山药为薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposite Thunb.）的干燥根茎，其味甘性平，归脾、肺、肾经，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精等功效，用于脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳、虚热消渴等症状[1]。现代研究发现，山药中含有多糖、蛋白质与氨基酸、薯蓣皂苷、脂肪酸、尿囊素、淀粉、微量元素等多种化学物质[2]，具有预防心血管脂肪沉积、抗氧化、保护肝脏、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂[3]等作用，具有很高的药用价值和食用价值。
山药的种植历史悠久且种植范围广，河南、河北、山东等地均有其种植基地，其中以河南省武陟县、温县、博爱县等所产的怀山药为道地药材[4]，其他地区种植的麻山药、长山药等也可药用。但是由于不同地区的土壤、光照等不同，导致不同产地山药中药理活性成分含量不同，临床治疗效果存在差异。因此，寻找一种能够快速鉴别山药产地的方法显得尤为重要。
红外光谱法具有测定范围宽、所需样品量少、提供信息多、特征性强、准确度高等优点[5]，在中药质量评价与鉴别领域应用广泛[6-8]。目前山药产地判别的研究较多，但是运用红外光谱技术结合二维红外相关光谱技术对山药进行产地快速鉴别的研究鲜有报道[9-10]。
本试验选取6 个地区30 批山药样品，利用傅里叶变换红外光谱技术，采集其在4 000～400 cm-1 波段内的红外光谱，比较不同产地样品平均光谱、二阶导数图谱、二维红外相关光谱（two-dimensional infrared correlation spectroscopy，2D-IR）之间的差异性，并将山药平均光谱与标准品尿囊素的红外光谱进行对比。运用主成分分析法、聚类分析法等方法，分析不同产地山药样品间的差异性，以期为山药的产地鉴别提供一种快速准确的方法。
1 材料与方法
1.1 样品
山药样品共30 批，分别来自河南省温县、河南省武陟县、河北省保定市、河北省沧州市、山东省菏泽市、山西省平遥县，样品详细信息见表1。山药样品经河南中医药大学董诚明教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposite Thunb.）的根茎。
表1 山药产地
Table 1 Producing areas of Dioscorea opposite
样品名称河北保定河北沧州河南温县河南武陟山东菏泽山西平遥样品产地河北省保定市河北省沧州市河南省温县河南省武陟县山东省菏泽市山西省平遥县品类鲜品鲜品鲜品鲜品鲜品鲜品
1.2 仪器与试剂
尿囊素标准品（批号111501-200202）：中国食品药品检定研究院。
INVENIOS 型傅里叶变换红外光谱仪：德国Bruker 公司；FW135 型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；200 目分样筛：浙江上虞市五四仪器筛具厂；GZX-9030MBE 型电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理
去除山药样品杂质及变质部分，用清水洗净，削皮，切成3 mm 左右薄片。将山药片放入电热鼓风干燥箱中，在60 ℃下干燥至恒重。用中草药粉碎机将干燥后的山药片粉碎，过9 号筛，得到山药粉末样品。
1.3.2 光谱采集
分别取各批山药粉末样品，将样品置于玛瑙研钵中，在红外灯下研磨均匀（防止粉末受潮影响光谱数据），取少量研钵中粉末样品于硒化锌晶体材料上进行光谱扫描。扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，样品扫描时间32 s，背景扫描时间32 s。每个样品重复测定3 次。
1.4 数据处理
使用OMNIC 9.0 软件对原始光谱进行自动基线校正、自动平滑、平均光谱、纵坐标归一平均光谱处理，得到不同产地山药样品平均红外光谱图，对其进行Norris 求导。使用OPUS 8.0 软件处理不同产地山药样品平均红外光谱及二阶导数图谱，得到其二维相关红外光谱。使用Origin 2021 软件绘制红外光谱图，并进行主成分分析。使用SPSS 26.0 软件进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同产地样品平均光谱
在有机物分子中，组成化学键或官能团的原子处于不断振动的状态，其振动频率与红外光的振动频率相当。所以，用红外光照射有机物分子时，分子中的化学键或官能团可发生振动吸收，不同的化学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上将处于不同位置，从而可获得分子中含有何种化学键或官能团的信息。红外图谱可以反映中药的整体综合信息，将其复杂多样的成分表达为简单的图谱，使中药真伪鉴定更为便捷。不同产地样品平均红外光谱结果见图1。
图1 不同产地样品平均红外光谱
Fig.1 Average infrared spectra of sample from different producing areas
由图1 可知，不同产地山药样品平均红外光谱整体趋势相同，仅在峰形及峰强上稍有差异。不同产地山药样品在3 273、2 926、1 728、1 632、1 405、1 366、1 242、1 149、1 076、995、927、859、762、571、524 cm-1 附近有吸收峰。其中，3 273 cm-1附近为氮氢单键（N－H）、氧氢单键（O－H）的伸缩振动吸收峰，主要来自于山药中的蛋白质、糖类、尿囊素等化合物的吸收；2 926 cm-1附近为甲基及亚甲基中的碳氢单键（C－H）的伸缩振动吸收峰，主要来自于山药中的蛋白质、糖类、皂苷等化合物的吸收；1 728 cm-1 附近为羰基（C 
O）的伸缩振动吸收峰，主要来自山药中糖类、氨基酸等化合物的吸收；1 632 cm-1 附近为酰胺结构中碳氧双键（C
O）的伸缩振动吸收峰及氮氢单键（N－H）的弯曲振动吸收峰，主要来自山药中蛋白质、尿囊素、核苷等化合物的吸收；1 405 cm-1 附近为甲基和亚甲基的碳氢单键（C－H）反对称弯曲振动及酰胺结构中碳氮单键（CN）伸缩振动吸收峰，主要来自山药中蛋白质、糖类、皂苷等化合物的吸收；1 366 cm-1 附近为甲基的碳氢单键（C－H）的对称弯曲振动吸收峰，主要来自山药中蛋白质、糖类等化合物的吸收；1 242 cm-1 附近为醚键（CO－C）的伸缩振动吸收峰，主要来自山药中糖类、皂苷等化合物的吸收；1 149、1076 cm-1 附近碳氧单键（CO）、碳氮单键（C－N）的伸缩振动吸收峰，主要来自山药中蛋白质、糖类、皂苷、核尿囊素等化合物的吸收；995、927、859、762、571、524 cm-1 处特征吸收峰构成了不同产地山药的指纹图谱。
2.2 不同产地样品平均光谱与标准品对比
尿囊素作为山药的主要活性成分，具有局部麻醉、镇静、促进细胞生长、消炎抑菌、抗刺激物等作用，可用于胃溃疡、十二指肠溃疡，减轻有害物质对胃黏膜的损伤[3]。将标准品尿囊素红外光谱按照1.3.2 方法采集并与不同产地山药样品的平均红外光谱进行对比，可得不同产地山药的尿囊素成分分布，结果见图2。
图2 不同产地样品平均光谱与尿囊素标准品对比
Fig.2 Comparison of spectra of samples from different areas with standard samples of allantoin
由图2 可知，从峰位上看，尿囊素在3 344、1 660、1 401、1 060 cm-1 等处的吸收峰与山药样品在3 273、1 632、1 405、1 076 cm-1 等处的吸收峰相近。3 344、3 273 cm-1 处为氮氢单键（N－H）的伸缩振动吸收峰；1 660、1 632 cm-1 处为酰胺结构中碳氧双键（C
O）的伸缩振动吸收峰；1 401、1 405 cm-1 处为酰胺结构中碳氮单键（C－N）的伸缩振动吸收峰；1 060、1 076 cm-1 处为氨基结构中碳氮单键（C－N）的伸缩振动吸收峰。
2.3 不同产地样品二阶导数图谱
二阶导数曲线可以提高信噪比，减少谱线重叠，增强样品谱图间的差异性有利于进行分析和识别，对不同产地样品的平均红外光谱进行二阶求导，分析其差异性，结果见图3。
图3 各产地样品二阶导数图谱
Fig.3 Second-order derivative spectra of samples from different producing areas
由图3 可知，各产地样品二阶导数图谱主要在1 650～600、850～770、670～620 cm-1 3 个波段。在波段1 650～600 cm-1 内，山东菏泽样品在1 594 cm-1 处有弱吸收峰，其他产地样品的二阶导数曲线在1 589 cm-1 处有弱而宽的吸收峰，此处为碳氮双键（C 
N）、碳碳双键（C 
C）的伸缩振动吸收峰，主要来自山药中核苷、皂苷等化合物的吸收。在1 572 cm-1 处，河南温县、河南武陟、山东菏泽样品有很弱的吸收峰，为碳氮双键（C 
N）、碳碳双键（C
C）的伸缩振动吸收峰，主要来自山药中核苷、皂苷等化合物的吸收，而河北保定、河北沧州样品、山西平遥样品的二阶导数曲线在此无吸收峰。
在波段1 650～600 cm-1 内，河北沧州样品在829 cm-1 处有尖锐波谷，河北保定样品在825 cm-1 处的波谷较平缓，其他产地样品在此处无波谷。在817 cm-1 处，河北沧州样品有强而尖锐的吸收峰，而河北保定、山西平遥样品在此处的吸收峰较弱，此处为碳氢单键（C－H）的面外弯曲振动吸收峰，主要来自山药中蛋白质、糖类等化合物的吸收；河南温县样品在此处有弱而宽的波谷，河南武陟、山东菏泽样品的二阶导数曲线在此处较平缓，无波峰、波谷。山西平遥样品在802 cm-1 处有很弱的波谷，在792 cm-1 处有很弱的吸收峰。河北沧州样品在797 cm-1 处有强而尖锐的波谷，河北保定样品的二阶导数曲线在此处较平缓；而河南温县、河南武陟、山东菏泽样品在797 cm-1 处有弱而宽的吸收峰，此处为氮氢单键（N－H）的伸缩振动吸收峰，主要来自山药中蛋白质、尿囊素等化合物的吸收。河南温县、河南武陟、山东菏泽样品在783 cm-1处有尖锐波谷，而河北保定、山西平遥样品在此处的波谷较宽。
在波段670～620 cm-1 内，仅河北沧州样品在649 cm-1 处有很弱的吸收峰，在644 cm-1 处有较平缓的波谷，其他产地样品在此处较平滑。综上所述，不同产地样品二阶导数图谱在1 630～1 530、840～770、670～620 cm-1 波段内的差异性较大。
综上所述，可利用二维相关红外光谱这些差异来区分不同产地的山药。
2.4 不同产地样品二维红外相关光谱
采用二维等高线图对样品的红外光谱进行描述，可以直接获取和解析样品的二维谱图信息。在2D-IR的二维图中，X、Y 坐标用波数表示，Z 坐标以X-Y 平面中的等高线表示[11-12]。2D-IR 与传统红外光谱法相比，可以观察到在一维红外光谱中观察不到的重叠峰，能够提高光谱的分辨率，提供更丰富的谱图信息，适合鉴别高度相似的样本[13-14]。选取6 个产地样品差异性较大的3 个波段（1 620～1 505、840～750、675～620 cm-1）内的二阶导数光谱，用OPUS 8.0 软件处理得到其2DIR，结果见图4～图6。
图4 不同产地样品的二维相关红外光谱（1 620～1 505 cm-1）
Fig.4 2D-IR of samples from different producing areas （1 620-1 505 cm-1）
图5 不同产地样品二维相关红外光谱（840～750 cm-1）
Fig.5 2D-IR of samples from different producing areas （840-750 cm-1）
图6 不同产地样品二维相关红外光谱（675～620 cm-1）
Fig.6 2D-IR of samples from different producing areas （675-620 cm-1）
由图4 可知，河北保定样品明显的自动峰有4 个，分别在1 515、1 535、1 560、1 614 cm-1，其中1 515 cm-1的自动峰强度最大，1 535 cm-1 的自动峰强度较大；1 560 cm-1 和1 535、1 560 cm-1 和1 614 cm-1 之间的交叉峰为正，其他自动峰之间交叉峰为负。河北沧州样品有4 个明显的自 动 峰，分别在1 515、1 535、1 560、1 590 cm-1，其中1 515、1 560 cm-1 的自动峰强度最大，1 590 cm-1 的强度较大；1 515、1 535、1 590 cm-1 之间的交叉峰为正，其他自动峰间的交叉峰为负。从整体上看，河南温县与河南武陟样品的2D-IR 相似性很高，有4 个自动峰，分别在1 515、1 535、1 560、1 614 cm-1，其中1 515 cm-1 的自动峰强度最大，1 614 cm-1 的自动峰强度较大；1 560 cm-1 和1 535、1 560 cm-1 和1 614 cm-1之间的交叉峰为正，其他自动峰之间交叉峰为负。山东菏泽样品有4 个自动峰，分别在1 515、1 535、1 560、1 614 cm-1，其中1 515 cm-1 的自动峰最强，1 614 cm-1的 自 动 峰 较 强；1 560 cm-1 和1 535、1 560 cm-1 和1 614 cm-1 之间的交叉峰为正，其他自动峰之间交叉峰为负。山西平遥样品有3 个自动峰，分别在1 515、1 560、1 614 cm-1，其中1 515 cm-1 自动峰强度最大；1 560 cm-1 和1 614 cm-1 之间交叉峰的强度为正，其他自动峰之间交叉峰为负。在1 535 cm-1 处，除山西平遥样品外，其他产地样品均有自动峰；在1 560 cm-1处，河北沧州样品自动峰强度大，河北保定样品自动峰强度较大，其他产地样品自动峰强度弱，山东菏泽样品自动峰的峰形与其他产地样品明显不同；在1 590 cm-1处，仅河北沧州样品有强自动峰；且河北沧州样品的自动峰强度高于河北保定样品；在1 590 cm-1 处，仅河北沧州样品有强自动峰；在1 614 cm-1 处，山东菏泽样品有强自动峰，河南温县、河南武陟样品有较强的自动峰，河北保定、山西平遥样品自动峰强度弱，河北沧州样品在此处无自动峰。
由图5 可知，各产地样品在763 cm-1 处均有强自动峰；仅河北沧州样品在797 cm-1 处有较强自动峰。在763、800 cm-1 处各产地样品均有一组交叉峰，从2DIR 中的峰形上看，河北沧州样品的交叉峰表现为椭圆形，其他产地样品的交叉峰均表现为长条形。
由图6 可知，在640 cm-1 处，所有产地样品均有强自动峰，河北保定、河南温县、河南武陟、山东菏泽样品的自动峰峰形相似，河北沧州、山西平遥样品的自动峰峰形相似。在667 cm-1 处，河北沧州、山西平遥样品有明显的强自动峰，河北保定、河南武陟样品有较强自动峰，河南温县在此处有弱自动峰，山东菏泽样品在此处无自动峰。
综上所述，可根据样品2D-IR 中自动峰、交叉峰的数量、强度、峰形来区分样品的产地。
2.5 主成分分析结果
主成分分析（principal component analysis）法被广泛用于光谱数据的定性分析。选取不同产地山药样品二阶导数光谱差异性较大的波段（1 650～600 cm-1），建立不同产地山药样品主成分分析模型，结果见表2。以主成分1 和主成分2 为坐标轴，建立不同产地山药样品主成分分布图，见图7。
图7 主成分分析图
Fig.7 Principal component analysis chart
表2 各主成分累计贡献率
Table 2 Cumulative contribution rate of each principal component
主成分1 2 3特征值376.477 177.558 90.745方差百分比/%51.152 24.125 12.330累计贡献率/%51.152 75.276 87.606
由表2 可知，3 个主成分的累计贡献率达到87.606%，具有很好的代表性。由图7 可知，不同产地山药样品在主成分空间中处于相对独立的状态，河北保定、山西平遥样品分布于第一象限，说明河北保定、山西平遥样品之间的相似性较高；河南温县、河南武陟、山东菏泽样品分布于第三象限，说明河南温县、河南武陟、山东菏泽样品之间的相似性高；河北沧州样品分布于第四象限，说明河北沧州样品与其他产地样品间的差异性较大。
2.6 聚类分析结果
选取不同产地山药样品二阶导数光谱差异性较大的波段（1 650～750 cm-1），利用SPSS 26.0 分析软件，提取736 个变量建立矩形阵列，采用Ward 联接法，以平方欧式距离作为度量标准，获得不同产地山药样品的聚类分析谱系图，见图8。
图8 聚类分析谱系图
Fig.8 Cluster analysis pedigree chart
由图8 可知，聚类分析可对不同产地山药进行分类，当平方欧式距离在2～9 时，6 个产地山药样品可被分为3 类，Ⅰ类为河南温县、河南武陟、山东菏泽样品，说明河南温县、河南武陟、山东菏泽样品之间的相似性高；Ⅱ类为河北保定、山西平遥样品，两者之间的相似性高；Ⅲ类为河北沧州样品，说明河北沧州样品与其他产地样品之间的差异性较大。当平方欧式距离大于9时，Ⅰ类与Ⅱ类合为一类，说明河南温县、河南武陟、山东菏泽样品与河北保定、山西平遥样品间的相似性较高，而沧州样品与其他产地样品之间的差异性较大。
3 讨论与结论
本文通过中红外光谱技术结合二维红外相关光谱技术、主成分分析法、聚类分析法，对6 个产地的山药样品进行差异性分析。不同产地山药样品平均光谱的红外吸收曲线整体趋势相似，吸收峰的峰强及峰形存在差异，这可能是因为不同地区的气候、温度、土壤等不同，导致不同产地山药中的糖类、蛋白质等物质含量不同。对不同产地山药样品的红外光谱进行二阶求导和二维红外处理发现其差异性表现在1 630～1 530、840～770、670～620 cm-1 波段内，不同产地样品的自动峰、交叉峰的数目、峰强、峰形存在差异，此处是山药中核苷、皂苷、尿囊素等化合物的吸收波段，可作为判别山药产地差异的图谱区。
主成分分析和聚类分析结果相似，显示河南温县、河南武陟、山西平遥样品之间的相似性高，河北保定、山西平遥样品之间的相似性较高，河北沧州样品与其他产地样品间的差异性较大。推测可能是由气候、土壤或品种的差异引起的。本试验结果表明中红外光谱技术结合二维红外相关光谱技术可以鉴别不同产地山药，为山药产地的鉴别提供了一种快速、有效的方法，为山药的质量控制提供了新思路。
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