肉及肉制品含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，是当今社会人类饮食结构的重要组成部分[1]。羊肉是百姓“菜篮子”的重要品种，2022 年我国羊肉产量为525 万t，已跨入世界生产大国行列。近年来，由于病毒性疾病如禽流感和非洲猪瘟的出现，一些国家已经开始减少活体动物的流通，并由此转向肉类运输[2-3]。然而，羊肉中较高的蛋白质和水分含量会加速微生物繁殖，导致羊肉腐败变质[4-5]。目前低温贮藏在羊肉的流通和销售中发挥着重要的作用，这种贮藏方式可以抑制部分微生物的生长，降低腐败速率，延长货架期[6]。但是嗜冷菌的存在，仍会造成羊肉仓储运输过程中微生物污染。人们尝试通过添加化学防腐剂来延长肉制品的保质期[7]。但大量研究表明，化学防腐剂会危害人体健康，且存在致癌、致畸的风险[8]。因此，开发绿色、安全的天然抑菌剂成为当前肉类保鲜的研究热点[9-10]。
醛类物质在天然防腐剂中扮演着重要角色，应用比较广泛的是柠檬醛和肉桂醛[11]。柠檬醛是存在于柠檬精油中的一种天然化合物，被广泛应用于食品、日用品、保鲜等行业，通过改变细菌细胞膜的完整性和通透性抑制细菌生长[12]。肉桂醛是肉桂提取物的主要成分，是美国食品药品管理局认定的一种安全的添加剂[13]。研究表明，肉桂精油通过增加大肠杆菌细胞膜的通透性达到抗菌的效果[14]。此外，肉桂醛能够引起金黄色葡萄球菌蛋白质主链空间结构以及氢键体系改变，DNA 单、双链结构断裂以及脂酰基链的结构断裂或产生相互交联，同时，改变细胞膜流动性，进而导致菌体难以生长[15]。然而，柠檬醛与肉桂醛对冷鲜羊肉中细菌群落抑菌效果的研究鲜有报道。
高通量测序能够在微生物群落的研究上实现大规模平行测序[16-17]，较传统的食品微生物检测方法结果更全面、更精确，是辅助筛选靶向抑菌剂的有效方法[18-19]。本研究根据羊肉的腐败规律，间隔不同时间采集4 ℃条件下贮藏的羊肉样本，采用高通量测序技术分析冷藏条件下的细菌群落组成演替规律，并结合现阶段研究热点针对性地选择柠檬醛、肉桂醛两种天然抑菌剂，以抑菌效果为评价标准筛选出抑菌效力较为优异的抑菌剂，测定其对腐败菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），明确羊肉腐败菌的靶向抑菌剂，为羊肉保鲜及深加工提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜羊背肌：市售；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、LB 营养肉汤培养基：北京索莱宝科技有限公司；平板计数琼脂培养基：海博生物技术有限公司；脑心浸液肉汤培养基：北京陆桥技术股份有限公司；肉桂醛（纯度98%）、柠檬醛（纯度97%）：上海麦克林生化科技股份有限公司；嗜冷假单胞菌（BMZ015092）、热杀索丝菌（BMZ066756）、不动杆菌（BMZ135422）：宁波明舟生物科技有限公司；溶酪葡萄球菌（24418）、养料嗜冷杆菌（24001）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.2 仪器与设备
SHX150 Ⅲ生化培养箱：上海树立仪器仪表有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；BSA124S-CW 电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；TGL-16A 医用离心机：湖南平凡科技有限公司；BioTEK/SynergyH1M 酶标仪：青岛菲优特检测有限公司；SW-CJ-2FB 型双人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 冷鲜羊肉贮藏条件及腐败时间点的确定
羊肉在冷藏条件下的货架期一般在7 d 左右[20]，本试验所用羊肉样品为当日屠宰且从场地到取样时间控制在3 h 内。取得样品放置于4 ℃培养箱中冷鲜贮藏，并于0、2、5、7、9 d 进行一次取样。
1.3.2 冷鲜羊肉贮藏期间样本高通量测序分析
4 ℃下贮藏羊肉样本，并分别在0、2、5、7、9 d 称取定量样本放置于冻存管中于-80 ℃下冷冻。统一将羊肉样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，委托其基于 Illumina MiSeq 技术测序平台进行高通量测序。将同一样本的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物混合后使用2% 琼脂糖凝胶回收PCR产物，使用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物，随后利用Tris-HCl 缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测；利用氢氧化钠变性，产生单链DNA 片段进行建库，后由上海美吉生物医药科技有限公司的Miseq PE300 平台完成测序。
1.3.3 天然抑菌剂对优势腐败菌抑菌效价的评定
1.3.3.1 菌悬液的制备
取羊肉优势菌株接种到对应培养基中，在37 ℃下摇床过夜，以200 r/min 振荡，并进行对数培养，直至菌悬液的浓度为106～107 CFU/mL，4 ℃保存备用。
1.3.3.2 抑菌性测试
采用牛津杯法进行抑菌性测试。在超净操作台上，将细菌所需要的琼脂培养基倒入平板中，待培养基凝固后，用移液枪注入200 μL 菌液，用涂布棒涂匀。每个平板中放置1 个牛津杯，各自注入200 μL 配制好的对应浓度的抑菌剂，置于适合细菌生长的恒温培养箱培养24 h 后测量抑菌圈的大小。每个样品做3 个平行，同时设置未添加抑菌剂的空白对照组。
1.3.3.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定
利用二倍稀释法测定不同抑菌剂的MIC。采用无菌96 孔培养板，分别于每行的前11 孔加入细菌所需对应培养基100 μL，继而将每一行的第一个孔中打入100 μL 对应抑菌剂，吹打混匀后吸取第一个孔中的100 μL 液体至第2 孔中，并用二倍稀释法稀释至第11孔，将最后一个孔中多余的100 μL 弃掉；每四行的前三行11 孔中加入100 μL 试验菌液，第四行的前11 孔中加入100 μL 培养基作为阳性对照组。1 至4 行的12 列孔中加入200 μL 培养基作为培养基的对照组，5 至8 行的第12 孔中分别加入100 μL 培养基和受试细菌菌液作为阴性对照组。并将96 孔培养板置于37 ℃恒温箱培养24 h，利用酶标仪测定600 nm 处的吸光度。
1.4 数据处理
使用生信云平台获取高通量测序结果，并采用Origin 软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 高通量测序结果分析
2.1.1 冷鲜羊肉贮藏期间微生物群落的α 多样性分析
α 多样性与细菌群落的多样性有关，主要包括Ace 指数、Chao 指数、Shannon 指数、Coverage 指数和Simpson 指数等多种指数，Chao 和Ace 指数对标群落的丰富度，Coverage 指数对标覆盖度，Shannon 和Simpson 指数对标样本均匀程度[21]。本研究对不同贮藏时间的冷鲜羊肉样品进行高通量测序，同时利用最小样本数进行抽平，根据97% 的相似度进行聚类，结果如表1 和图1 所示。
图1 冷鲜羊肉样本的 Sobs 曲线和 Shannon 曲线
Fig.1 Sobs and Shannon curves of chilled mutton samples
表1 冷鲜羊肉贮藏过程中细菌群落的多样性分析
Table 1 Bacterial diversity of chilled mutton during storage
时间/d 0 2 5 7 9 Sobs 指数92.5±9.19 39.67±3.06 20.00±1.00 20.33±1.15 23.00±2.65 Shannon 指数1.58±0.18 1.16±0.06 1.23±0.17 1.05±0.13 1.29±0.09 Simpson 指数0.45±0.04 0.44±0.02 0.34±0.04 0.44±0.12 0.33±0.03 Ace 指数95.00±6.44 46.01±6.14 25.83±0.89 35.40±12.05 25.79±4.39 Chao 指数94.92±6.01 43.20±0.72 27.25±5.95 28.33±5.51 24.17±3.69 Coverage 指数/%99.98 99.99 99.99 99.98 99.99
由表1 可知，Shannon 和Simpson 指数趋势相对平稳，说明样品均匀度相对较好。Ace 指数和Chao 指数在贮藏前期降低趋势较为明显，贮藏中后期发生小范围浮动变化，说明冷鲜羊肉细菌菌群丰富度前期随着贮藏时间的延长菌群不断演替变化，贮藏后期丰富度逐渐降低，此时优势菌属逐渐显著。由图1 可知，多样性曲线随着测序数量的提高逐渐趋于平行，说明测序数量已经达到饱和，这个结果可以反映出冷鲜羊肉的微生物菌群组成，也表明冷鲜羊肉在贮藏过程中微生物群落较为多样。不同贮藏时间样本的测序深度指数Coverage 指数（表1）均大于99%，表明送测样本的测序结果可以反映实际贮藏情况。
2.1.2 冷鲜羊肉贮藏期间群落组成分析
冷鲜羊肉贮藏过程中细菌群落在属水平的分布见图2。
图2 冷鲜羊肉贮藏过程中细菌群落在属水平的分布
Fig.2 Genus-level bacterial community composition of chilled mutton during storage
如图2 所示，在贮藏前期（0～2 d），细菌种类复杂多样。溶酪葡萄球菌（Macrococcus sp.）在贮藏前期占有绝对优势，相对丰度为32.67%～75.30%。在贮藏中后期，气球菌在各样品中的相对丰度大幅下降。5～9 d阶段气球菌的相对丰度为0.15%～1.14%。原因可能是气球菌在冷藏环境中受温度限制而丰度降低。从2 d开始，热杀索丝菌（Brochothrix sp.）在各样品中的相对丰度大幅升高，达到53.56%，后又逐渐降低，在9 d 降至19.12%。这是由于热杀索丝菌属是一种兼性厌氧微生物，冷藏环境中贮藏前期可利用葡萄糖作为基质[22]，后期由于葡萄糖含量逐渐降低，致其逐渐被其他优势菌所取代。嗜冷假单胞菌（Pseudomonas sp.）在5 d 前比例相对较低，但5 d 后占比突然升高，在贮藏末期相对丰度达到41.14%～57.52%，原因可能是其可利用葡萄糖作为生长基质，当葡萄糖含量较低时，转将氨基酸作为新的生长基质，从而使嗜冷假单胞菌的滋生能力优于其他竞争性菌群[23]。嗜冷假单胞杆菌是冷鲜羊肉的优势腐败菌，这与周琰冰等[24]的研究结果一致。在贮藏中后期（5～9 d），不动杆菌（Acinetobacter sp.）开始生长，成为仅次于嗜冷假单胞菌和热杀索丝菌的第三大优势菌属。9 d 时不动杆菌的丰度达到33.41%，成为贮藏后期的优势菌群。
2.2 天然抑菌剂抑菌效价的评定
2.2.1 抑菌性测试
在冷鲜羊肉中，腐败菌严重影响食品质量，危害人体健康[25]。冷鲜肉保鲜中较为安全的保鲜措施是使用天然抑菌剂[26]。柠檬醛和肉桂醛是符合国家标准的天然食品添加剂，并具有广谱抑菌性。柠檬醛和肉桂醛对5 种优势菌的抑菌活性见表2。
表2 两种抑菌物质对5 种优势菌在1%浓度下的抑菌圈直径
Table 2 Inhibition zone diameters of two antimicrobial agents （1%） against five dominant bacteria
抑菌物质空白对照柠檬醛肉桂醛抑菌圈直径/mm热杀索丝菌9.05±0.24 13.51±0.16 18.97±0.09嗜冷假单胞菌12.33±0.22 16.87±0.02 20.31±0.41不动杆菌12.83±0.70 20.19±0.56 41.29±0.72养料嗜冷杆菌10.61±0.33 17.02±0.32 23.21±0.33溶酪葡萄球菌9.88±0.22 16.33±0.50 18.96±0.43
从表2 可以看出，两种抑菌剂对5 种优势菌均有不同程度的抑制效果，这是因为醛类可以渗透进入细菌细胞内部，与细菌DNA 发生相互作用，影响DNA 的正常合成[27]。不动杆菌和养料嗜冷杆菌对两种醛最为敏感，但是肉桂醛对5 种优势菌的抑菌圈大于柠檬醛，说明肉桂醛的抑菌效果更好。这与顾春涛[28]对肉桂醛在冷鲜肉中的抑菌效力研究结果一致，说明肉桂醛在冷鲜肉中具有很好的应用前景。
2.2.2 单一抑菌剂抑菌效力
选用柠檬醛和肉桂醛对冷鲜羊肉分离出的5 种腐败菌进行抑菌能力测定，结果如图3 所示。
图3 不同醛类对羊肉腐败菌的抑菌效力
Fig.3 Inhibitory effects of different aldehydes on spoilage bacteria of chilled mutton
从图3 可以看出，随着肉桂醛浓度的升高，腐败细菌的OD600 值下降趋势明显，表明肉桂醛能有效抑制腐败细菌的生长。当肉桂醛浓度为630 μg/mL，溶酪葡萄球菌、养料嗜冷杆菌、嗜冷假单胞菌、热杀索丝菌的生长被有效抑制，其抑菌效果显著，而不动杆菌在浓度2 500 μg/mL 时才被明显抑制。当柠檬醛浓度达到630 μg/mL 时，仅能抑制溶酪葡萄球菌的生长，当浓度达到1 250 μg/mL 时，仍未能抑制嗜冷假单胞菌的生长，相较肉桂醛抑菌效果较差。当肉桂醛浓度大于1 250 μg/mL 时，肉桂醛对5 种优势菌的抑菌效果与肉桂醛的浓度成反比，说明高浓度肉桂醛的抑菌效果降低。这可能是因为肉桂醛是一种疏水性物质，高浓度肉桂醛的反增塑效果要大于肉桂醛和模拟物间浓度差效果，导致其释放率低于低浓度肉桂醛，抑菌效果随之降低[29]。
2.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定
柠檬醛和肉桂醛两种天然抑菌剂对冷鲜羊肉中分离出的5 株优势腐败菌的MIC 值如表3 所示。
表3 柠檬醛和肉桂醛的MIC
Table 3 MIC of citral and cinnamaldehyde
抑菌剂肉桂醛柠檬醛MIC/（μg/mL）热杀索丝菌630 2 500不动杆菌1 250 2 500养料嗜冷杆菌630 1 250溶酪葡萄球菌310 630嗜冷假单胞菌310 2 500
由表3 可知，柠檬醛对5 种腐败菌株的MIC 范围在310～2 500 μg/mL，与李兆双等[30]的研究结果一致。肉桂醛对5 种腐败菌株的抑制效果由强到弱依次为溶酪葡萄球菌=嗜冷假单胞菌＞养料嗜冷杆菌=热杀索丝菌＞不动杆菌，对冷鲜羊肉优势腐败菌的抑菌效果具有显著效力。柴向华等[31]发现肉桂醛对葡萄球菌的MIC为500 μL/L，与本文MIC 值310 μg/mL 相近。
3 结论
微生物污染是冷鲜羊肉在生产、运输以及销售过程中品质下降和引发安全问题的主要原因。因此探究冷鲜羊肉在冷藏环境下的腐败菌组成其演替规律并筛选出天然抑菌剂是提高冷鲜羊肉质量安全的重要举措。
本文对4 ℃下不同贮藏时间的冷鲜羊肉样本进行高通量测序。从结果可以看出，高通量测序对冷鲜羊肉细菌群落的分析比其他研究方法更全面，信息量更大。通过高通量测序技术能够快速了解冷鲜羊肉在贮存过程中的主要腐败菌为Pseudomonas psychrophila、Brochothrix thermosphacta、Macrococcus caseolyticus、Acinetobacter、Psychrobacter cibarius。通过比较两种天然醛类的抑菌效力得出，肉桂醛对嗜冷假单孢菌的抑菌能力较强，MIC 为310 μg/mL。柠檬醛对溶酪葡萄球菌的抑菌能力较强，MIC 为630 μg/mL。抑菌能力测定和MIC 对比显示，肉桂醛的抑菌效果显著高于柠檬醛，这为后续冷鲜羊肉的防腐保鲜提供了理论依据。
目前柠檬醛和肉桂醛的作用机理和抗菌谱的研究还不够深入，其适用范围、使用量和使用方法还有待进一步明确。同时，醛类应用于食品时对食品风味的影响以及如何最大限度地发挥其功效也有待进一步探索。最后，如何将不同来源的天然食品防腐剂协同使用，达到互补或增益的效果，也值得日后深入探讨。
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