虾副产物(虾头、虾壳等)中富含高价值的生物活性物质,如蛋白质、虾青素、脂质等[1-2]。其中,虾源蛋白肽的氨基酸种类齐全、生物活性多样,在抗氧化、降血压、免疫调节等方面具有一定功效[3-5],可用于开发功能性食品和膳食补充剂。然而,虾活性肽存在吸湿性强、稳定性差和易受外界环境影响(如氧化)而变性失活等缺陷,导致其应用受限。
微胶囊化能有效减少氧化、水解等作用对活性肽的影响,较好保护肽活性成分、提高肽稳定性。目前,利用微胶囊技术包埋活性肽的方法主要有锐孔法、复凝聚法、冷冻干燥法及喷雾干燥法等[6-9]。前3 种方法制备成本较高、应用范围有限,或不适于批量生产,而喷雾干燥法具有生产成本低、连续性好、易于规模化生产等优点[10],是制备活性肽微胶囊的理想方法。天然或合成高分子材料常被用作微胶囊的壁材,特别是天然高分子材料具有生物相容性较好、无毒性、可再生等优势,很适合制备可食性微囊。如阿拉伯胶具有高溶解度、低黏度和良好的乳化性能[11],是良好控释载体;β-环糊精价格低,具有外亲水、内疏水的特性,其抗吸湿性、抗结块性强,包埋效果好[12]。两者的优良理化性质使其成为制备微胶囊壁材的优选原料,有望用于虾活性肽的微胶囊化包埋。
然而,采用单一壁材进行微囊化包埋常暴露出包埋效果不够理想等局限性,难以满足现代食品工业的发展需求[13]。相较于单一壁材,采用复合壁材制备的微胶囊的包埋率及稳定性较高,综合性能显著优于单一壁材微胶囊[14-15]。为进一步提升包埋效果,本研究以虾活性肽为芯材,以阿拉伯胶与β-环糊精为复合壁材,采用喷雾干燥法制备虾活性肽微胶囊(shrimp bioactive peptide microcapsules,SBPM),并通过单因素与正交试验优化微胶囊的制备工艺,同时研究微胶囊的感官、理化性质、稳定性和模拟体外释放性能等关键技术特征,以期为开发低吸湿性、高稳定性的虾活性肽微胶囊提供技术支撑。
南美白对虾副产物(新鲜虾头虾壳):市售;阿拉伯胶、β-环糊精、麦芽糊精、壳聚糖、单甘酯:河南万邦实业有限公司;三氯乙酸、硝酸钾、丙三醇:西陇化工股份有限公司;考马斯克蓝:美国BIO-RAD 公司;牛血清白蛋白:美国Sigma 公司;溴化钾:美国PIKE 公司。所用化学试剂均为分析纯。
Sartorius BSA224S 电子分析天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;RCT digital S025 磁力搅拌器:艾卡仪器设备有限公司;B-290 喷雾干燥仪:瑞士布奇公司;UV-1780 紫外可见分光光度计:岛津仪器(苏州)有限公司;LS-POP(6)激光粒度分析仪:珠海欧美克仪器有限公司;Tensor 27&Tensor 37 傅里叶变换红外光谱仪:德国布鲁克光谱仪器公司;ZEISS Sigma 扫描电子显微镜:德国卡尔蔡司公司。
1.3.1 活性肽的制备
参考文献[4]的方法制备南美白对虾副产物虾活性肽(分子质量分布在75~1 355 Da 的蛋白肽占比达到76.35%)。
1.3.2 SBPM 的制备
分别称取适量的复合壁材(阿拉伯胶、β-环糊精、麦芽糊精、壳聚糖),加入去离子水,55 ℃水浴搅拌助溶,恒温30 min,加入乳化剂(单甘酯)及虾活性肽继续搅拌20 min 后,调节转速至10 000 r/min,高速乳化均质10 min,得乳化液。乳化液经喷雾干燥(空压机出口压力0.6 MPa;进样口温度130 ℃;进料速率2.0 mL/min),制得SBPM。不加入虾活性肽,按照相同方法制备无芯材的空白微胶囊。SBPM 的产率(Y1,%)按下列公式计算[16]。
式中:m1 为喷干后微胶囊的质量,g;m2 为加入芯壁材的质量,g。
1.3.3 虾活性肽包埋率测定
采用考马斯克蓝法检测蛋白质含量[17-18]。配制终浓度为10 mg/mL 的SBPM 溶液,超声辅助提取15 min后,离心(8 000 r/min、10 min),取上清液加入10% 三氯乙酸溶液,漩涡混匀后,室温静置10 min,再次离心,所得上清液即为肽待测液。按1.3.2 方法制备无芯材的空白微胶囊,同法处理空白微胶囊后得到的上清液作为对照。2 种溶液的肽含量差值即微胶囊的肽含量,计算微胶囊对虾活性肽的包埋率。包埋率(Y2,%)按下列公式计算[16]。
式中:m1 为微胶囊的质量,g;m2 为微胶囊的肽含量,mg/g;m3 为投入的总肽质量,mg。
1.3.4 壁材的筛选
以虾活性肽为芯材,阿拉伯胶为主要壁材,按壁材比(质量比)2∶1,将阿拉伯胶分别与β-环糊精、麦芽糊精、壳聚糖进行复配,并在芯壁比(芯材与壁材质量比)1∶1 条件下,分别对虾活性肽进行包埋,以微胶囊包埋率、成型效果为考察指标,筛选效果最优的壁材组合。
1.3.5 SBPM 制备单因素试验
以虾活性肽为芯材,阿拉伯胶与β-环糊精为壁材,分别探究壁材比(质量比)、芯壁比(芯材与壁材质量比)、固形物含量、单甘酯添加量对SBPM 包埋率及产率的影响。单因素试验因素与水平见表1。
表1 单因素试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of single factor experimental
水平1 2 3 4 5影响因素壁材比1∶1 2∶1 3∶1 4∶1 5∶1芯壁比1∶1 1∶2 1∶3 1∶4 1∶5单甘酯添加量/%0.1 0.2 0.4 0.6 0.8固形物含量/%5 10 15 20 25
1.3.6 SBPM 正交试验设计
在单因素试验基础上,选择壁材比(质量比)、芯壁比(质量比)、固形物含量为考察因素,以微胶囊对虾活性肽的包埋率为主要指标,采用三因素三水平正交试验设计,按L9(34)正交表进行试验,优化微胶囊制备工艺。因素与水平见表2。
表2 正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal test
水平1 2 3因素A 壁材比2∶1 3∶1 4∶1 B 芯壁比1∶2 1∶3 1∶4 C 固形物含量/%10 15 20
1.3.7 SBPM 理化指标的测定
1.3.7.1 水分含量参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[19]的直接干燥法测定水分含量。
1.3.7.2 休止角
取滤纸卷成漏斗状,沿内壁加入微胶囊粉末,从固定高度使微胶囊粉末自由下落,测定堆积体顶点到底面距离(H,cm)与堆积体底面半径(R,cm),休止角(∝,°)按下列公式计算。
1.3.7.3 堆积密度
称取适量微胶囊粉末m(g),缓缓加入量筒中,读取其体积为Vp(mL),堆积密度Dp(g/m3)按下列公式计算。
1.3.7.4 粒径分布
取适量微胶囊粉末,加入无水乙醇溶液,用玻璃棒辅助搅拌,超声振荡2 min 使样品分散后,采用激光粒度分析仪检测微胶囊的粒径分布情况。
1.3.8 SBPM 形貌观察
取适量微胶囊粉末,均匀分散贴附于样品盘上,用洗耳球吹去浮粉后,经喷金处理后,扫描电子显微镜观测。
1.3.9 SBPM 红外光谱
取约1 mg 微胶囊粉末与100 mg 光谱级KBr 充分研磨、混匀,压片,制成透明薄片,采用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描分析,扫描范围为400~4 000 cm-1,仪器分辨率为4 cm-1,扫描次数32 次。
1.3.10 SBPM 吸湿性能测定
称量约1 g 微胶囊粉末放入培养皿中,置于盛有饱和硝酸钾(KNO3)溶液的干燥器内(相对湿度92.5%),于室温下平衡7 d,吸湿率(Y3,%)按下列公式计算。
式中:m1 为吸收水分的质量,g;m2 为样品的质量,g。
1.3.11 SBPM 体外缓释性能检测
模拟胃、肠液连续环境(人工胃液和人工肠液参照2020 年版《中国药典》[20]配制),取1.0 g SBPM 置于释放介质中,在37 ℃、100 r/min 搅拌下恒温消化,定时取样,并补充释放溶液(同温度、等体积)[21];取样,采用考马斯克蓝法检测肽的含量,释放率(Y4,%)按下列公式计算。
式中:A1 为释放液中多肽的含量,mg/g;A2 为微胶囊中总肽的含量,mg/g。
采用Excel 2016 和GraphPad Prism 8.0 软件分析处理数据,结果以平均值±标准差表示,显著性分析中不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
固定阿拉伯胶与其他多糖的质量比为2∶1、芯壁比为1∶1(质量比),采用不同复合壁材制备SBPM,其包埋效果、成型效果见表3。
表3 微胶囊壁材筛选结果
Table 3 Microcapsule wall screening results
壁材比(质量比)阿拉伯胶∶β-环糊精=2∶1阿拉伯胶∶麦芽糊精=2∶1阿拉伯胶∶壳聚糖=2∶1包埋率/%58.23±0.20 56.08±0.74 50.93±0.18成型效果成型结构松软,粉末颗粒细小且均匀成型结构较坚硬,粉末颗粒大且均匀成型结构松软,粉末颗粒小且均匀
由表3 可知,综合对比3 种复合壁材制备的包埋率和成型效果,阿拉伯胶与β-环糊精的复配效果优于其余两组复合壁材,其包埋率高,能较好保护虾活性肽,且综合成型效果好。因此,选取阿拉伯胶与β-环糊精作为复合壁材,用于后续试验。
壁材比、芯壁比、单甘酯添加量、固形物含量对虾活性肽包埋率和产率的影响见图1。
图1 各因素对SBPM 包埋率及产率的影响
Fig.1 Effect of various factors on the encapsulation efficiency and yield of SBPM
由图1(a)可知,壁材比为3∶1 时,阿拉伯胶与β-环糊精具有较好的协同作用,对芯材包埋效果较好、产率较高;继续提高壁材用量,则因囊液浓度上升、黏度变大,不利于喷雾干燥,导致包埋效果变差、产率下降。因此,选取壁材比为2∶1、3∶1、4∶1 进行正交试验。
由图1(b)可知,芯壁比对虾活性肽包埋率和产率的影响明显。当芯壁比为1∶1 时,壁材添加量较少,无法完全包裹芯材,且容易产生囊液分层影响其稳定性,最终导致包埋效果差、产率低。随壁材比例增大,包埋率明显提升,芯壁比为1∶3 时,包埋率与产率达到最高。此后,进一步提升壁材比例,包埋率无明显上升,但产率下降,原因在于足量的壁材已能够对芯材形成较好包埋效果,进一步增大壁材比例,囊液浓度上升、黏度变大,反而不利于喷雾干燥,导致产率下降。因此,选取芯壁比为1∶2、1∶3、1∶4 进行正交试验。
由图1(c)可知,添加量为0.1%~0.4%,增加单甘酯可提高微胶囊包埋率及产率,可见增加乳化剂有利于囊液形成均匀的分散体系。但单甘酯添加量过高,囊液易产生微量絮凝,不利于成囊。因此,选取单甘酯添加量为0.4%进行正交试验。
由图1(d)可知,当固形物含量较低时(<5%),囊液较稀、黏度小,对芯材的包埋效果较差。随着固形物含量的增加,囊壁更易形成,微胶囊致密度得到提升,包埋率、产率随之上升。然而,当固形物含量提高到20%~25%时,壁材无法完全溶解,囊液黏度大、流动性差,易堵塞喷嘴或造成粘壁现象。因此,选取固形物含量为10%、15%、20%进行正交试验。
2.1 和2.2 试验结果表明,阿拉伯胶与β-环糊精的壁材比为3∶1 时包埋率和成型效果较好。在此壁材比的基础上,进一步采用正交试验法对芯壁比、壁材比和固形物含量进行优化。正交试验设计与结果见表4。正交试验方差分析见表5。
表4 正交试验设计与结果
Table 4 Orthogonal experimental design and results
编号1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 A1 1 1 2 2 2 3 3 3 227.09 252.31 240.84 B1 2 3 1 2 3 1 2 3 211.91 253.20 255.13 C1 2 3 2 3 1 3 1 2 228.95 249.02 242.27空白1 2 3 3 1 2 2 3 1 239.76 238.25 242.23包埋率/%62.49 81.44 82.16 78.41 89.10 84.80 71.01 81.66 88.17
续表4 正交试验设计与结果
Continue table 4 Orthogonal experimental design and results
编号k1 k2 k3 R离差平方和优组合A 75.70 84.10 80.28 8.41 106.30 A2B3C2 B 70.64 84.40 85.04 14.41 397.40 C 76.32 83.01 80.76 6.69 69.53空白79.92 79.42 80.74 1.33 2.69包埋率/%
表5 正交试验方差分析
Table 5 Orthogonal test analysis of variance
注:*表示影响显著,P<0.05。
差异源A B C误差总和离差平方和106.30 397.40 69.53 2.69 576自由度2 2 2 2 8均方53 199 35 1 F 值39.50 147.66 25.84 P 值0.024 7 0.006 7 0.037 3显著性** *
由表4 和表5 可知,各试验因素对微胶囊包埋率影响的主次顺序为芯壁比>壁材比>固形物含量,最佳工艺组合为A2B3C2,即壁材比为3∶1、芯壁比为1∶4、固形物含量为15%。验证试验表明,此条件下微胶囊的平均包埋率为(90.11±0.23)%,高于任一正交试验组合,包埋效果良好。
采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观测SBPM 的微观结构,结果见图2。
图2 SBPM 的扫描电子显微图像
Fig.2 The micro-morphology of SBPM observed by scanning electron microscopy (SEM)
在最佳工艺下制备的SBPM 为细腻的淡黄色粉末,无不良气味。由图2 可知,SBPM 表面皱缩凹陷,近似球形,也有部分SBPM 为表面光滑的规整球体。出现表面皱缩凹陷,可能与喷雾干燥过程中的高温导致液滴迅速蒸发有关。此外,部分SBPM 发生聚集,成团分布,可能与壁材特性(如阿拉伯胶多糖量高、易吸水)有关;壁材含量较高,则可能进一步增强这种聚集倾向。整体而言,SBPM 的微胶囊表面连续且完整,无孔洞、开裂等现象,能够较好地保护芯材。
采用激光粒度仪检测SBPM 的粒度分布情况,结果见图3。
图3 SBPM 的粒径分布
Fig.3 Particle size distribution of SBPM
由图3 可知,90%以上的SBPM 粒径小于10 μm,即SBPM 的D90<10 μm,且大部分SBPM 的粒径集中在5~10 μm,表明所制SBPM 粉末较为细腻、分布较均匀。休止角试验和堆密度试验的结果表明,SBPM 的堆积密度为(0.36±0.02)g/m3,休止角为(50.19±0.33)°,可见所制微胶囊之间相对松散且流动性良好。微胶囊的水分含量会影响产品的储藏期限,特别是含水量过高时,产品易发黏、结块甚至产生霉变。而SBPM 含水量仅为(4.77±0.19)%,含水量较低,不易发黏。
SBPM、虾活性肽、β-环糊精及阿拉伯胶的傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)见图4。
图4 SBPM 的傅里叶变换红外光谱图
Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of SBPM
采用傅里叶变换红外光谱技术研究SBPM 各成分之间的相互作用,有利于揭示SBPM 的形成过程。由图4 可知,微胶囊在1 044 cm-1(C—O 伸缩振动)、1409cm-(1—CH3弯曲振动)、1 626cm-(1酰胺I带CO 伸缩振动)、2927 cm-1(—CH2)和3 424 cm-1 峰(O—H伸缩振动)等处出现典型吸收峰。1 000~1 300cm-1 的吸收峰来自氨基酸残基的C—O 伸缩振动和羟基C—O—H 弯曲振动[22],可观察到1 044 cm-1 峰强度明显增强,可能与虾活性肽成囊增强了分子振动的偶极矩和振动强度有关。与虾活性肽相比,SBPM 在1 626 cm-1和1 409 cm-1 处振动峰的强度明显减弱;SBPM 在3 424 cm-1 处出现单强峰,与纯β-环糊精相比,该吸收峰变宽并出现蓝移。以上结果表明,虾活性肽与壁材在共混过程中,二者之间存在分子间相互作用,也佐证虾活性肽被成功包埋在壁材中。
对比虾活性肽与微胶囊在高湿环境中的吸湿情况,评估微囊化对虾活性肽吸湿性的影响。累积吸湿曲线如图5 所示。
图5 虾活性肽与SBPM 在高湿环境中的累积吸湿曲线
Fig.5 Cumulative moisture absorption curves of shrimp bioactive peptides and SBPM in high-humidity environment
由图5 可知,未微囊化的虾活性肽粉易吸湿,在高湿环境(相对湿度92.5%)中的吸湿率明显高于SBPM;贮藏第7 天,未微囊化的虾活性肽吸湿率为(52.87±0.46)%,而SBPM 的吸湿率仅为(25.55±0.22)%。部分原因在于经喷雾干燥法制备的SBPM 表面相对致密,不易吸潮。由此可见,微囊化可减少虾活性肽粉的吸湿性,有利于虾活性肽保持稳定。
采用人工胃液和人工肠液,在体外模拟SBPM 依次经历胃液消化和肠液消化的过程,检测释放到消化液中的肽含量,探讨SBPM 在模拟胃肠液中的连续释肽特性,结果见图6。
图6 SBPM 在模拟胃肠液中的连续释放曲线
Fig.6 Continuous release profile of SBPM in simulated gastrointestinal fluid
由图6 可知,SBPM 壁材为多糖,易受胃液酸性环境及消化酶的影响,导致蛋白质泄露,而且复合壁材组分(阿拉伯胶与β-环糊精)在特定pH 值环境下具有低pH 值收缩、高pH 值溶胀的特性[23]。因此,在酸性条件下,微胶囊的复合壁材易受到破坏,导致前期芯材的释放率较高。而在肠液消化过程,微胶囊发生溶胀,此时囊壁表面孔隙变小,芯材释放受阻,因此释放速率降低。SBPM 在胃液消化作用2 h 仅释放35.03%,再经12 h 的模拟肠液消化后累计释放量可达89.82%,表明以阿拉伯胶与β-环糊精为复合壁材具有较好的缓释效果,可在胃肠道环境中缓慢释放虾活性肽。
本研究以南美白对虾副产物(虾头、虾壳)提取的活性肽为原料,采用喷雾干燥法制备SBPM,以微胶囊包埋率及产率为评价指标,经壁材的筛选、单因素试验和正交试验,建立SBPM 的优化制备工艺条件:壁材比3∶1(阿拉伯胶与β-环糊精的质量比)、芯壁比1∶4(质量比)、固形物含量15%、单甘酯添加量0.4%。在优化工艺条件下制备的SBPM 呈淡黄色粉末,为表面皱缩或光滑的类球状微囊,粒径小于10 μm 的微囊占比高于90%,分散性佳、流动性较好,含水量低至(4.77±0.19)%,不易发黏,且对虾活性肽的平均包埋率可达(90.11±0.23)%。SBPM 的形成系壁材和芯材分子间相互作用的结果,其微囊表面连续、完整且致密,无孔洞、开裂等现象,能有效减少高湿(相对湿度92.5%)对虾活性肽的破坏,提高虾活性肽的稳定性,并可实现虾活性肽在模拟胃、肠液中缓慢释放,具有较好的缓释性能。SBPM 的相关研究结果拓展了微囊化技术在虾活性肽的应用范围,为开发功能性虾活性肽产品提供有力的技术支撑。
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