多糖（polysaccharide，PS）又称多聚糖，是一种由醛糖和（或）酮糖通过脱水形成糖苷键，并由糖苷键线性或者分枝连接组成的链状聚合物，至少由10 个或者10 个以上单糖组成。多糖作为一类天然存在的高分子化合物，因其独特的生物活性，在医学和食品工业中应用广泛，多项研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血压、护肝和促进刺激免疫力等多种生物活性[1-5]，尤其在抗肿瘤领域的潜力引人注目[6-7]。近年来，随着抗肿瘤研究的深入，多糖的免疫调节功能、细胞凋亡诱导能力及对肿瘤微环境的影响等特性被逐渐揭示，多糖对肿瘤细胞具有较高选择性，并且对正常细胞表现较低毒性[8]。这些研究为肿瘤的辅助治疗提供了全新视角。然而，目前关于扛板归多糖抗肿瘤活性的研究较少。
扛板归（Polygonum perfoliatum L.）又名蛇不过、犁头刺，系蓼科蓼属植物，其性平，味酸、苦，具有清热解毒、利水消肿及镇咳等功效，多用于治疗水肿、痢疾及百日咳等疾病。此外，扛板归还具有食用价值[9-10]，其嫩叶和果实可以食用，属于药食同源的植物。研究表明，扛板归提取物具有多种生物活性[11-15]，其多糖具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性[16-19]，有可能是中药扛板归潜在活性物质。为进一步发现扛板归对肿瘤的相关作用，本文探究扛板归多糖对肝癌HepG2 细胞增殖的抑制作用，以期为扛板归多糖的开发和利用奠定试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
扛板归多糖：广西科技大学医学部医学科研实验中心刘雪萍博士研究室自制，多糖含量为82.44%[16]。
肝癌HepG2 细胞株：湖南丰晖生物科技有限公司；电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channe l，VDAC1）抗体、Mitofusin2 多克隆抗体、Caspase-3 多克隆抗体、Bcl-2 多克隆抗体、Bax 多克隆抗体：美国CST 公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）、Tubulin 抗体、胎牛血清、一抗稀释液、二抗稀释液、青霉素-链霉素溶液、极超敏增强型化学发光试剂盒、二辛可宁酸蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）快速配制试剂盒、放射免疫沉淀试验（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗：上海碧云天生物科技股份有限公司；高糖培养基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）：美国Gibco 公司；β-tublin 单克隆抗体：北京中杉金桥生物科技有限公司；5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）增殖检测试剂盒：锐博生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇（分析纯）：四川西陇科学有限公司；氨丁三醇（生化试剂）：广州赛国生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠、甘氨酸（均为生化试剂）：生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 仪器与设备
CO2 细胞培养箱（3100）、全波长扫描酶标仪（Multiskan GO）：赛默飞世尔科技有限公司；倒置荧光显微镜（Ts2R-FL）：日本尼康株式会社；稳压稳流电泳仪（Power/Pac300）、转膜仪（Trans-Blot SD）：美国Bio-Rad公司；凝胶电泳成像分析系统（Image Quant 800）：美国Cytiva 公司。
1.3 方法
1.3.1 体外抑制肿瘤细胞增殖试验
采用CCK-8 说明书方法测定扛板归多糖对HepG2肿瘤细胞增殖的影响。精密称定10 mg 扛板归多糖，精密量取0.8 mL 超纯水溶解，0.22 μm 针孔式微孔滤膜过滤除菌，得12.5 mg/mL 多糖母液。同法制备无菌超纯水。精密量取0.2 mL 多糖母液，精密量取0.3 mL无菌超纯水加入、混匀，得5 000 μg/mL 多糖样品溶液；在该样品质量浓度基础上，通过倍比稀释法分别制备2 500.0、1 250.0、625.0、312.5 μg/mL 梯度多糖样品溶液，备用。
以DMEM（含1% 青霉素和链霉素、10% 胎牛血清）作为完全培养基，将复苏后的HepG2 细胞置于环境温度37 ℃、5%CO2、相对湿度95%条件下的细胞培养箱中培养，细胞融合度达到70%左右进行传代。取对数生长期细胞，将细胞悬液稀释为1×103 个/孔接种于96 孔板中（每孔100 μL），培养过夜。待细胞贴壁后，更换培养基，试验组加90 μL 培养基和依次分别加10 μL 梯度质量浓度的多糖溶液，使该阶段生长培养基中扛板归多糖质量浓度依次为31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/mL，每个浓度设3 个复孔；正常组加100 μL 培养基；5-氟尿嘧啶作为阳性对照组。培养24 h后，更换培养基，每孔加入CCK-8 试剂10 μL 和培养基90 μL，继续培养1 h，借助酶标仪在450 nm 波长条件下扫描测定各组吸光度，按下列公式计算扛板归多糖对HepG2 细胞增殖抑制率。
式中：D 为细胞增殖抑制率，%；A1 为试验组吸光度；A0 为正常组吸光度。
1.3.2 EdU 增殖试验
取对数生长期细胞，按4×103 个/孔接种于96 孔板中，培养过夜。对照组更换新的DMEM 完全培养基，其他各组分别加入终质量浓度为31.25、62.50、125.00 μg/mL的扛板归多糖培养基混合液，每组设3 个复孔。配制50 μmol/L EdU 培养基溶液。培养24 h 后，弃原培养基，各孔分别加入EdU 培养基溶液100 μL 后孵育2 h。用PBS 清洗2 次。各孔加入4% 多聚甲醛溶液50 μL，孵育0.5 h，弃固定液；各孔加入2 mg/mL 甘氨酸溶液50 μL，孵育5 min，弃甘氨酸溶液；各孔加入PBS 100 μL，清洗5 min，弃PBS；每孔加入100 μL 0.3% TritonX-100 溶液，孵育10 min；PBS 清洗1 次。每孔加入100 μL 的1×Apollo 染色反应液，孵育0.5 h，弃染色反应液；加入100 μL 0.3%TritonX-100 溶液，清洗2~3 次，弃渗透液。各孔加入1×Hoechst 33342 反应液100 μL，孵育0.5 h，弃反应液；各孔用PBS 清洗3 次；最后各孔加入PBS 100 μL 保存待拍照。用倒置荧光显微镜分别在激发波长为550 nm、发射波长为565 nm和激发波长为350 nm、发射波长为461 nm 下获取Apollo 和Hoechst 33342 图像，通过分析Apollo 荧光信号强弱判断各组细胞增殖情况。
1.3.3 细胞Hoechst 染色试验
取对数生长期细胞，按4×103 个/孔接种于96 孔板中，培养过夜。对照更换为新的DMEM 完全培养基，其他各组分别加入终质量浓度为31.25、62.50、125.00 μg/mL的扛板归多糖培养基混合液，每组设3 个复孔。各组细胞继续培养24 h 后，弃去原培养基，每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342 染色液，避光室温下孵育30 min。弃去染色液，用PBS 洗涤3 次，倒置荧光显微镜下激发波长为350 nm、发射波长为461 nm 获取图像。细胞核呈现碎片状或者致密浓染为凋亡细胞。
1.3.4 线粒体膜电位检测试验
取对数生长期细胞，按1×104 个/孔接种于24 孔板中，培养过夜。对照组更换为新的DMEM 完全培养基，其他各组分别加入终质量浓度为31.25、62.50、125.00 μg/mL 的扛板归多糖培养基混合液，继续培养24 h。将50 μg Mito-Tracker Red CMXRos 粉末加入470 μL 二甲基亚砜中，制成浓度为200 μmol/L 备液，临用前用培养基将储备液稀释至终浓度为50 nmol/L工作液。经过药物处理的各组细胞，弃去培养基，每孔加入经37 ℃预孵育的0.5 mL 50 nmol/L Mito-Tracker Red CMXRos 工作液，避光37 ℃孵育20 min。弃去Mito-Tracker Red CMXRos 工作液，加入37 ℃预孵育的新鲜培养基。倒置荧光显微镜激发波长为550 nm、发射波长为565 nm 下获取细胞图像，通过荧光强度分析获得线粒体膜电位变化情况。
1.3.5 蛋白质免疫印迹试验
参考文献[20]的方法，取对数生长期的细胞，按1×104 个/皿接种于培养皿（60 mm×15 mm）中，设置正常对照组、扛板归多糖（31.25、62.50、125.00 μg/mL）组。待细胞贴壁后，将扛板归多糖组培养基分别换成含有质量浓度为31.25、62.50、125.00 μg/mL 多糖样品的生长培养基，继续培养24 h。分别收集各组细胞，分别加入一定量RIPA 细胞裂解液（含1%磷酸酶抑制剂混合物、1%蛋白酶抑制剂混合物），提取各组细胞总蛋白。测定并计算蛋白浓度后，按比例各管蛋白样品分别加入5×蛋白上样缓冲液，于100 ℃条件下煮沸5 min 使蛋白变性，即得蛋白样品。取蛋白样品进行十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转膜、封闭；洗膜后，分别加入VDAC1 抗体、Mitofusin2 多克隆抗体、Bcl-2 多克隆抗体、Bax 多克隆抗体、Caspase-3 多克隆抗体、Tubulin抗体（一抗稀释液稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释度均为1∶5 000），室温孵育1 h；洗膜后，以增强型化学发光试剂显色并使用凝胶成像系统成像。采用GraphPad Prism 5.0 软件分析计算目的蛋白（VDAC1、Mitofusin2、Bcl-2、Bax、Caspase-3）与总蛋白内参Tubulin 的灰度值比值，用以表示目的蛋白的相对表达量。
1.4 数据处理和统计分析
所有数据均以平均值±标准差表示，采用Graph-Pad Prism 5.0 软件进行统计学分析。多个样本间比较采用单因素方差分析进行统计分析，方差齐时用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法，方差不齐时用近似F 检验的Welch 法。不配对组间比较采用t 检验。 P＜0.05 则认为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5.0 软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 多糖对HepG2 细胞毒性作用
能够有效抑制肿瘤细胞生长是抗肿瘤药物的重要特征，采用CCK-8 法测定扛板归多糖对HepG2 细胞的毒性，试验结果见图1。
图1 多糖对HepG2 细胞的抑制作用
Fig.1 Inhibitory effect of polysaccharides on HepG2 cells
不同字母表示组内差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，不同质量浓度的扛板归多糖与HepG2 细胞共培养24 h 后，细胞生长受到了不同程度的抑制，随着给药质量浓度增加，其抑制作用增强，存在一定浓度依赖性。多糖质量浓度为31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/mL 时，细胞增殖抑制率分别为31.42%、44.83%、50.75%、72.93% 和83.27%。经计算扛板归多糖和5-氟尿嘧啶半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分别为130.81 μg/mL和17.67 μg/mL。根据细胞毒性试验结果，选取0、31.25、62.50、125.00 μg/mL 这4 个给药质量浓度开展后续试验。
2.2 多糖对HepG2 细胞增殖影响
增殖能力强是肿瘤细胞的重要特征，生长被抑制后，可表现出较低下的增殖能力。采用EdU 细胞增殖检测方法进一步验证在扛板归多糖作用下HepG2 细胞的增殖情况，结果如图2 所示。
图2 多糖对HepG2 细胞增殖的影响
Fig.2 Effect of polysaccharides on the proliferation of HepG2 cells
与对照组相比，**表示差异极显著（P＜0.01），***表示差异非常显著（P＜0.001）。
由图2 可知，对照组细胞呈强荧光，相比之下，与不同浓度扛板归多糖共孵育24 h 后，各组细胞荧光强度明显减弱，经过荧光强度分析，扛板归多糖各组荧光强度均显著弱于对照组（P＜0.01 或P＜0.001），表明在扛板归多糖作用下细胞增殖受到显著影响，试验结果与细胞毒性结果相一致。
2.3 Hoechst 荧光染色结果
促进细胞凋亡是多种抗肿瘤药物抑制肿瘤的经典途径。扛板归多糖能够有效抑制HepG2 细胞增殖，为进一步了解抑制细胞的途径，利用细胞凋亡时细胞核呈现核固缩并在核膜附近聚集、染色质浓缩等特征，试验采用Hoechst 33342 荧光染色的方法观察扛板归多糖对细胞凋亡的影响。扛板归多糖作用于HepG2 细胞24 h 后Hoechst 33342 荧光染色结果如图3 所示。
图3 Hoechst 33342 荧光染色图
Fig.3 Hoechst 33342 fluorescent staining
从图3 中可以看出，对照组细胞核未见明显异常，而扛板归多糖处理组细胞核有较明显固缩，细胞DNA碎片增多，同时出现一些强度较大的蓝色颗粒状荧光，其中125.00 μg/mL 剂量组变化最明显。这些结果表明扛板归多糖可诱导HepG2 细胞出现凋亡现象，这可能是其表现出抑制细胞生长和增殖的原因。细胞凋亡是系列过程的综合结果，多种因素参与其中。后续将进一步对扛板归多糖诱导细胞凋亡的途径进行探索。
2.4 多糖对线粒体膜电位的影响
线粒体是细胞的能量工厂，线粒体膜电位缺失会干扰细胞三磷酸腺苷生成，被认为是细胞通过线粒体途径凋亡的重要标志，因此，线粒体膜电位下降被认为是细胞凋亡过程中较早发生的变化[21]。Mito-Tracker Red CMXRos 是一种具有细胞通透性的罗丹明衍生物，能够穿越细胞膜，通过探针上的基团识别线粒体，从而检测其膜电位，对细胞损伤小。通过Mito-Tracker Red CMXRos 染色考察扛板归多糖对HepG2 细胞线粒体膜电位的影响，试验结果如图4 所示。
图4 多糖对HepG2 细胞线粒体膜电位的影响
Fig.4 Effect of polysaccharides on the mitochondrial membrane potential of HepG2 cells
与对照组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
由图4 可知，对照组细胞红色荧光强度大，相比之下，经过扛板归多糖处理后，各处理组细胞荧光强度均显著下降，表明扛板归多糖使细胞线粒体膜电位下降。扛板归多糖可能通过线粒体途径促进细胞凋亡。
2.5 线粒体相关蛋白检测结果
VDAC1 是线粒体外膜上一种重要的跨膜蛋白，主要功能是调控线粒体通透性和细胞能量代谢，在调节细胞生存、维持细胞内外环境平衡等方面发挥着重要作用，是癌症治疗研究的热门靶点之一。线粒体融合蛋白Mitofusin2 具有促进线粒体融合、参与调控细胞增殖和分化、保护细胞免于凋亡等多种功能。线粒体的分裂和融合是反映线粒体功能正常的指标之一。观察到线粒体膜电位下降后，可继续通过检测与线粒体膜状态密切相关的VDAC1 蛋白和线粒体融合蛋白Mitofusin2 的变化进一步了解线粒体状态，结果如图5所示。
图5 多糖对线粒体相关蛋白的影响
Fig.5 Effects of polysaccharides on the expression of proteins associated with mitochondria
与对照组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01），***表示差异非常显著（P＜0.001）。
由图5 可知，与对照组相比，扛板归多糖各组Mitofusin2 水平显著下降，VDAC1 水平则显著升高，表明线粒体膜功能异常以及线粒体融合异常，线粒体出现一定程度的功能障碍。
2.6 凋亡相关蛋白检测结果
线粒体功能障碍是触发细胞凋亡的重要途径，多种凋亡蛋白与线粒体有密切关系。通过蛋白质免疫印迹的方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 的表达情况，结果如图6 所示。
图6 多糖对凋亡相关蛋白的影响
Fig.6 Effect of polysaccharides on apoptosis-related proteins
与对照组相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
由图6 可知，与对照组相比，扛板归多糖各处理组Bax 和Caspase-3 水平显著升高，而Bcl-2 水平则显著降低，表明扛板归多糖诱导促凋亡蛋白表达，同时降低了抑制凋亡蛋白的表达。线粒体膜电位改变，能够诱导凋亡蛋白释放到细胞质，促进凋亡的发生，Bcl-2 能够通过抑制凋亡蛋白的释放影响凋亡进程，而Bax 则可以增强凋亡蛋白的释放促进凋亡过程。基于扛板归多糖导致线粒体膜电位下降，发现促凋亡蛋白Bax 水平显著升高，而抑制凋亡的蛋白Bcl-2 水平则显著下调，扛板归多糖在细胞凋亡中增强促进凋亡过程，削弱抑制凋亡过程，使细胞凋亡增加。关键凋亡执行蛋白Caspase-3 水平的升高也进一步验证了这一点，进一步说明扛板归多糖对线粒体凋亡途径的影响。
3 结论
扛板归多糖可以显著抑制HepG2 细胞增殖，并呈一定的剂量依赖性，半数抑制浓度为130.81 μg/mL。在扛板归多糖作用下，HepG2 细胞细胞核固缩、细胞核碎片增加，表现出凋亡特征。扛板归多糖导致HepG2 细胞线粒体膜电位显著下降，同时线粒体相关蛋白Mitofusin2 显著降低，而VDAC1 水平显著升高。扛板归多糖升高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表达水平，降低抑制凋亡蛋白Bcl-2 表达水平。扛板归多糖抑制HepG2 细胞增殖机制，可能与影响HepG2 细胞线粒体功能促进细胞凋亡有关。在后期的研究中，将完善扛板归多糖分离纯化，分析单糖的连接方式，进一步探索抑制肿瘤细胞增殖的机制，为扛板归多糖的进一步开发和研究提供参考。
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