蓝靛果（Lonicera caerulea L.）为忍冬科忍冬属多年生落叶灌木，果实多为椭圆形，呈蓝紫色，果被白霜[1-2]。蓝靛果主要分布于中国东北、日本和俄罗斯等寒带地区，是一种营养价值和药用价值极高的寒地小浆果[3-4]。花青素是蓝靛果中含量丰富的活性物质，在人类和小鼠细胞（肝癌细胞SMMC-7721 和H22）中证实了蓝靛果花青素的抗癌特性[5]。研究表明，蓝靛果花青素可通过上调NrF2 抗氧化途径对氧化应激引起的肝损伤起到保护作用[6]。Fan 等[7]研究发现，蓝靛果花青素中矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷是清除活性氧、发挥抗氧化性的关键组分。De Mello 等[8]证实了蓝靛果花青素可以通过抑制促炎细胞因子和反映高水平氧化应激的分子的产生来抑制神经元损伤，这说明蓝靛果花青素抑制神经系统疾病方面具有很大的潜力。蓝靛果花青素可以抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和二肽基肽酶-4 的活性，从而抵抗糖尿病的发生[9-10]。此外，蓝靛果花青素还被证实具有良好的抗菌、降脂、抗炎等作用，因此在食品和生物医药等行业中应用前景广阔[11-12]。通常，从原料中提取花青素是有效利用花青素的首要和关键步骤。有机溶剂提取法是提取花青素最常用的方法，该方法利用相似相溶固液萃取的原理，从而达到提取分离的效果[13]。此外，为提高花青素的提取效率，通常采用微波、超声、酶等手段辅助提取[14]。但以有机溶剂为提取溶剂会造成环境中的化学污染和食品安全问题[15]。
离子液体是由无机阴离子和有机阳离子组成的盐类混合物，由于其热稳定性强、选择性高、不易挥发、可回收性强，可作为新型绿色溶剂代替传统有机溶剂，符合可持续发展理念[16-17]。苏适等[18]以离子液体作为提取溶剂，采用超声辅助提取法提取黑豆花青素，经工艺优化后黑豆花青素的提取率为4.118 mg/g，相比传统的提取方法，该方法的提取效果更好、更加稳定可行。周凯旋[19]采用传统乙醇回流法（80 ℃，2 h）提取山楂原花青素的得率仅为3.8%，而采用超声辅助离子液体法（49 ℃，41 min）提取山楂原花青素的得率高达6.23%。目前还未有采用离子液体提取蓝靛果花青素的研究，因此，本研究以离子液体为提取溶剂并辅以超声手段，通过单因素试验和响应面Box-Behnken 试验设计，对提取工艺进行优化，以期为蓝靛果花青素的高效利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝靛果：产自黑龙江省七台河市；矢车菊素标准品（分析纯，纯度≥98%）：陕西元贝贝生物科技有限公司；离子液体（[C4mim]PF6、[C6mim]PF6、[C8mim]PF6、[C10mim]PF6、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4、[C8mim]BF4、[C10mim]BF4、[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C10mim]Br、[C4mim]NTF2、[C6mim]NTF2、[C8mim]NTF2 和[C10mim]NTF2）（化学纯）：沈阳赛达科技有限公司；甲醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7.4）、2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS）]（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；去离子水：杭州娃哈哈集团有限公司。
1.2 仪器与设备
KQ-400KDE 型高功率超声波清洗器：巩义市予华仪器有限责任公司；Alpha 1-4 LSC 型冻干机：德国Christ 公司；CARY100 型紫外分光光度计：美国VARIAN 公司；QT-1 型漩涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；3-18K 型离心机：德国希格玛公司；L10-C051型打浆机：九阳股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蓝靛果的预处理
将新鲜的蓝靛果用打浆机打碎成浆后冷冻干燥，得到蓝靛果冻干粉，备用。
1.3.2 花青素得率的测定
准确称取10 mg 矢车菊素标准品于50 mL 棕色容量瓶中，用盐酸-乙醇混合溶液（pH2）定容，得到的矢车菊素标准储备液于4 ℃条件下避光保存。分别移取0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 矢车菊素标准储备液于50 mL 容量瓶中，再用盐酸-乙醇混合溶液（pH2）定容，配制成浓度分别为1、2、4、6、8 mg/L 的矢车菊素标准液。取系列矢车菊素标准液于比色皿中，以盐酸-乙醇混合溶液（pH2）为空白，于520 nm 波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。蓝靛果花青素得率计算公式如下。
式中：X 为蓝靛果花青素得率，%；C 为根据标准曲线计算的溶液浓度，mg/L；V 为提取液体积，mL；D 为稀释倍数；m 为蓝靛果冻干粉质量，mg。
1.3.3 离子液体的筛选
将 离 子 液 体（[C4mim]PF6、[C6mim]PF6、[C8mim]PF6、[C10mim]PF6、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4、[C8mim]BF4、[C10mim]BF4、[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C10mim]Br、[C4mim]NTF2、[C6mim]NTF2、[C8mim]NTF2 和[C10mim]NTF2）与去离子水充分混合，观察离子液体的溶解情况。将可溶于水的离子液体用去离子水分别稀释成质量分数为2%、10%的溶液，配制成蓝靛果花青素提取溶剂，备用。
准确称取0.1 g 蓝靛果粉末，以上述离子液体为提取溶剂，在液料比10.0∶1 （mL/g）、超声功率280 W、超声时间60 min、提取温度50 ℃的条件下提取蓝靛果花青素，记录蓝靛果花青素的含量。随后分别以去离子水、乙醇溶液和甲醇溶液为提取溶剂，按照相同的条件提取蓝靛果花青素并检测提取液中花青素的含量。将检测结果与离子液体水溶液检测结果进行对比。
1.3.4 离子液体提取蓝靛果花青素单因素试验
1.3.4.1 离子液体浓度对花青素得率的影响
用去离子水将离子液体稀释成质量比浓度为4%、6%、8%、10%、12%、14% 的溶液作为提取溶剂。控制液料比为10.0∶1 （mL/g）、超声功率为280 W、超声时间为60 min、提取温度为30 ℃，探究离子液体浓度对蓝靛果花青素得率的影响。
1.3.4.2 提取温度对花青素得率的影响
在液料比10.0∶1 （mL/g）、离子液体浓度12%、超声功率280 W、超声时间60 min 的条件下，探究不同提取温度（30、40、50、60、70、80 ℃）对花青素得率的影响。
1.3.4.3 液料比对花青素得率的影响
在提取温度30 ℃、离子液体浓度12%、超声功率280 W、超声时间60 min 的条件下，探究不同液料比[5.0∶1、7.5∶1、10.0∶1、12.5∶1、15.0∶1、17.5∶1 （mL/g）]对花青素得率的影响。
1.3.5 离子液体提取蓝靛果花青素响应面优化试验
在单因素试验结果的基础上，以花青素得率为响应值，提取温度（A）、离子液体浓度（B）、液料比（C）为自变量，采用三因素三水平的Box-Behnken 设计对离子液体提取蓝靛果花青素的条件进行优化。响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of the response surface experiment
水平-1 0 1因素A 提取温度/℃40 50 60 B 离子液体浓度/%10 12 14 C 液料比/（mL/g）10.0∶1 12.5∶1 15.0∶1
1.3.6 蓝靛果花青素体外抗氧化能力测定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除率
将2.0 mL DPPH-乙醇溶液（0.05 mmol/L）与2.0 mL蓝靛果花青素-乙醇溶液（0.5、1、2、4、8、16、32 mg/mL）混合，在室温下于黑暗处反应30 min。随后测定反应溶液在517 nm 处的吸光度，以VC（0.062 5～32 mg/mL）为阳性对照。蓝靛果花青素对DPPH 自由基清除率（H，%）计算公式如下。
式中：A0 为空白样品的吸光度；A 为待测样品的吸光度。
1.3.6.2 ABTS+自由基清除率
将10 mL ABTS 溶液（3.84 mg/mL）与10 mL 过硫酸钾溶液（1.34 mg/mL）混合，室温下避光反应15 h 后，用PBS 溶液稀释（pH7.4），使稀释液在734 nm 处的吸光度稳定在0.70±0.02。然后将4.8 mL 的蓝靛果花青素溶液（0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/mL）与0.2 mL 的ABTS 稀释液混合，在黑暗中反应5 min，测定反应溶液在734 nm 处的吸光度，以VC（0.015 6～16 mg/mL）为阳性对照。蓝靛果花青素对ABTS+自由基清除率（R，%）计算公式如下。
式中：A0 为ABTS 溶液的吸光度；A1 为反应溶液的吸光度。
1.4 数据处理
所有试验数据均以3 次试验结果的平均数±标准差表示。分别采用Design-Expert 11.0、Origin 9.0 和SPSS 软件进行响应面试验设计、绘图和差异显著性分析，以p＜0.05 作为差异显著性标准。
2 结果与分析
2.1 花青素标准曲线的绘制
以矢车菊素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制花青素标准曲线，如图1 所示。
图1 花青素标准曲线
Fig.1 Anthocyanin standard curve
由图1 可知，花青素的标准曲线方程为y=0.046 2x+0.000 2，相 关 系 数R2=0.999 9，表 明 在1～8 mg/L 范围内，线性关系良好。
2.2 离子液体的筛选结果分析
将离子液体与水充分混合，发现离子液体[C4mim]BF4、[C6mim]BF4、[C8mim]BF4、[C10mim]BF4、[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br 和[C10mim]Br 可溶于水，而离子液体[C4mim]NTF2、[C6mim]NTF2、[C8mim]NTF2、[C10mim]NTF2、[C4mim]PF6、[C6mim]PF6、[C8mim]PF6 和[C10mim]PF6 不溶于水。随后，将可溶于水的离子液体稀释成浓度为2%、10% 的溶液，结果发现离子液体[C6mim]BF4、[C8mim]BF4、[C10mim]BF4 和[C10mim]Br 在 浓 度 为2%时溶解性良好，浓度为10%时溶解性较差，且离心后出现分层现象，产生黄白色沉淀。离子液体[C4mim]BF4、[C4mim]Br、[C6mim]Br 和[C8mim]Br 在 浓 度 为2%和10% 时均可良好溶解，因此，选择[C4mim]BF4、[C4mim]Br、[C6mim]Br 和[C8mim]Br 4 种离子液体进行后续蓝靛果花青素提取试验。不同离子液体提取蓝靛果花青素的得率见表2。
表2 不同离子液体提取的蓝靛果花青素得率
Table 2 Yield of anthocyanins from Lonicera caerulea L.extracted by different ionic liquids
离子液体类型[C4mim]BF4[C4mim]Br[C6mim]Br[C8mim]Br花青素得率/%2%离子液体浓度2.17±0.07 2.33±0.05 2.72±0.06 3.38±0.11 10%离子液体浓度3.14±0.09 2.49±0.07 3.29±0.08 3.42±0.09
由表2 可知，在相同浓度下，采用离子液体[C8mim]Br提取蓝靛果花青素的效果最好。此外，还对其他溶剂提取的蓝靛果花青素得率进行了研究，结果见表3。
表3 不同提取剂提取的蓝靛果花青素得率
Table 3 Yield of anthocyanins extracted from Lonicera caerulea L. with different extractants
%
水1.67±0.09乙醇1.72±0.14甲醇3.24±0.17 2% [C8mim]Br 3.38±0.11 10% [C8mim]Br 3.42±0.09
由表3 可知，在相同条件下，以水、乙醇、甲醇、2%[C8mim]Br 和10% [C8mim]Br 为溶剂提取的蓝靛果花青素得率分别为（1.67±0.09）%、（1.72±0.14）%、（3.24±0.17）%、（3.38±0.11）%和（3.42±0.09）%。显然以离子液体[C8mim]Br 为溶剂提取蓝靛果花青素的得率较高，离子液体作为新兴的提取溶剂，具有提高提取效率、节省有机溶剂、绿色环保等优点。
2.3 离子液体提取蓝靛果花青素单因素试验结果与分析
2.3.1 离子液体浓度对蓝靛果花青素得率的影响
图2 为离子液体浓度对蓝靛果花青素得率的影响。
图2 离子液体浓度对蓝靛果花青素得率的影响
Fig.2 Effect of ionic liquid concentration on the yield of Lonicera caerulea L. anthocyanins
由图2 可知，随着离子液体浓度的增加，花青素得率随之升高，当离子液体浓度为12% 时，蓝靛果花青素得率达到最大值，为（3.24±0.01）%。当[C8mim]Br 浓度继续增大，花青素的得率降低，这是因为提取溶剂黏稠度过高，不利于向细胞内部扩散，从而导致蓝靛果花青素的溶出能力变差[20]。因此，选择离子液体[C8mim]Br浓度为10%、12%、14%进行后续试验。
2.3.2 提取温度对蓝靛果花青素得率的影响
提取温度对蓝靛果花青素得率的影响见图3。
图3 提取温度对蓝靛果花青素得率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of Lonicera caerulea L. anthocyanins
由图3 可知，提取温度为30～50 ℃ 时，提取温度对蓝靛果花青素得率有正向的线性影响，这说明提取温度的升高加上超声的空化作用加速了溶质的溶出。当提取温度为50 ℃ 时，蓝靛果花青素得率达到最大值，为（3.32±0.07）%。然后，随着提取温度的升高，蓝靛果花青素得率逐渐下降，这是由于蓝靛果花青素不稳定，在提取温度较高的条件下易被氧化分解[21-22]。因此，选择提取温度40、50、60 ℃进行后续试验。
2.3.3 液料比对蓝靛果花青素得率的影响结果与分析
液料比对蓝靛果花青素得率的影响见图4。
图4 液料比对蓝靛果花青素得率的影响
Fig.4 Effect of liquid-to-feed ratio on the yield of Lonicera caerulea L. anthocyanins
由图4 可知，当液料比为12.5∶1 （mL/g） 时，蓝靛果花青素得率达到最高，为（3.40±0.15）%。溶剂添加量的增加可能改善溶剂向细胞内的扩散能力，更有利于生物活性成分的溶解，从而导致更高的浸出速率[23]。然而，过量的溶剂会吸收萃取系统中的空化能量，导致蓝靛果花青素产率下降[18]。因此，选择液料比10.0∶1、12.5∶1、15.0∶1 （mL/g）进行后续试验。
2.4 离子液体提取蓝靛果花青素响应面优化试验结果与分析
2.4.1 模型拟合与统计分析
根据Box-Behnken 设计原则，试验设计方案及响应值如表4 所示。
表4 离子液体提取蓝靛果花青素的响应面分析方案及响应值
Table 4 Response surface analysis scheme and response values of anthocyanins extracted from Lonicera caerulea L. by ionic liquid
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 提取温度/℃50 50 60 50 40 50 50 40 50 60 60 40 50 50 50 40 60 B 离子液体浓度/%10 12 12 14 14 12 12 12 14 14 10 12 10 12 12 10 12 C 液料比/（mL/g）15.0∶1 12.5∶1 15.0∶1 15.0∶1 12.5∶1 12.5∶1 12.5∶1 15.0∶1 10.0∶1 12.5∶1 12.5∶1 10.0∶1 10.0∶1 12.5∶1 12.5∶1 12.5∶1 10.0∶1得率/%3.37±0.10 3.48±0.08 3.30±0.15 3.29±0.12 3.27±0.07 3.45±0.08 3.46±0.11 3.29±0.12 3.33±0.09 3.26±0.13 3.35±0.14 3.16±0.22 3.19±0.11 3.47±0.21 3.49±0.17 3.22±0.20 3.33±0.14
采用方差分析对试验数据进行多元回归分析，将二阶多项式方程拟合为Y=3.36+0.061 3A+0.017 5B+0.043 7C-0.015AB-0.012 5AC-0.06BC-0.025 8A2-0.033 3B2-0.040 7C2。
为检验模型的充分性和适用性，方差分析结果见表5。
表5 蓝靛果花青素得率的方差分析结果
Table 5 ANOVA test results of the yield of Lonicera caerulea L.anthocyanins
注：*表示影响显著，p＜0.05；**表示影响极显著，p＜0.01。
来源模型A B C AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总离差平方和0.17 0.011 5×10-5 7.2×10-3 4.9×10-3 6.4×10-3 0.012 0.051 0.030 0.034 2.9×10-3 1.9×10-3 1.0×10-3 0.17方差9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均差0.019 0.011 5×10-5 7.2×10-3 4.9×10-3 6.4×10-3 0.012 0.051 0.030 0.034 4.1×10-4 6.3×10-4 2.5×10-4 F 值45.78 27.16 0.12 17.38 11.83 15.45 29.21 122.98 73.43 82.32 2.53 p 值＜0.000 1 0.001 2 0.738 5 0.004 2 0.010 9 0.005 7 0.001 0＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.195 4显著性*****************
由表5 可知，一次项A、C，交互项AC、BC 和二次项A2、B2、C2 对蓝靛果花青素得率有极显著影响（p＜0.01）。交互项AB 对蓝靛果花青素得率有显著影响（p＜0.05）。决定系数（R2）和调整决定系数（R2Adj）分别为0.983 3 和0.961 8，证实了实际值与预测值之间的高度相关性[24]。此外，相对较低的变异系数（0.61%）表明数据离散程度低，试验值是可靠的[25]。根据F 值[26]，3 个因素对蓝靛果花青素得率的影响大小顺序为提取温度（A）＞液料比（C）＞离子液体浓度（B）。
2.4.2 响应面分析
两个因素之间的交互作用对蓝靛果花青素得率的影响可以用三维响应曲面图来解释，结果如图5 所示。
图5 离子液体提取蓝靛果花青素的3D 响应面图和2D 等高线图
Fig.5 3D response surface and 2D contour of anthocyanin extracted from Lonicera caerulea L. by ionic liquid
由图5 可知，各因素交互作用的响应面图均为中心上凸，表明曲面顶点处对应的试验条件能使得蓝靛果花青素的得率尽可能大，这一现象是合理的，符合试验预期[27]。并且3D 图深色部分主要集中在3.46%附近，说明响应面模型拟合出的最佳蓝靛果花青素得率高于3.46%。椭圆等高线图表示变量之间的交互作用显著，而圆形等高线图则相反[28]。由等高线图可知，提取温度与离子液体浓度、提取温度与液料比、离子液体浓度与液料比之间的交互作用均对蓝靛果花青素的得率有显著影响，这与方差分析结果相一致。
2.4.3 预测模型的验证
根据回归模型，确定最佳蓝靛果花青素提取条件为提取温度51.54 ℃、离子液体浓度11.87%、液料比12.88∶1 （mL/g），该条件下蓝靛果花青素得率预测结果为3.48%。考虑到实际操作的方便性和局限性，调整靛果花青素提取条件为提取温度52 ℃、离子液体浓度12%、液料比13∶1 （mL/g），在此条件下得到的蓝靛果花青素得率为（3.53±0.18）%，与响应面预测值接近，这说明响应面法可用于优化离子液体提取蓝靛果花青素的工艺条件。
2.4.4 不同提取方法的比较
不同提取方法提取的蓝靛果花青素得率如表6 所示。
表6 不同提取方法提取的蓝靛果花青素得率
Table 6 Yield of Lonicera caerulea L. anthocyanins by various extracting methods
注：-表示不涉及此条件下的试验。
方法离子液体提取超声辅助乙醇提取微波辅助乙醇提取液料比/（mL/g）13∶1 13∶1 13∶1超声功率/W 280 280-微波功率/W--280提取温度/℃52 52 52提取时间/min 20 20 20得率/%3.53±0.18 1.65±0.39 2.07±0.44
由表6 可知，采用离子液体提取、超声辅助乙醇提取和微波辅助乙醇提取的蓝靛果花青素得率分别为（3.53±0.18）%、（1.65±0.39）%和（2.07±0.44）%。其中，离子液体提取蓝靛果花青素的效果更好。采用离子液体不仅提高了提取效率，还节省了有机溶剂，在一定程度上保护了环境。综上，离子液体提取花青素更加有意义，为离子液体作为提取剂提取花青素提供了重要的理论依据。
2.5 体外抗氧化试验结果与分析
2.5.1 DPPH 自由基清除率
DPPH 自由基是稳定的单电子自由基，可广泛用于评估物质的抗氧化能力[29]。图6 为蓝靛果花青素清除DPPH 自由基的能力。
图6 蓝靛果花青素清除DPPH 自由基的能力
Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of Lonicera caerulea L. anthocyanins
由图6 可知，在试验浓度范围（0.5～32 mg/mL）内，随着浓度的增加，蓝靛果花青素对DPPH 自由基的清除能力逐渐增强，当浓度达到32 mg/mL 时，蓝靛果花青素DPPH 自由基清除率为（79.17±2.00）%，低于VC 对DPPH 自由基的清除率（99.04±2.02）%。经计算，蓝靛果花青素清除DPPH 自由基的IC50值为13.350 mg/mL。综上，蓝靛果花青素具有良好的清除DPPH 自由基的能力，但弱于VC。
2.5.2 ABTS+自由基清除率
ABTS+在734 nm 波长下具有特征的紫外吸收。当抗氧化剂存在时，吸光度降低[30]。图7 为蓝靛果花青素清除ABTS+自由基的能力。
图7 蓝靛果花青素清除ABTS+自由基的能力
Fig.7 ABTS free radical scavenging ability of Lonicera caerulea L.anthocyanins
由图7 可知，在试验浓度范围（0.25～16 mg/mL）内，随着浓度的增加，蓝靛果花青素清除ABTS+自由基的能力逐渐增大。当花青素浓度为16 mg/mL 时，蓝靛果花青素的ABTS+自由基清除率为（82.99±2.14）%。经计算，蓝靛果花青素清除ABTS+自由基的IC50 值为6.558 mg/mL，而VC的IC50 值为0.217 mg/mL。综上，蓝靛果花青素具有良好的体外抗氧化能力。
3 结论
花青素是蓝靛果中重要的活性物质，具有良好的药用价值。从原料中提取花青素对花青素的应用至关重要。本研究采用离子液体提取蓝靛果花青素，首先对离子液体进行筛选，得到最佳提取溶剂为[C8mim]Br。然后评价提取温度、离子液体浓度及液料比3 个因素对蓝靛果花青素得率的影响。根据单因素试验结果，利用响应面Box-Behnken 试验优化离子液体提取蓝靛果花青素的最佳条件为提取温度52 ℃、离子液体浓度12%、液料比13∶1 （mL/g），此条件下蓝靛果花青素得率为（3.53±0.18）%，高于超声辅助乙醇提取法和微波辅助乙醇提取法的得率。最后研究了蓝靛果花青素的体外抗氧化能力，研究发现当蓝靛果花青素浓度为32 mg/mL时，对DPPH 自由基的清除率为（79.17±2.00）%；当浓度为16 mg/mL 时，对ABTS+自由基的清除率为（82.99±2.14）%。综上，蓝靛果花青素具有良好的抗氧化活性，可作为抗氧化剂应用于食品、生物医药等领域。
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