海狸鼠（Myocastor coypus）又名河狸鼠，原产于南美洲及非洲南部，是一种较大型的啮齿动物[1-3]。随着世界裘皮业及毛皮兽养殖业的发展，海狸鼠先后被阿根廷、意大利、波兰等国大量饲养繁殖。50 年代和80 年代我国曾多次从国外引种[4-5]。海狸鼠皮板结实耐磨，绒毛丰厚，其毛色型丰富、色泽美观，是制作翻毛大衣、航空服、皮帽、皮领、皮靴等的优质原料[6-8]。因其价格较低、耐用，销售前景广阔。除此之外，海狸鼠深加工后的高附加值产品也得到广泛应用，如海狸鼠油可制作高级化妆品[9-10]；海狸鼠血可用于治疗胃肠道疾病；海狸鼠尾巴里的筋可制成可吸收蛋白缝合线等[11-12]。然而，海狸鼠肉目前尚无明确用途，因其价格十分低廉，有不法分子将其用作市场上混合肉的掺假原料。掺假肉不仅关系到产品经济价值，还严重威胁人类健康。因此，有必要检测肉及肉制品中是否掺杂有海狸鼠成分，其检测结果的准确可靠对于检测机构及相关方都至关重要[13]。2019 年1 月31 日国家市场监督管理总局发布了食品补充检验方法BJS 201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》[14]，用于海狸鼠源性成分的定性检测。然而目前尚缺乏与该方法配套使用的标准样品，造成相关检测机构在检测样品时无标准样品可供使用。
标准样品作为实物标准，是国家标准化工作的重要组成部分[15]，是保证结果准确的重要技术，均匀性、稳定性、准确性和溯源性是标准样品的四大特性，对于实验室检验全过程的质量控制、测量程序的评估和校准等方面都起着十分重要的作用[16-17]。针对相关标准样品的迫切现实需求，本研究以海狸鼠为原料，研制海狸鼠源性成分定性标准样品，以期为海狸鼠源性成分鉴定方法及相关检测提供必要的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海狸鼠：成都市众一养殖有限公司，经前处理并验证后备用。猪、黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、鸡、鸭、鹅：市售生鲜肉，并经测序比对确认后备用。
细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）预混液、海狸鼠测序引物、探针：生工生物工程（上海）有限公司；无水乙醇（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
BSA223S 型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5427R 低温离心机：德国Eppendorf 公司；DK-420 电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；P330 核酸蛋白仪：德国IMPLEN 公司；CFX96 实时荧光PCR 仪：美国Bio-Rad 公司；ZB600-2S 深凹型双室真空包装机：上海至奔包装机械有限公司；S3-LA166（S）绞肉机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品原料获取及验证
对海狸鼠原料进行去皮、去脂肪、去内脏等处理，取肌肉组织。取样全程确保所使用刀具、案板、包装等为全新或一次性，防止交叉污染。采用分子生物学检测方法BJS 201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR 法》进行检测。依据实时荧光PCR 仪自动计算所得Ct 值进行判定。阳性对照应有6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein，FAM）荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct 值≤30.0；阴性对照和空白对照应无FAM 荧光信号检出。如样品结果Ct 值≤30.0，则判定为检出海狸鼠源性成分，如样品Ct 值＞30.0，则判定为未检出海狸鼠源性成分。同时，对样品进行测序，将样品DNA 条形码序列与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库，利用基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行比对，具体比对步骤参照GB/T 35918—2018《动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger 测序法》[18]序列分析中的操作步骤。
1.3.2 样品制备
取海狸鼠肌肉组织，采用全新、未使用的绞肉机将其粉碎至肉糜状；等全部肌肉组织粉碎完成后，再将全部肉糜放入较大容量的均质器中充分均质混匀，备用。样品采用全新且无污染的铝箔袋包装。将混匀的样品用电子天平称量，2 g/袋。分装好的样品用真空包装机抽真空密封包装，包装好样品委托四川原子能研究院进行电子束辐照灭菌，辐照剂量为5 kGy，辐照后置于-18 ℃冷冻保存。全程所使用的包装等为全新，防止交叉污染。
1.3.3 排他性验证
将样品按照GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR 法》[19]进行成分检测，设置的阳性对照分别有猪、黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、鸡、鸭、鹅。分别以验证源性成分的动物DNA为阳性对照，以海狸鼠标准样品DNA 为阴性对照，灭菌双蒸水为空白对照，依据GB/T 38164—2019 方法中所对应源性成分的反应体系及参数进行荧光PCR 测定。反应结束后，依据GB/T 38164—2019 中的结果判定原则，判定海狸鼠标准样品中是否含有上述动物源性成分。
1.3.4 样品均匀性研究
按照GB/T 15000.3—2023《标准样品工作导则 第3 部分：标准样品 定值和均匀性与稳定性评估》[20]的要求，采用随机数生成软件生成15 个随机整数抽取相应编号的样品，采用检测方法BJS 201904 对样品进行海狸鼠源性成分实时荧光PCR 的定性检测，每个样品重复检测2 次。依据检测方法对检测结果进行判定是否检出海狸鼠源性成分；同时记录Ct 值，对Ct 值采用单因素方差分析法进行分析，评估样品的均匀性。根据自由度（f1，f2）及给定的显著性水平α，查F 表得到临界的Fα 值，若F＜Fα，则表明样品间无显著性差异，样品是均匀的。
1.3.5 样品稳定性研究
1.3.5.1 短期稳定性研究
采用同步法进行样品短期稳定性的研究，样品采用-18 ℃条件下冷冻保存，即-18 ℃作为参考条件，模拟实际样品的运输条件，选择25、36、60 ℃ 3 个温度点分别模拟样品运输的常温、高温和极端高温；在25 ℃条件下，分别在第1 周、第2 周、第3 周时每天检测3 份样品，共检测9 份样品；在36 ℃条件下，分别在第1 周、第2 周、第3 周时每天检测3 份样品，共检测9 份样品；在60 ℃条件下，分别在第1 周、第2 周时每天检测3 份样品，共检测6 份样品。采用检测方法BJS 201904 对样品进行检测，每份样品重复测试2 次。依据检测方法对检测结果进行判定是否检出海狸鼠源性成分；采用方差分析对检测结果的Ct 值进行评估，评估样品间有无显著性差异，判断样品短期稳定性是否符合要求。
1.3.5.2 长期稳定性研究
长期稳定性研究采用经典法研究。抽样时间点的设定按照先密后疏的原则，依次在1、2、3、4、5、6、9、15、24 个月共9 个时间点，在每个预先设定的时间点从保存的样品中随机抽取3 份样品进行检测，每个样品重复检测2 次。检测方法同样采用BJS 201904。检测结果同样依据检测方法进行判定是否检出海狸鼠源性成分；检测结果的Ct 值采用趋势分析法分析，若 |b1|＜t（0.05，n-2）×s（b1），则表明斜率不显著，未观察到不稳定性。
1.3.5.3 开封后稳定性研究
本研究研制的标准样品包装规格为2 g/袋，使用时按照标准方法从包装中取100 mg 进行检测，因此样品可供多次使用，故对样品进行开封后的稳定性检验。样品于-18 ℃条件下保存，随机抽取3 个检测样品，分别在第0、7、14、21、28、60、90 天时进行检测，每份样品重复测试2 次，同样采用BJS 201904 检测方法。依据检测方法对检测结果进行判定是否检出海狸鼠源性成分；采用方差分析对检测结果的Ct 值进行评估，评估样品在开封后反复冻融使用是否能满足要求。
1.3.6 样品定值
按照GB/T 15000.3—2023 的要求，共邀请10 家具备相应检测能力的实验室参加海狸鼠源性成分定值。参加定值的实验室均建立了完善的质量管理体系，有很好的质量控制措施，人员、试剂和设备、环境、量值溯源等均能满足检测能力的需求。向每个定值实验室发送3 个样品，依据BJS 201904 进行检测，每个样品独立检测3 次。
同时，选取3 家定值实验室的9 份标准样品进行DNA 测序比对验证。将测序结果进行拼接后，去除两端不稳定的碱基序列，保留上、下游引物之间的碱基序列，作为该样品DNA 的序列。将样品DNA 序列导入NCBI 数据库中进行BLAST，取比对结果中碱基覆盖度和序列一致性最高的物种作为样品DNA 的比对结果物种。参考SN/T 3731.5—2013《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5 部分 鸭成分检测 PCR法》[21]，同源性达到97%以上，则证明为海狸鼠成分。
1.4 数据处理与分析
所有的样品实时荧光PCR 检测结果由仪器软件（Bio-Rad CFX Manager 3.0）自动生成；所有样品的测序结果与NCBI 进行BLAST，确定同源性。
2 结果与分析
2.1 原料验证结果分析
2.1.1 实时荧光PCR 结果分析
对样品原料的验证结果见表1 和图1。
图1 样品原料验证PCR 扩增图
Fig.1 PCR amplification map for raw materials
表1 样品原料PCR 验证结果
Table 1 PCR validation results of raw materials
样品编号Ct 值-1 Ct 值-2阴性对照阴性对照无模板对照无模板对照荧光基团FAM FAM FAM FAM FAM FAM Ct 值13.10 14.60无无无无
表1 和图1 结果表明，样品原料采用BJS 201904方法检测，判定结果为海狸鼠阳性，符合要求。
2.1.2 测序结果分析
将样品测序序列与NCBI 中海狸鼠基因序列（序列号：MH182628.1）进行比对，比对结果见图2。
图2 样品原料测序结果
Fig.2 Sequencing results of raw materials
由图2 可知，比对结果同源性为100%，鉴定结果为海狸鼠源性成分；与PCR 检测结果一致，说明原料为海狸鼠，符合标准样品研制的要求。
2.2 排他性验证结果
对海狸鼠标准样品验证不同源性成分的结果见表2。
表2 样品原料排他性验证结果
Table 2 Exclusivity verification results of raw materials
序号Ct 值1 2 3 4 5 6源性成分猪黄牛水牛牦牛山羊绵羊平行结果1 20.28 18.75 15.32 16.74 16.12 17.72平行结果2 19.85 18.74 15.23 17.11 16.67 18.05
续表2 样品原料排他性验证结果
Continue table 2 Exclusivity verification results of raw materials
序号源性成分Ct 值7 8 9 10兔鸡鸭鹅11 12海狸鼠阴性对照平行结果1 22.46 17.48 19.83 19.71 0.00 0.00平行结果2 22.31 17.34 20.16 18.96 0.00 0.00
表2 结果表明，不同源性仅相应的阳性对照出现典型的扩增曲线，且Ct 值符合质控要求；海狸鼠标准样品均未出现任何扩增现象，说明海狸鼠标准样品中不含猪、黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、鸡、鸭、鹅等源性成分。
2.3 样品均匀性研究分析
样品经实时荧光PCR 检测果可知，所有样品检测结果均为海狸鼠源性成分阳性。样品均匀性检测Ct值的方差分析结果见表3。
表3 海狸鼠定性分析标准样品均匀性分析结果
Table 3 Homogeneity results of reference materials of Myocastor coypus （qualitative）
变差源组间组内平方和3.447 237 2.531 400自由度14 15均方0.246 231 0.168 760 F 值1.46 F 临界值2.42置信概率0.95
由表3 可知，F 值（1.46）小于F 临界值（2.42），说明样品内和样品间的检测结果没有显著性差异，样品均匀性符合要求。
2.4 样品稳定性研究结果分析
2.4.1 短期稳定性研究结果
所有样品实时荧光PCR 检测结果，Ct 值在13.84～18.31 之间，远远小于BJS 201904 中规定的限值（Ct 值≤30），即检测结果均为海狸鼠源性成分阳性。样品短期稳定性检测Ct 值的方差分析结果见表4。
表4 海狸鼠定性分析标准样品短期稳定性分析结果
Table 4 Short-term stability analysis results of reference materials of Myocastor coypus （qualitative）
变差源组间组内平方和3.457 908 2.729 888自由度23 24均方0.150 344 0.113 745 F 值1.32 F 临界值1.99置信概率0.95
由表4 可知，F 值（1.32）小于F 临界值（1.99），说明样品内和样品间的检测结果无显著性差异。由此可知，在模拟运输条件（25 ℃条件下3 周，36 ℃条件下3 周和60 ℃条件下2 周）下，样品中海狸鼠源性成分定性检测结果均为阳性，且Ct 值没有显著性差异，样品可以在常温条件下运输。样品的短期稳定性符合要求。
2.4.2 长期稳定性研究结果
标准样品长期稳定性研究结果见表5。
表5 标准样品长期稳定性分析结果
Table 5 Long-term stability analysis results of reference materials
参数b1 b0参数s(b1)s(b0）s2 s分析结果-0.008 4 15.680 3 0.784 0.885 tb1 t(0.05，n-2)分析结果0.041 2 0.435 8 0.203 9 2.306
表5 结果表明，t（0.05，n-2） ×s（b1）= 0.095 1，|b1|=0.008 4，即|b1|＜t（0.05，n-2） ×s（b1），斜率不显著，说明标准样品在-18 ℃条件下保存24 个月稳定性良好，能够满足标准样品的预期用途。
2.4.3 开封后稳定性研究结果
标准样品开封后稳定性检测结果见表6。
表6 标准样品开封后稳定性检测结果（Ct 值）
Table 6 Stability test results of reference materials after being opened （Ct value）
时间/d 0 7 14 21 28 60 90样品1结果1 15.46 15.38 15.45 15.15 15.52 15.58 15.54结果2 15.72 15.29 15.41 15.16 15.89 15.53 15.39样品2结果1 15.96 14.91 15.14 15.42 15.81 16.11 15.60结果2 15.64 14.85 15.34 15.37 15.78 16.11 15.45样品3结果1 14.80 15.25 15.42 16.18 15.80 15.99 16.34结果2 14.86 15.35 15.37 16.16 15.55 15.89 16.45
由表6 可知，经所有样品实时荧光PCR 检测结果均为海狸鼠阳性。样品均匀性检测Ct 值的方差分析结果见表7。
表7 标准样品开封后稳定性分析结果
Table 7 Stability analysis results of reference materials after being opened
变差源组间组内平方和1.181 840 1.943 667自由度6 14均方0.196 973 0.138 833 F 值1.42 F 临界值2.85置信概率0.95
由表7 可知，F 值（1.42）小于F 临界值（2.85），说明样品在-18 ℃条件下保存，在90 d 内反复冻融7 次，样品检测结果均为海狸鼠源性成分阳性，符合要求。
2.5 定值结果分析
经10 家定值实验室检测，样品检测结果均检出海狸鼠源性成分，即海狸鼠源性成分阳性，阳性率为100%。样品检测结果Ct 值见表8。对9 份标准样品的DNA 测序比对验证结果见表9。
表8 定值检测结果（Ct 值）
Table 8 Test results of property values （Ct value）
实验室编号实验室1实验室2实验室3实验室4实验室5实验室6实验室7实验室8实验室9实验室10样品1样品2样品3结果1 18.08 15.27 13.96 14.90 14.46 14.41 17.83 16.58 17.15 17.58结果2 17.02 15.31 13.84 15.65 13.83 14.89 17.00 17.32 17.64 17.59结果3 17.02 14.57 13.90 14.54 15.20 15.31 17.37 17.26 17.62 17.23结果1 16.72 15.61 14.35 15.77 14.40 15.39 15.57 17.44 17.79 18.08结果2 16.88 15.54 13.69 15.46 15.24 15.26 15.49 16.92 16.55 17.78结果3 16.18 15.59 14.29 14.49 14.37 15.48 15.43 17.57 17.25 18.21结果1 15.91 15.04 14.16 14.63 14.31 15.66 16.94 17.51 17.06 18.05结果2 17.46 15.12 14.36 14.95 14.64 15.33 17.64 17.50 17.18 18.31结果3 16.94 15.19 14.69 15.35 14.56 15.61 16.61 17.16 16.44 17.80
表9 标准样品DNA 测序比对结果
Table 9 DNA sequencing comparison results of reference materials
样品编号HLSRM-10#HLSRM-11#HLSRM-12#HLSRM-22#HLSRM-23#HLSRM-24#HLSRM-28#HLSRM-29#HLSRM-30#片段长度/bp 328 329 329 328 330 330 328 327 329碱基覆盖度/%100 100 100 100 100 100 100 100 100序列一致性/%99.09 100.00 100.00 99.70 99.70 99.70 99.09 99.39 100.00匹配度最高物种Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus Myocastor coypus
表8 结果表明，所有样品海狸鼠源性成分检测结果均为阳性。表9 结果表明，覆盖度均为100%，序列一致性均达到99.00% 以上，均大于90%（GB/T35918—2018），且均大于97%（SN/T 3731.5—2013），证明样品为海狸鼠源性成分阳性。说明本研究研制的标准样品能够满足标准样品的预期用途。
3 结论
本研究研制了肉及肉制品中海狸鼠源性成分定性标准样品，经过检验标准样品的均匀性和稳定性良好；该标准样品为定性检测用标准样品，定值结果均为检出海狸鼠源性成分，即该标准样品的特性值为海狸鼠源性成分阳性，适用于肉及肉制品中海狸鼠源性成分检测标准方法的证实、非标方法确认、检测全程的质量保证、试剂验收和质量控制、人员考核，实验室海狸鼠源性成分定性检测能力的评价、实验室间比对等。
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