非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）作为一类由肥胖引起的全球性代谢性疾病，主要表现为脂质合成速率大于脂质消耗速率所引起的肝脏脂质堆积[1]。截至2022 年，NAFLD 患者占全球总人数的30%，且其患病率持续增加[2]。越来越多的流行病学研究表明，NAFLD 与非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）和原发性肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）的发生密切相关[3]。然而，NAFLD 的发病机制复杂导致目前仍无有效获批药物用于该类疾病的临床治疗[4]。植源性天然化合物种类丰富、生物活性多样，能通过多靶点、多机制共同改善因肝脏脂质堆积造成的氧化应激、细胞炎症和胰岛素抵抗，有望成为NAFLD防治的新方法[5]。
樱桃李（P. cerasifera）属蔷薇科李属，落叶灌木或乔木，其野生种在我国仅分布于新疆伊犁地区霍城县大、小西沟[6-7]。有研究表明，该果实富含氨基酸、维生素、多酚、多糖、有机酸等营养物质[8]，常被当地牧民加工成果酱、果脯，具有悠久的食用历史。张姣姣等[9-10]通过体内、外实验证实樱桃李果实多酚提取物具有良好的抗氧化、抗炎活性，能降低肝脏高水平的丙二醛（malondialdehyde，MDA），增加肝脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量，减少肝脏脂质堆积和促炎因子介导的炎症应答，从而保护肥胖小鼠肝脏免受损伤。此外，刘伟等[11]研究发现，樱桃李枝、叶的不同萃取相多酚提取物亦具有相同的抗氧化特性，且抗氧化活性与多酚提取物极性相关。Ren 等[12]研究发现，樱桃李多酚提取物（P.cerasifera polyphenol extract，PPE）能通过胆固醇代谢和胆汁酸代谢缓解小鼠的NAFLD。然而，PPE 对NAFLD 小鼠肝脏具体代谢的影响仍不明确，有待进一步研究。
该文以PPE 为材料，干预长期高脂饮食诱导的NAFLD 小鼠模型，通过对小鼠血清生化指标、肝脏病理切片和肝脏非靶向代谢组的检测来探究PPE 对NAFLD 小鼠肝脏的保护作用及其潜在的保肝机制，以期为深入研究PPE 改善NAFLD 小鼠肝脏代谢机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
野生樱桃李红果于2022 年8 月下旬采于新疆伊犁霍城县大西沟，-20 ℃冰箱中保存。野生樱桃李红果经去核，匀浆，浸提液（甲醇∶水∶甲酸=90∶9∶1，体积比）提取，离心（3 000 r/min，10 min），旋转蒸发，AB-8大孔树脂纯化和冷冻干燥后得到PPE 干粉[9]。-20 ℃储存用于后续试验。
ICR 小鼠：新疆医科大学动物实验中心[实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0002]；甘油三酯（triglycerides，TG）、总胆固醇（total-cholesterol，TC）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；福林酚试剂（S30000）：上海源叶生物科技有限公司。普通饲料和60% 高脂饲料（HF60）：戴茨生物科技（无锡）有限公司。
1.2 仪器和设备
数显控温电热套（SXKW）：北京市永光明医疗仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-2000A）、循环水真空泵（SHZ-Ⅲ）：上海亚荣生化仪器厂；酶标分析仪（AMR-100）：杭州奥盛仪器有限公司；切片机（KD3390）：金华科迪仪器设备有限公司；荧光显微镜（80i）：日本尼康公司。
1.3 试验方法
1.3.1 非酒精性脂肪肝小鼠建模及分组
36 只4 周龄的ICR 小鼠在标准环境（25 ℃、相对湿度50%、12/12 h 昼夜循环）下，经1 周普通饲料的适应性喂养后，随机分为对照组（CON，n=13）、模型组（HFD，n=23）。模型组给予11 周60%高脂饲料喂养，对照组给予普通饲料喂养，不限制饮水。以组织形态学和血脂变化作为NAFLD 建模是否成功的评价标准。当NAFLD 小鼠建模成功后，被随机分为模型组（HFD，n=10）和多酚给药组（HFD+H，n=10）。HFD+H组按400 mg/（kg·d）的剂量给药，灌胃体积为0.3 mL，每日1 次，连续干预24 周；CON 组和HFD 组给予等体积的生理盐水作为对照。干预结束后，收集各组小鼠静脉血、肝脏组织用于血清生化指标、肝脏病理切片和肝脏代谢组检测。
1.3.2 血清TG、TC 检测
按试剂盒操作说明分别对各处理组小鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平进行定量检测与分析。
1.3.3 小鼠肝脏组织切片
10% 福尔马林溶液固定的各处理组肝组织，经清水冲洗、梯度乙醇水溶液（30%、50%、75%、90%、95%、100%）脱水及二甲苯透明后，依次包埋到石蜡中。获得4 μm 厚的肝脏组织切片后，用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，并在荧光显微镜明场下观察拍照。
1.3.4 小鼠肝脏代谢组测定
将收集的小鼠肝组织在液氮中速冻后，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography - quadrupole electrostatic field orbital trap mass spectrometry，UHPLC-QE-MS）技术进行肝脏非靶向代谢组测定。操作步骤：准确称取25 mg 的肝脏样品并加入1 mL 的提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1，体积比，含内标物质，-40 ℃预冷），经研磨、超声、静置、离心（12 000 r/min，15 min）后得到的样品上清液。样品上清液在Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （150 mm×2.1 mm，1.7 μm）液相色谱柱中进行色谱分离并通过Orbitrap Exploris 120 高分辨质谱仪的平行反应监测模式（parallel reaction monitoring，PRM）进行质谱分析后，对得到的原始数据进行筛选用于肝脏代谢组的定量分析。液相色谱A 相为5 mmol/L 的乙酸铵水溶液，B 相为乙腈。柱温箱温度为45 ℃，样品盘温度设为4 ℃，进样体积为2 μL。
1.4 统计分析
采用SPSS 21.0 软件和Graphpad 8.0 对所有血清生化数据进行统计学分析和作图。代谢组数据均使用R 语言（4.2.1 版本）进行分析和作图。所有数据均以平均值±标准差表示。P＜0.05 被认为具有统计学差异。
2 结果与分析
2.1 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠血清生化指标的影响
樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠血清TG、TC、AST 和ALT 水平的影响见图1～图4。
图1 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠血清TG 的影响
Fig.1 Effects of P. cerasifera polyphenol extract on serum TG in NAFLD mice
图2 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠血清TC 的影响
Fig.2 Effects of P. cerasifera polyphenol extract on serum TC in NAFLD mice
图3 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠血清AST 的影响
Fig.3 Effects of P. cerasifera polyphenol extract on serum AST in NAFLD mice
图4 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠血清ALT 的影响
Fig.4 Effects of P. cerasifera polyphenol extract on serum ALT in NAFLD mice
肝脏是重要的代谢器官，主要参与脂质的外源消化、吸收以及内源合成、分解。长期暴露于高脂饮食，肝细胞中脂质异常堆积、变性会直接引发肝细胞损伤[13-14]。若肝细胞受损会导致其细胞膜通透性增加，致使血清中转氨酶活性升高[15]。因此，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）常作为NAFLD 发生的诊断指标被检测。由图1～图4 可知，与CON 组相比，HFD 组小鼠血清中TG、TC、AST 和ALT 水平均显著升高（P＜0.05），表明长期高脂饮食导致HFD 组小鼠的肝脏出现明显的脂质堆积、变性和损伤。HFD+H 组小鼠血清中TG、TC、AST 和ALT 水平较HFD 组显著降低，说明PPE 能有效减轻NAFLD 小鼠肝脏的脂质堆积、变性和损伤，具有良好的保肝效果。
2.2 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠肝脏组织形态的影响
樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠肝脏组织形态的影响见图5。
图5 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠肝脏组织形态的影响
Fig.5 Effects of P. cerasifera polyphenol extract on liver tissue morphology in NAFLD mice
NAFLD 的组织病理学特征主要表现为肝细胞脂肪变性、小叶内炎症以及肝细胞气球样变性[16-17]。由图5 可知，HFD 组小鼠肝脏组织较CON 组出现明显的肝脏小叶内炎症、脂肪变性和气球样变性。与HFD组小鼠肝脏组织相比，HFD+H 组小叶内炎症、脂肪变性和气球样变性得到逆转，表明PPE 对NAFLD 小鼠具有显著的治疗效果。
2.3 樱桃李多酚提取物对NAFLD 小鼠肝脏代谢组的影响
2.3.1 数据质量评价
代谢组数据能准确体现机体已经发生的变化，而代谢组数据是否可靠主要取决于检测系统的稳定性，故评价检测系统稳定性和检测方法重复性的质量控制（quality control，QC）样本能直观反映代谢组数据的好坏[18]。对肝脏非靶向代谢组数据进行主成分分析（principle components analysis，PCA），结果见图6。随即对3 组样本进行正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLSDA），结果见图7。
图6 3 组样本间的PCA 得分图
Fig.6 PCA score plot between three groups of samples
图7 OPLS-DA 得分图
Fig.7 OPLS-DA score plot between two groups
由图6 可知，QC 样本并未表现出离散现象，说明此次肝脏代谢组数据的可靠性及重复性良好。图7 结果显示HFD 组和CON 组以及HFD+H 组和HFD 组的各样本分离明显，说明HFD 组和CON 组以及HFD+H组和HFD 组之间的代谢组差异较大。
2.3.2 差异代谢物筛选
以OPLS-DA 多元统计分析得到的变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）＞1 和单因素方差分析的P＜0.05 为依据，对3 组小鼠肝脏差异代谢物进行两两分析并绘制韦恩图，结果见图8。
图8 3 组小鼠肝脏差异代谢物韦恩图
Fig.8 VENN diagram of differential metabolites in livers of mice in three groups
由图8 可知，HFD 组与CON 组间共筛选到83 个差异代谢物，其中，45 个代谢物下调，38 个代谢物上调；HFD+H 组与HFD 组共筛选到279 种差异代谢物，其中，139 个代谢物下调，140 个代谢物上调。
CON、HFD 和HFD+H 3 组小鼠肝脏差异代谢物见表1。
表1 CON、HFD 和HFD+H 3 组小鼠肝脏差异代谢物
Table 1 Differential metabolites in livers of mice in CON，HFD and HFD+H groups
注：↑表示上调，↓表示下调。# 表示差异显著，P＜0.05；*表示差异极显著，P＜0.01。
序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41代谢物名称甜菜碱乙酰甘氨酸甘油醛丙酰肉碱2-吡咯烷酮2，5-二氯-羧基亚甲基丁-2-烯-4-内酯甘油酸L-苏氨酸硫酸吲哚酚脱氢抗坏血酸儿茶素β-D-半乳糖L-鼠李糖二十二碳五烯酸 （22n-3）脯氨酰天冬酰胺2-糠酸PC[22∶5（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z）/20∶5（5Z，8Z，11Z，14Z，17Z）]D-葡萄糖醛酸内酯N-甲氧基螺油菜酚D-木酮糖1'-O-乙酰帕西林3'-葡萄糖基-2'，4'，6'-三羟基苯乙酮5，6-二氢-5-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮精氨酸3α，4，5，7α-四氢-5-羟基-1H-异吲哚-1，3（2H）-二酮6-磷酸果糖3-羟基戊二酸衣康酸磺草唑胺胞苷[12]-姜辣素山竹醇A 7-甲基黄嘌呤苏氨酰-苏氨酸L，L-环（克氨酰脯氨酰）酒渣碱3-甲基腺嘌呤PS[20∶5（5Z，8Z，11Z，14Z，17Z）/18∶1（9Z）]4-羟基苯基丙酮酸3-甲基鸟嘌呤5，7-二羟基黄酮保留时间/s 351.711 49.041 9 148.006 299.094 374.276 378.894 315.718 5 369.627 27.013 6 112.014 5 74.270 75 361.952 5 147.401 37.388 9 363.827 57.135 25 177.548 172.423 351.705 308.782 228.993 259.173 165.08 383.523 447.55 169.136 94.793 3 115.913 462.133 509.05 167.866 373.124 338.161 78.234 2 247.428 463.065 178.67 211.817 89.640 3 193.535 445.185质荷比m/z 118.09 116.03 89.02 218.14 100.08 208.94 105.02 120.07 212.00 173.01 289.07 179.06 209.07 329.25 230.11 111.01 854.55 221.03 283.06 149.04 478.26 331.10 229.08POS 176.10 168.07 259.02 147.03 129.02 415.99 242.08 377.27 487.10 165.04 221.11 211.14 309.09 150.08 808.51 179.03 166.07 277.05采集模式POS NEG NEG POS POS POS NEG POS NEG NEG NEG NEG NEG NEG POS NEG POS NEG POS NEG POS POS POS POS NEG NEG NEG NEG NEG NEG POS NEG POS POS POS POS POS NEG POS POS HFD 组比CON组↓*↓#↓#↓*↑#↑#↓#↓#↑#↓#↓*↓#↓*↑#↓#↓*↑*↓*↓*↓#↓*↑#↑*↓#↑*↓#↓*↓*↑#↓*↓*↑*↓#↑#↑#↑*↓#↑#↓*↑#↑*HFD+H 组比HFD 组↑#↑*↑*↑*↓*↓#↑#↑#↓*↑*↑*↑*↑*↓*↑*↑*↓*↑*↑*↑*↑#↓#↓#↑*↓#↑#↑*↑*↓*↑*↑#↓*↑*↓#↓#↓*↑#↓*↑*↓*↓#
由表1 可知，在CON、HFD 和HFD+H 3 组中共筛选出41 个差异代谢物。与CON 组相比，HFD 组中甜菜碱、脱氢抗坏血酸、精氨酸、衣康酸等显著降低；而PPE 干预对以上代谢物均具有显著的逆转效果。甜菜碱可由动物体代谢胆碱获得，具有提供甲基、稳定胞内渗透压，促进脂质代谢、清除自由基和减少促炎因子分泌等功能[19-20]。有学者认为体内甜菜碱含量降低或不足将引发NAFLD 的发生[21]。在本研究中，HFD 小鼠肝脏中甜菜碱的含量极显著下降，表明小鼠NAFLD形成；而在樱桃李多酚干预后，小鼠肝脏内甜菜碱含量显著上升。精氨酸是构成蛋白质的常见氨基酸之一，可被精氨酸酶代谢为鸟氨酸和尿素。有研究表明，NAFLD 患者血浆中精氨酸水平较低[22]；而适当给予精氨酸补充剂能有效缓解NAFLD 向NASH 的发展[23]。樱桃李多酚干预使小鼠肝脏中精氨酸的水平得到提升，说明樱桃李多酚能够抑制NAFLD 的发展。脱氢抗坏血酸与抗坏血酸在生物体内共同组成氧化还原系统，具有抗氧化、抗炎活性。此外，衣康酸可减轻高氟酸诱导的氧化应激和肝脏脂肪变性[24]。在樱桃李多酚干预下，小鼠肝脏中脱氢抗坏血酸和衣康酸含量的增高表明樱桃李多酚通过增强肝脏的抗氧化活性调节体内的代谢异常。
2.3.3 差异代谢物的京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析
差异代谢物KEGG 通路富集分析见图9。
图9 差异代谢物KEGG 通路富集分析
Fig.9 KEGG pathway enrichment analysis of differential metabolites
由图9 可知，相比于CON 组，HFD 组差异代谢物所富集的嘧啶代谢，蛋白质消化和吸收，代谢途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，氨基酸的生物合成，氨酰-tRNA 生物合成和ABC 转运蛋白等被显著下调；相比于HFD 组，多酚干预后差异代谢物所富集的缬氨酸、克氨酸和异克氨酸生物合成，嘧啶代谢，蛋白质消化和吸收，磷酸戊糖途径，代谢途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，碳代谢，氨基糖和核苷酸糖代谢和ABC 转运蛋白等被显著上调。由此可知，嘧啶代谢、蛋白质消化和吸收、代谢途径、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、氨基酸的生物合成和ABC 转运蛋白是HFD 组比CON 组和HFD+H 组比HFD 组共有的差异代谢通路，是PPE缓解NAFLD 作用机制中具有重要作用的代谢通路。
3 结论
本文以PPE 干预长期高脂喂养建成的NAFLD 小鼠模型，通过对小鼠血清生化指标、肝脏病理切片和肝脏非靶向代谢组的检测来探究PPE 对非酒精性脂肪小鼠肝脏的保护作用，及其潜在的保肝机制。研究结果表明，PPE 干预能显著降低NAFLD 小鼠血清中高水平的TG、TC、AST 和ALT，且有效减少NAFLD 小鼠肝脏小叶内炎症、脂肪变性和气球样变性。基于代谢组学分析，在CON、HFD 和HFD+H 3 组中最终筛选出41 个差异代谢物，其中，HFD+H 组小鼠肝脏中甜菜碱、脱氢抗坏血酸、精氨酸、衣康酸等含量极显著增加，且差异代谢物主要富集在嘧啶代谢、蛋白质消化和吸收、代谢途径、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和ABC 转运蛋白等通路中，揭示PPE 能通过增强机体抗氧化活性来缓解NAFLD。
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