石斛具有益胃生津、滋阴清热功效[1]，常以茎入药。现代药理学、临床研究证实石斛含有多糖、生物碱、黄酮、多酚等活性成分[2-3]，具有抗氧化、抗炎镇痛、调节免疫力等功效[4-8]，且鲜品石斛中粗多糖、甘露糖、果胶多糖等含量均高于干石斛，其抗氧化活性也更优[9-10]。然而，鲜石斛（或鲜条）放置易霉变，直接保存难度大，其采后通常要进行干燥处理，如制成干条、枫斗等形式。鲜条干燥过程中，多糖成分会发生不可逆改变，多糖含量下降，石斛品质也会受到不同程度影响[9]。为此，学者们尝试开发不同干燥方式并优化工艺来减少石斛多糖、黄酮等活性物质损失。徐兰芳等[11]以铁皮石斛中多糖、游离氨基酸和总氨基酸保留率及7 种单糖组成变化为品质指标，从自然晒干、烘箱烘干、真空冷冻干燥（冻干）、微波干燥4 种方式中筛选出90 ℃烘箱烘干24～36 h 较宜；张雨婷等[12]以铁皮石斛多糖、甘露糖含量为指标，对比红外干燥、烘干、微波干燥和冻干4 种干燥方式，发现冻干法能最大程度地保留样品中的多糖和甘露糖；韩姝葶等[13]研究表明，冻干铁皮石斛多糖含量较微波间歇干燥、热风干燥更高，且色泽及总酚含量也较优；周思静等[14]考察自然晒干、热风60 ℃、热风100 ℃、冻干、微波干燥5 种方式对石斛粉物理特性（色泽、微观结构）、营养成分（氨基酸、矿物质）、活性成分（多糖、总酚、总黄酮）的影响，得到冻干、自然晒干的石斛粉品质更优的结论。
以上研究表明，与常规烘干法相比，冻干石斛形态、色泽与鲜品最为接近，对多糖、黄酮等活性成分保存更有利，但冻干、烘干处理对石斛粉抗氧化活性及其冲泡分散性等品质影响未有深入、全面的考察。基于此，本研究以粗多糖含量为指标，首先从升华干燥温度、时间两方面优化鲜铁皮石斛冻干工艺，进而比较冻干、烘干石斛多糖体外抗氧化活性差异；并考察不同粒径冻干粉、烘干粉的冲泡分散性，以及色泽、黏度、多糖溶出率等，以期为石斛冻干粉产品的产业化加工提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮石斛鲜条（批号230318）：安徽霍山县长冲中药材开发有限公司，茎长15～20 cm、直径0.5～0.8 cm；葡萄糖标准品（优级纯）：南京广润生物制品有限公司；浓硫酸、苯酚、过硫酸钾、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、HCl、FeSO4、水杨酸、过氧化氢、维生素C、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（纯度均≥98%）：上海化源世纪贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
分析天平（PWN124ZH/E）、涡旋振荡器（VXMNFS）：奥豪斯仪器有限公司；真空冷冻干燥机（JB 20032-2004）：福建锜晟智能科技有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9035）：浙江赛德仪器设备有限公司；色差仪（cs-200）、数显恒温水浴锅（HH-4）：常州普天仪器制造有限公司；超声波清洗器（KQ-500B）：昆山市超声仪器有限公司；低温破壁机（935A）：中山市惠人电器有限公司；电子天平（JA2003B）：上海越平科学仪器有限公司；循环水真空泵（SHZ-DⅢ）：巩义市予华仪器有限责任公司；pH 计（PHS-25）：上海仪电（集团）有限公司；台式高速离心机（TG16-WS）：湖南湘鑫仪器仪表有限公司；电动搅拌器（H2010G）：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；旋转黏度计（NDJ-79+DC0506W）：上海平轩科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 石斛鲜条冻干、烘干试验
结合铁皮石斛共晶点-19 ℃[15]及已报道的较优冻干工艺[16]，本试验中石斛鲜条预冻条件设定为-30 ℃、2 h，重点优化对产品品质有关键影响的升华干燥温度及时间，具体操作如下：石斛鲜条经清洗、去杂、晾干后，切成3～6 mm 短段，均匀平铺在冻干机托盘中，置于-30 ℃预冻2 h，此后分别于-10、-20、-30、-40、-50 ℃升华干燥8、12、16 h，真空度控制在70 Pa，即得铁皮石斛冻干品。
鲜石斛烘干试验中，热风干燥条件参考方良材等[17]及文献[18]方法，略作改变，即3～6 mm 鲜石斛短段，置于65 ℃热风干燥12～24 h，其含水量降到5%以下，即得烘干品。
1.3.2 失水率计算石斛鲜条冻干、烘干后失水率（S，%）按公式（1）计算。
式中：m0 为干燥后样品的质量，g；m1 为鲜品的质量，g。
1.3.3 石斛多糖含量检测
上述冻干、烘干石斛段，粉碎过3 号筛得石斛粉，其多糖提取按照《中国药典》2020 版[1]铁皮石斛项下多糖含量测定的方法进行，即石斛粉加热水回流浸提、续滤液加无水乙醇沉淀，80%乙醇洗涤，离心（4 000 r/min、20 min）得粗多糖沉淀，进一步冻干得到干燥的粗多糖样品，可用于石斛多糖含量测定及后续抗氧化活性测定。
配制质量浓度为0.1 mg/mL 的 D-无水葡萄糖标准品溶液，于488 nm 波长下测吸光度，得到葡萄糖浓度（x，mg/mL）与吸光度（y）的标准曲线回归方程为y=7.365x+0.177 5（R²=0.994 9）。
用40 ℃温水配制浓度0.6 mg/mL 的粗多糖溶液，并进一步稀释至0.06 mg/mL，采取苯酚-硫酸法测定铁皮石斛冻干品、烘干品多糖含量，并进一步折算为鲜石斛的多糖含量，即最终结果以D-葡萄糖量占石斛鲜重计（%）。
1.3.4 石斛多糖抗氧化活性测定
参考文献[9，18-20]的方法，通过测定铁皮石斛冻干品和烘干品中多糖对DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（·OH）的清除能力来评价其体外抗氧化活性。测定时，将1.3.2 项下干燥的粗多糖样品配制成质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/mL 的多糖溶液，并选用0.1～0.5 mg/mL的抗坏血酸（vitamin C，VC）溶液作为对照组，每个样品质量浓度测定3 个平行组。自由基清除率（X，%）计算公式如下。
式中：A1 为DPPH 溶液或ABTS 溶液与多糖样品混合后的吸光度；A0 为多糖样品吸光度；A 为DPPH 溶液或ABTS 溶液与等体积蒸馏水混合后的吸光度。
1.3.5 石斛粉性能检测
鲜石斛在上述较优冻干工艺（-30 ℃预冻2 h，-40 ℃升华干燥12 h）下获得对应的冻干品，每次取20 g 于低温破壁机（≤40 ℃）粉碎100 s，粉碎后样品分别过60、80、100 目筛，所得细粉置于干燥皿中用于后续性能测试。
1.3.5.1 出粉率
出粉率（Y，%）计算公式如下。
式中：m1 为石斛细粉质量，g；m2 为粉碎前干石斛段质量，g。
1.3.5.2 溶解时间
过筛后石斛细粉1.0 g，缓慢加入50 mL 纯净水（药典石斛用量6～12 g，取中间数10 g/500 mL 水，故冲泡试验以1 g 石斛粉分散于50 mL 水中），水温85 ℃，用电动搅拌器以50 r/min 搅拌使其充分溶解，记录石斛粉溶解所需时间（s）。
1.3.5.3 结块率
参考文献[21]的方法并进行适当修改。粉碎过筛后粉末2 g 缓慢加入50 mL 85 ℃纯净水中，用电动搅拌器以50 r/min 搅拌30 s，其后用20 目筛网过滤，筛上残渣用纯水清洗，筛网沥干水后于105 ℃电热恒温鼓风干燥箱烘干至恒重，结块率（Z，%）按下式计算。
式中：m1 为冲泡石斛粉质量，g；m2 为沥干后筛网105 ℃烘干至恒重后与筛网质量差，g。
1.3.5.4 色泽
采用色差仪测定1.3.5 过80 目的铁皮石斛冻干、烘干粉的L*值、a*值、b*值，其中L*值表示明度，值越大克度越大；a*值从负到正表示颜色从绿色到红色的变化；b*值从负到正表示颜色从蓝色到黄色的变化[14]。
1.3.5.5 黏度
根据《中国药典》2020 年版四部通则0633 中黏度测定第一法，用黏度计分别测定铁皮石斛冻干、烘干粉冲泡后过滤的溶液在毛细管内从小球上线流动到下线的时间。黏度按下列公式计算。
式中：V 为黏度，mm2/s；K 为毛细管（Φ0.6mm）的常数，mm2/s2；t 为平均流出时间，s。
1.3.6 石斛粉冲泡多糖溶出量测定
取0.2 g 石斛粉用10 mL 的75、85、95 ℃热水冲泡，冲泡水自然放置10～15 min，用250 mL 容量瓶定容、过滤，用苯酚-硫酸法测多糖溶出量[22]，并按下式计算多糖溶出量（D，%）。
式中：m1 为溶出的多糖质量，g；m2 为冲泡石斛粉质量，g。
1.4 数据处理
用Origin 2015 进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，试验重复3 次；使用SPSS 19.0 软件对试验结果进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同冻干条件鲜石斛失水率及其多糖含量的变化
不同干燥条件下鲜石斛失水率和多糖含量如表1所示。
表1 不同干燥条件下鲜石斛失水率和多糖含量
Table 1 Water loss rate and polysaccharide content of fresh D.officinale under different drying conditions
干燥方式及温度烘干，65 ℃冻干，-10 ℃冻干，-20 ℃冻干，-30 ℃冻干，-40 ℃冻干，-50 ℃时间/h 12 18 24 8 12 16 8 12 16 8 12 16 8 12 16 8 12 16失水率/%74.6±1.0 79.5±1.2 80.8±0.9 76.5±1.0 80.9±1.1 81.8±1.3 76.4±0.8 81.0±1.1 81.7±1.2 72.9±0.7 79.6±1.0 80.5±0.9 73.7±0.8 78.9±1.4 80.9±1.0 76.6±1.1 80.7±1.2 82.0±1.3多糖含量/%2.96±0.11 3.19±0.27 3.12±0.18 3.93±0.17 4.03±0.12 4.07±0.12 3.93±0.18 4.67±0.12 4.35±0.16 3.98±0.18 4.77±0.13 4.49±0.17 4.20±0.19 4.35±0.26 4.15±0.17 4.03±0.15 4.40±0.18 4.23±0.20
由表1 可知，鲜石斛采取冻干或烘干处理，其失水率随时间延长逐渐增加并趋于稳定，且失水率变化与升华干燥温度（-10～-50 ℃）关系不大，当升华干燥12～16 h 或烘干18～24 h 时，失水率均在80% 左右。然而，干燥温度和时间对石斛粗多糖含量产生较大影响。对热风干燥而言，65 ℃热风烘干18 h 的石斛多糖含量最高，为（3.19±0.27）%，而15 个冻干条件下的多糖含量均在3.93% 以上，这与缪晓丹等[23]研究发现冻干法是保存石斛多糖最佳的加工方式相一致。本冻干试验中，在-30 ℃或-20 ℃冻干12 h 时，多糖含量较高，分别为（4.77±0.13）%、（4.67±0.12）%，此时多糖含量较烘干法提高近50%。
2.2 多糖体外抗氧化活性分析
基于石斛多糖含量，确立了鲜石斛冻干工艺，即-30 ℃预冻12 h，-30、-20 ℃升华干燥12 h，在此条件下获得的石斛冻干品，其粗多糖对DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力如图1～图4 所示，4 种自由基清除能力的IC50 值如表2 所示。
图1 石斛多糖对DPPH 自由基的清除能力
Fig.1 Scavenging ability of D. officinale polysaccharides against DPPH radical
图2 石斛多糖对ABTS+自由基的清除能力
Fig.2 Scavenging ability of D. officinale polysaccharides against ABTS+ radical
图3 石斛多糖对羟自由基的清除能力
Fig.3 Scavenging ability of D. officinale polysaccharides against hydroxyl radical
图4 石斛多糖对超氧阴离子自由基的清除能力
Fig.4 Scavenging ability of D. officinale polysaccharides against superoxide anion radical
表2 3 种石斛多糖对4 种自由基清除能力的IC50
Table 2 IC50 of polysaccharides from three kinds of dried D.officinale for scavenging of four radicals
组别-30 ℃，冻干-20 ℃，冻干烘干VC IC 50 值/（mg/mL）DPPH·2.949 2.356 6.246 0.186 ABTS+·3.130 2.782 7.294 0.126·OH 2.653 2.658 7.007 0.253 O2-·1.968 2.108 3.846 0.169
由图1～图4 可知，冻干、烘干石斛粗多糖浓度为0.5～4.0 mg/mL 时，其对4 种自由基的清除率逐渐增大且具有浓度依赖性，这与对照组VC 的自由基清除率迅速增长不同；同一浓度下，冻干石斛多糖4 种自由基清除率明显高于烘干石斛，其增幅达41.1%～104.6%，表2的IC50 值更直观地展示这一趋势，即冻干石斛多糖对4 种自由基的IC50 值处于1.968～3.130 mg/mL；而烘干石斛多糖，除对O2-·清除能力（IC50 值为3.846 mg/mL）相对较好外，对其它3 种自由基的IC50 值则处于6.246～7.294 mg/mL，这与贺文韬[24]、欧阳伟虹等[25]研究发现冻干石斛抗氧化能力高于烘干石斛的结果一致。此外，图1～图4 及表2 结果也显示，-20 ℃冻干石斛多糖清除DPPH 自由基和ABTS+自由基的IC50 值低于-30 ℃冻干石斛多糖，·OH 和O2-·的IC50值高于-30 ℃冻干石斛多糖。结果表明：冻干工艺石斛多糖自由基清除能力高于烘干工艺，且随着冻干温度降低对不同的自由基清除能力具有增加或降低的作用，但与表1中多糖含量呈现出升高的趋势有一定偏差。
2.3 性能分析
结合石斛多糖含量及其抗氧化活性的分析，选择以-20 ℃升华干燥12 h 获得冻干石斛进行后续石斛粉品质考察。冻干、烘干石斛低温粉碎后分别过60、80、100 目筛，3 种石斛粉加入85 ℃以上热水[料液比1∶50 （g/mL）]冲泡时，基本在3 s 内可完全分散开，且水溶液呈现一定黏度；继续增大冲泡量[料液比2∶50 （g/mL）]，研究石斛冻干、烘干细粉的冲泡结块情况。冻干、烘干石斛粉性能对比结果如表3 所示。
表3 冻干、烘干石斛粉性能对比
Table 3 Property comparison of powder between freeze-dried and hot air-dried D. officinale
注：-表示未在其条件下进行试验。
干燥方式冻干烘干过筛目数60 80 100 60 80 100出粉率/%73.54 55.46 43.24 72.87 55.84 44.98结块率/%9.5 5.0 24.5 9.5 5.0 29.5 L*值-68.68--59.72-a*值-0.76--2.31-b*值-12.29--16.76-黏度/（mm2/s）-17.14--3.54-
由表3 可知，80 目冻干品、烘干品出粉率较100 目明显提高，其出粉率分别为55.46% 和55.84%，80 目粉质较优无纤维杂质。增大冲泡量后，发现80 目筛粉冲泡时有轻微结团现象，而60、100 目粉冲泡时的结团现象更为普遍，其结块率达到9.5%～29.5%，尤以100 目烘干粉结块最严重，因此在实际应用中受到限制。为此，后续仅选择80 目石斛粉进行色泽、冲泡黏度的测定。
由表3 可知，冻干石斛粉L*值（克度）为68.68，较烘干石斛粉更鲜克；在颜色上，冻干石斛粉偏向蓝绿色，烘干石斛偏向黄红色，这与张悦等[26]研究得到冻干石斛极大地保留石斛鲜药材外观的论点一致；此外，80 目冻干石斛粉冲泡后黏度是同一条件下烘干石斛粉黏度的4.8 倍，其黏度达到17.14 mm2/s，该冻干粉冲泡后黏度和色泽等外观状态与鲜榨石斛汁近似，比鲜汁更方便食用。
2.4 石斛粉冲泡多糖溶出量分析
考虑到冻干粉食用可发挥降血糖、抗氧化等功效，王小军[27]在对牛初乳冻干粉和常乳冻干粉研究表明，冻干粉对糖尿病小鼠有降血糖及抗氧化作用。本试验使用75、85、95 ℃热水冲泡冻干粉后，对冲泡后的溶液进行多糖溶出量检测，结果如表4 所示。
表4 石斛粉冲泡多糖溶出量对比
Table 4 Comparison of dissolved amount of polysaccharides from brewed D. officinale powder
干燥方式冻干烘干多糖溶出量/%75 ℃44.82 35.34 85 ℃37.01 26.19 95 ℃35.84 19.37
由表4 可知，冻干、烘干石斛粉在75、85、95 ℃ 热水冲泡10 min 左右时，随着冲泡温度的升高水溶液中多糖的含量变低，同冲泡温度条件下冻干石斛粉水溶液中的多糖含量高于烘干石斛粉水溶液的多糖含量。冻干石斛粉多糖溶出量普遍高于烘干石斛粉，说明干燥温度越低，多糖的溶出量就越大，这与马厚雨等[28]研究发现干燥温度对铁皮石斛颗粒中多糖溶出特性影响的试验结果是一致的，这也说明冻干石斛粉质疏松，冲泡时活性多糖较易溶出。
3 结论
基于石斛多糖含量及其抗氧化活性评价，优化获得鲜铁皮石斛冻干工艺为鲜石斛切段于-30 ℃预冻2 h、-30 ℃升华干燥12 h，此条件下石斛多糖含量为4.78%（以鲜重计），同时对DPPH·、ABTS+·、O2-·、·OH 4 种自由基呈现较优的清除能力，普遍高于烘干石斛多糖41.1%～104.6%；上述石斛冻干品粉碎过80 目筛石斛细粉出粉率为55.46%，石斛冻干粉色泽鲜克、偏蓝绿色，在75 ℃以上热水中分散性好，结块率低，水溶液多糖溶出率达44.82%。综上所述，石斛冻干粉较烘干粉具有较好的抗氧化活性，冲泡性能好且多糖溶出效果好，具有较大的应用价值和开发潜力。
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