样品保持在25 ℃。
1.3.8 体外释放实验
体外释放实验参考Alavi 等[17]的方法并稍作修改。将每种凝胶预溶液各2 g 分配到7 个玻璃瓶中，添加50 mg/mL 的Cur 储备液使体系中的Cur 终浓度为0.2 mg/mL，混匀后静置1 h 使充分作用，再按照1.3.2制备荷载Cur 的PPP 冷凝胶。7 个玻璃瓶分别对应消化时间30、60、90、150、210、270、330 min。将0.2%猪胃蛋白酶加入pH1.3 的0.2%NaCl 水溶液中制备模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）。将10 mL SGF 加入玻璃瓶中，并在37 ℃下以100 r/min 的速度振荡，开始模拟胃消化1 h。在胃消化结束后，将10 mL 模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）（含有6.8 g/L KH2PO4 和1%胰酶，pH7.4）添加到SGF 中并调节pH 值至7.4 后继续释放。按照试管标记时间收集对应的释放介质，在425 nm 处根据姜黄素的标准曲线分析姜黄素的释放率。
1.4 数据处理
所有试验至少重复3 次，采用SPSS 23.0 对结果进行统计学分析，使用Origin Pro 2022 制图，应用Duncan 检验分析样品之间差异的显著性。
2 结果与分析
2.1 凝胶外观
凝胶外观见图1。
图1 凝胶外观
Fig.1 Appearance of gels
由图1 可知，PPP 本身可形成冷凝胶，但不是所有加入CG/KGM 的样品均能形成凝胶，包括多糖的总浓度为0.2% 的所有样品，以及总浓度为0.3%、0.4% 的部分样品。但是多糖总浓度大于0.5%的样品都能形成良好凝胶，从外观能看出表面都比较光滑并且表面析出的水分较少。
添加浓度高于0.1% 的单一多糖不能成胶的原因可能是单一多糖不能和PPP 起到良好的协同作用，并且随着浓度增高多糖形成的空间位阻反而会抑制PPP本身凝胶的形成。而部分CG 和KGM 复配凝胶不能成胶的原因，可能是多糖添加的比例和浓度对复配凝胶的形成以及特性存在极大的影响[18]。
2.2 KGM、CG 对PPP 凝胶质构特性的影响
PPP 复合冷凝胶的硬度和弹性如图2 所示。
图2 凝胶的质构特性
Fig.2 Texture properties of gels
由图2 可知，在单一多糖复配的情况下，添加低浓度的CG，凝胶的硬度和弹性有小幅度的增强，而低浓度的KGM 对凝胶的硬度和弹性有减弱的效果。在两种多糖复配的条件下，在单一多糖浓度固定时，凝胶的硬度和弹性随另一种多糖浓度的增加而增强。在CG和KGM 浓度均为0.3% 时，凝胶的硬度和弹性最好，是PPP 凝胶硬度的21.9 倍。在多糖总浓度为0.3%时，只有CG 与KGM 质量比为2∶1 时能形成凝胶。在多糖总浓度为0.4%时，CG∶KGM 为3∶1 的硬度最高；多糖总浓度为0.5% 时，CG∶KGM 为1.5∶1 的硬度最高，表明CG 和KGM 的最佳比例为1∶1~1.5∶1，和文献[19]结论一致。
2.3 KGM、CG 对PPP 凝胶流变特性的影响
流变性能对冷凝胶的物化稳定性、加工特性和应用具有重要的影响[20-21]，因此对PPP 凝胶及其复合凝胶的流变性能进行研究，结果见图3。
图3 凝胶化过程中储能模量和损耗模量的时间依耐性
Fig.3 Time dependence of storage modulus and loss modulus during gelatinization
如图3 所示，能形成凝胶的样品储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），而不能形成凝胶的样品G′小于G″，和2.1 的结果一致。复配凝胶的G′和G″随着CG/KGM浓度的提高而提高，和质构的结果一致。CG 和KGM浓度均为0.3% 时，凝胶的储能模量高达6 800 Pa，是PPP 凝胶的50 倍以上，表明得到了强度更高的凝胶。
2.4 KGM、CG 对PPP 凝胶持水力的影响
持水力（WHC）是影响凝胶状食物感官品质的关键特征，高WHC 的凝胶有利于维持特定的食物质地[22]。不同浓度的KGM 和CG 对PPP 凝胶的持水力的影响如图4 所示。
图4 凝胶的持水力
Fig.4 Water holding capacity of gels
由图4 可知，PPP 冷凝胶的持水力较低，只有43.4%。而只添加单一多糖的凝胶持水力相较于PPP冷凝胶有所降低。PPP-CG-KGM 复合凝胶的持水力与PPP 凝胶相比有不同程度的提升，大多样品持水力都在60%以上，在CG、KGM 的浓度均为0.3%时持水力最高，为91.6%，是PPP 冷凝胶持水力的2.11 倍。
2.5 KGM、CG 对PPP 凝胶微观结构的影响
KGM/CG/PPP 复合冷凝胶的微观结构如图5 所示。
图5 凝胶的微观形貌
Fig.5 Microscopic images of gels
由图5 可知，样品均形成了网络结构。纯PPP 凝胶的网络结构十分松散，孔隙较大。而经过CG 和KGM 复配的凝胶网络结构随着浓度的提高变得致密和均一。蛋白质凝胶中孔的特性会影响凝胶的硬度、弹性、WHC[23]。有较大孔隙的凝胶对水的结合性较小，凝胶持水性较低，并且硬度较差。从图5 可以看出，加入CG 和KGM 后成胶的样品相较于只添加单一多糖和空白样品有更小并且数量更多的孔隙，且分布更均一，与持水力和质构的结果一致。
2.6 KGM、CG 对PPP 热聚集体影响
图6 为不同浓度CG/KGM 对蛋白质聚集体Zeta电位的影响。
图6 热聚集体的电位图
Fig.6 Zeta potential of thermal aggregate
由图6 可知，纯PPP 凝胶的Zeta 电位接近于0，只带有少量正电荷。因为体系的pH 值调至5.5 接近猪血浆蛋白的等电点几乎不带电荷。与纯PPP 凝胶相比，CG 的加入使蛋白质聚集体的Zeta 电位变为负数，且随着CG 浓度的增加，Zeta 电位的绝对值逐渐增加，KGM 的添加对Zeta 电位几乎没有影响，CG 是一种阴离子多糖，使体系带有更多的负电荷。图7 为不同浓度CG/KGM 对蛋白质聚集体粒径的影响。
图7 热聚集体的平均粒径
Fig.7 Average size of thermal aggregate
由图7 可知，纯PPP 凝胶有最大的粒径，与纯PPP凝胶相比，低浓度的CG 和KGM 加入使粒径有所降低，而同时加入KGM 和CG 的样品，样品的粒径随着KGM 和CG 浓度的增高而减小。
蛋白热聚集体的粒径小，说明蛋白质分子的变性程度较低，保留了一定的二级和三级结构[24]，蛋白质分子的表面疏水区域和带电区域会减少，从而降低了蛋白质分子之间的疏水相互作用和静电相互作用。这些相互作用通常是导致蛋白质聚集的主要原因。因此，蛋白热聚集体的粒径小，可能意味着蛋白质分子之间的聚集倾向较低，从而有利于形成更均匀和稳定的凝胶网络。
CG 和KGM 复配与蛋白质形成复合水凝胶，通过物理交联增加网络的稳定性和强度，同时可以与水分子形成水合作用，从而减少水分子在蛋白质之间的水合作用。多糖的存在增加蛋白质之间的距离和缓冲作用以及降低了蛋白质的自由度，因此蛋白质之间的相互作用力会减少。KGM 溶液具有高黏度，而CG 在蛋白质变性和体系酸化的过程中和蛋白质存在静电相互作用，抑制了蛋白质的聚集变性，导致粒径降低。
2.7 相互作用力分析
凝胶的化学作用力见图8。
图8 凝胶的化学作用力
Fig.8 Chemical forces of gels
从图8 可以看出，凝胶中的作用力主要是疏水相互作用和二硫键，几乎不含有氢键和静电相互作用。这是因为在蛋白质通过加热变性形成可溶性聚集体的过程中，实现了球状蛋白的疏水性区域展开和暴露以及巯基-二硫键的转化[25]。然后，GDL 的水解使体系的pH 值逐渐降低，可溶性聚集体之间的平衡被打破，聚集体之间的排斥力在等电点附近最小，并通过疏水相互作用进一步交联形成凝胶[26]。
纯PPP 凝胶有最高的疏水相互作用力和二硫键，而加入0.1%的KGM 或CG 时，疏水相互作用力降低。随着CG 或者KGM 加入量的增多，疏水作用力和二硫键随之降低。由于KGM 溶液具有高黏度，以及CG 带有负电荷和蛋白存在静电相互作用，因而抑制了蛋白的聚集，与粒径的结果一致。
当魔芋胶与卡拉胶复配时，这两种多糖可以形成以卡拉胶网络结构为主体、魔芋胶穿插其中的三维网络体系和PPP 凝胶形成双网络结构，因此对PPP 凝胶的凝胶特性具有协同增效的作用。多糖还能基于其排阻作用增加PPP 的局部浓度，进而增加PPP 的有效凝胶浓度，从而增强PPP 的凝胶特性。
2.8 姜黄素体外释放性能
不同凝胶在模拟胃肠道消化6 h Cur 的累积释放曲线如图9 所示。
图9 Cur 的释放曲线
Fig.9 Release curve of curcumin
由图9 可知，纯PPP 凝胶和复配单一多糖凝胶的释放速度更快。初始胃消化1 h 后，PPP、PPP-CG、PPPKGM 凝胶的释放率分别为62.3%、60.8%和62.9%，并且几乎达到了Cur 的释放峰值，在肠液中释放量极少。而经过两种多糖复配的凝胶有利于延缓Cur 的释放，释放率最低只有3%，为Cur 进一步在SIF 中的释放提供了机会。在SIF 中，PPP-CG-KGM 的姜黄素实现了缓慢释放，最终在SIF 的累积释放率在50.2%~65.2%。这一结果表明，PPP 和单一多糖复配的凝胶的释放是爆发性的，而且在胃液中几乎已经完成所有Cur 的释放，不能将姜黄素释放至肠道。而PPP-CG-KGM 凝胶的释放大部分都是缓慢非爆发性的，在胃液和肠液中都实现缓慢释放。因此，PPP-CG-KGM 凝胶可以更适合作为姜黄素的胃肠道递送载体。
3 讨论与结论
本研究用PPP、CG 和KGM 制备蛋白-多糖复合凝胶，PPP-CG-KGM 复合溶液在GDL 酸化调控pH 值为5.5 时可以形成稳定的PPP-CG-KGM 复合凝胶。PPP之间的疏水相互作用是PPP-CG-KGM 复合凝胶形成的主要驱动力。扫描电子显微镜显示PPP-CG-KGM凝胶形成三维网孔结构并随CG、KGM 浓度的增加而变得更致密。流变和质构测试显示PPP-CG-KGM 凝胶的弹性和强度随CG 和KGM 的含量增加而增强。0.3%CG-0.3%KGM-PPP 复合凝胶的凝胶强度显著高于PPP 凝胶。采用体外胃肠道释放实验研究Cur 的释放行为发现，PPP-CG-KGM 凝胶比PPP 凝胶、PPPCG 凝胶、PPP-KGM 凝胶更适合作为Cur 肠道递送的载体，在肠道的Cur 释放量更多。本研究结果可为PPP-CG-KGM 复合凝胶的制备以及合理设计冷凝胶作为营养物质递送载体提供新的思路。
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