随着超重者数量的迅速增加，肥胖已成为全球范围内的首要公共卫生问题之一[1]。众所周知，饮食习惯、遗传和精神压力等诸多因素都可能导致肥胖，其中高脂饮食（high-fat diet， HFD）在肥胖的发生中起主要作用。肥胖的特征是异常或过多的脂肪堆积，是代谢综合征的中心环节，它与多种慢性疾病有关，如非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）、2 型糖尿病、慢性低度炎症、免疫调节能力下降、心血管疾病和癌症[2]。这些疾病通常伴有脂质代谢、葡萄糖代谢和肠道微生物的紊乱，以及氧化应激和内质网应激现象[3]。当健康饮食和定期体育锻炼无法平衡能量的摄入和消耗时，一些抗肥胖药物通常被用来治疗肥胖及其并发症。奥利司他作为常见的抗肥胖药物之一，是一种非中心性胰脂肪酶抑制剂，但具有明显的慢性副作用[4]。因此，迫切需要具有生物活性的天然产物成为抗肥胖药物的替代品。近年来，越来越多的研究表明，一些天然分子（如多肽、壳聚糖、多酚、生物碱和皂苷）可以通过调节肠-肝轴和各种细胞信号通路来干预肥胖[5-6]。
罗非鱼（Oreochromis mossambicus）是一种丰富的生物资源，也是微量营养素和生物活性化合物的良好来源[7]。Sierra 等[8]通过酶水解法从红罗非鱼鳞片中制得抗氧化肽，其中分子量为3～10 kDa 的组分表现出最高的活性。固定在蛋白质中的多肽原本无活性，但通过蛋白酶的体外酶解制备，可以获得具有生物活性的小分子量肽段[9]。Zhao 等[10]利用红虾头制得了一种低分子量肽，该红虾肽对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠具备免疫增强作用，同时可显著提高脾脏组织核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中相关蛋白的表达水平。此外，有大量研究发现，多肽作为生物活性物质具有干预多种疾病的潜力，如螺旋藻[11]、金枪鱼[12]、贻贝[13]、黄颡鱼[14]衍生的生物活性肽具有降血脂活性、抗氧化活性、抗炎活性和抗肥胖作用。
前期的研究表明，罗非鱼皮胶原蛋白肽（tilapia skin collagen peptides，TSCPs）具有较好的体外抗氧化能力，因此本研究考察TSCPs 对HFD 诱导的小鼠血脂代谢紊乱以及肝脏氧化应激的缓解，通过对肝脏、肠道切片的观察和肠道通透性检测进一步研究肝脏与肠道之间的联系，探讨肠-肝的相互作用从而发现多肽的体内抗肥胖活性的潜在机制，以期为天然活性肽在减轻或预防肥胖的功能性食品中的应用及提高罗非鱼资源的生物利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗非鱼皮（干制）：市售；复合蛋白酶（200 U/mg）：合肥博美生物科技有限责任公司；5 周龄雄性C57BL/6J 小鼠[16～18 g，许可证号：SCXK（浙）2020-0002）]：北京维通利华实验动物技术有限公司；普通饲料（D12450J）、高脂饲料（D12492）：无锡帆泊生物技术有限公司；奥利司他：上海源叶生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、超 氧化物歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）、脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）检测试剂盒：武汉华美生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
Multiskan FC 酶标仪、902 型-80 ℃超低温冰箱：美国赛默飞世尔科技有限公司；D3024R 高速冷冻离心机：大龙兴创实验仪器有限公司；CKX41 倒置显微镜：日本OLYMPUS 公司。
1.3 方法
1.3.1 罗非鱼皮胶原蛋白肽的制备
将罗非鱼皮用水冲洗，切成小块后放置在0.8 mmol/L 氢氧化钠溶液中，在25 ℃下浸泡2 h 后水洗至pH 值为中性。罗非鱼皮添加无菌水后，在95 ℃继续浸泡2 h，过滤后在5 000×g 条件下离心20 min 并收集胶原蛋白。用复合蛋白酶在pH8.0、50 ℃条件下酶解罗非鱼皮胶原蛋白6 h，酶添加量为4%。酶解产物在沸水中加热15 min 使酶失活，然后在4 ℃下10 000×g离心10 min，收集上清液。最后将上清液浓缩并冷冻干燥，得到罗非鱼皮胶原蛋白肽粉末。
1.3.2 动物实验
将40 只C57BL/6J 雄性小鼠置于（23±2） ℃ 、湿度（55±5）%、光/暗（12 h/12 h） 循环的SPF 动物房内， 实行分笼饲养，每笼5 只，自由饮水、进食。适应性饲养1 周后，随机选取10 只设为正常组（记为ND 组），喂普通饲料，其余30 只设为高脂饲料组，喂高脂饲料，期间每2 d 测定一次空腹体质量，连续喂养7 周后平均体质量超过ND 组平均体质量1.2 倍即判定肥胖模型造模成功。将建模成功的肥胖小鼠随机分为3 组（均用普通饲料喂养）：模型组（记为MOD 组）、阳性药物组（每日按体质量灌胃30 mg/kg 奥利司他，记为PC 组）、胶原蛋白肽组（每日按体质量灌胃800 mg/kg 的TSCPs，记为TSCPs 组），每组10 只，继续喂养4 周。小鼠可以自由饮食，每2 d 记录一次小鼠灌胃前的体质量至实验结束。所有动物实验操作均通过浙江海洋大学动物实验伦理审查委员会的批准。
1.3.3 血清生化指标的测定
小鼠经摘眼球取血，血浆静置2 h 后在4 ℃下4 000 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书进行TC、TG、HDL-C、LDL-C 和DAO 含量的测定。
1.3.4 肝组织中抗氧化指标以及炎症因子含量的测定
取小鼠肝组织并研磨，按照1∶9 （g/mL）加入生理盐水匀浆后，在4 ℃、4 000 r/min 离心15 min，取上清液。参考相应试剂盒测定肝组织匀浆中MDA、LPS 含量及SOD、GSH-Px、CAT 活力。
1.3.5 组织病理学分析
将附睾脂肪组织固定在脂肪专用固定液中，将肝组织固定在4% 多聚甲醛溶液中，而后对组织进行脱水、包埋并切片，对切片进行苏木精-伊红（hematoxylineosin， HE）染色和油红O 染色。将回肠和结肠组织分为两份：一份在4% 多聚甲醛中固定，进行HE 染色；另一份在卡诺氏固定液中固定，进行阿尔辛蓝过碘酸雪夫（Alcian blue and periodic acid Schiff，AB-PAS）染色。采用光学显微镜观察并拍照。
1.4 数据处理与分析
用Excel 2019、SPSS 25 和Origin 2019 软件对各组数据进行计算与绘图。除特殊说明外，实验均平行3 次进行，结果均以平均值±标准差的形式表示，采用单因素方差分析确定平均值，使用邓肯检验确定不同条件之间的显著差异（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 TSCPs 对小鼠体质量、脏器质量和脂肪组织质量的影响
各组小鼠体质量、脏器质量和脂肪组织质量的变化见表1 与表2。
表1 给药4 周后小鼠体质量
Table 1 Body weight of mice after 4 weeks of intervention
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
组别ND 组MOD 组PC 组TSCPs 组建模后体质量/g 26.60±0.99b 32.18±2.08a 32.05±2.06a 32.03±2.84a实验结束体质量/g 27.15±1.25b 29.89±1.11a 28.35±2.00b 27.58±1.74b
表2 小鼠脏器及脂肪组织质量
Table 2 Weight of mice organs and adipose tissue g
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
组别ND 组MOD 组PC 组TSCPs 组肝脏1.40±0.09a 1.39±0.09a 1.38±0.16a 1.35±0.11a肾脏0.32±0.02a 0.34±0.02a 0.33±0.03a 0.33±0.03a脾脏0.07±0.02a 0.07±0.01a 0.07±0.01a 0.05±0.02a附睾脂肪0.65±0.12b 1.12±0.34a 0.77±0.13b 0.73±0.18b肾周脂肪0.16±0.06b 0.31±0.10a 0.20±0.03b 0.16±0.07b
由表1 可知，经过7 周的HFD 诱导，ND 组小鼠的平均体质量显著低于其他组（P＜0.05）。改为普通饲料喂养4 周后，肥胖小鼠的平均体质量有所下降，但在实验结束时，MOD 组小鼠的平均体质量显著高于其他组（P＜0.05），PC 组、TSCPs 组与ND 组之间无显著差异，可能是因为TSCPs 和阳性药物的干预降低小鼠的食物利用率导致了小鼠体质量的变化。由表2 可知，MOD 组小鼠的脏器质量与ND 组相比无显著性差异，可能是由于在实验结束时MOD 组小鼠的体质量较轻，无法从脏器质量的角度准确测出MOD 组小鼠的肝脏、肾脏和脾脏与其他组的显著性差异。然而，MOD 组小鼠的附睾脂肪、肾周脂肪质量显著高于其他组（P＜0.05），说明TSCPs 和阳性药物有可能阻碍脂肪的形成。
2.2 TSCPs 对小鼠血清生化指标与脂肪组织形态的影响
TSCPs 对小鼠血清生化指标与脂肪组织形态的影响见图1 和图2。
图1 TSCPs 对小鼠血清中TG、TC、LDL-C 和 HDL-C 水平的影响
Fig.1 Effects of TSCPs on serum levels of TG， TC， LDL-C and HDL-C in mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
图2 小鼠附睾脂肪组织的HE 染色
Fig.2 HE staining of epididymis adipose tissue in mice
由图1 可知，与ND 组相比，MOD 组小鼠血清的TC、TG 和LDL-C 含量显著升高（P＜0.05），HDL-C 含量显著降低（P＜0.05）。与MOD 组相比，TSCPs 可以显著改善TG、TC、LDL-C 和HDL -C 含量（P＜0.05）。对于TG 和LDL-C 含量，TSCPs 组与PC 组之间无显著性差异。在TC 含量的检测中，PC 组与MOD 组之间无显著性差异。如图2 所示，与MOD 组相比，阳性药物与TSCPs 治疗明显减小了附睾组织脂肪细胞大小。研究结果表明，TSCPs 的干预能恢复HFD 诱导的小鼠血清脂代谢水平，并减轻脂肪的积累。
2.3 TSCPs 对小鼠肝脏结构与氧化应激水平的影响
TSCPs 对小鼠肝脏结构与氧化应激水平的影响见图3 和图4。
图3 小鼠肝组织的油红O 染色与HE 染色
Fig.3 Oil red O staining and HE staining of liver tissue
图4 TSCPs 对小鼠肝脏中MDA、GSH-Px、CAT 和SOD 水平的影响
Fig.4 Effects of TSCPs on liver levels of MDA， GSH-Px， CAT and SOD in mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，在各组小鼠的肝脏油红O 染色中，MOD 组的脂滴远多于ND 组，而PC 组和TSCPs 组明显减轻了脂滴的积累，表明TSCPs 有效地抑制了小鼠肝脏中脂质的形成，可以在一定程度上改善HFD 喂养小鼠的肝脏脂肪变性。在肝脏HE 染色结果中，ND 组的肝细胞形状规则，排列整齐且紧密，无明显的脂肪变性。MOD 组的肝脏结构紊乱，有明显的不同大小的弥漫性脂肪泡和疏松的细胞质。在TSCPs 组和PC 组中，肝脏的脂肪泡数量明显减少，肝组织结构几乎恢复到正常状态。上述实验结果表明，HFD 诱导了肝脏的脂肪变性、脂滴积聚和细胞破裂，而TSCPs 可显著改善HFD 诱导的肝脏脂质积聚，促使肝脏更加快速地向健康状态转变。
由图4 可知，与ND 组相比，MOD 组小鼠肝脏中MDA 的含量显著增加（P＜0.05），而GSH-Px、CAT 和SOD 的活力显著降低（P＜0.05）。与MOD 组相比，阳性药物与TSCPs 显著提高了GSH-Px、CAT 和SOD 的活力并显著减少了MDA 的含量（P＜0.05）。研究结果表明，TSCPs 可以改善肥胖小鼠肝组织的抗氧化能力。
2.4 TSCPs 对小鼠肠道屏障的影响
回肠是小肠的最后一部分，其HE 染色和AB-PAS染色结果如图5 所示。
图5 小鼠回肠的HE 染色与AB-PAS 染色
Fig.5 HE staining and AB-PAS staining of ileum in mice
由图5 可知，ND 组的肠道形态正常，与ND 组相比，MOD 组的回肠隐窝深度较浅，肠组织绒毛缩短且变得不完整。阳性药物与TSCPs 治疗后，肠道绒毛的长度明显增加，同时杯状细胞的数量有所增加，肠道组织的病理损伤明显减轻。这些结果表明，HFD 可破坏小鼠的回肠绒毛结构并影响杯状细胞，而TSCPs 可以改善HFD 诱导的小鼠肠道损伤。结肠染色结果如图6 所示。
图6 小鼠结肠的HE 染色与AB-PAS 染色
Fig.6 HE staining and AB-PAS staining of colon in mice
由图6 可知，ND 组的结肠U 型隐窝结构完整，可见大量杯状细胞。MOD 组的隐窝结构发生改变，出现隐窝分支现象，部分黏膜层被破坏，杯状细胞的数量减少，部分区域有炎性异常浸润。阳性药物和TSCPs 保护了隐窝的完整性，明显恢复了杯状细胞的数量，从而会促进黏蛋白的分泌与黏膜屏障的形成。TSCPs 对小鼠血清中DAO 含量与肝脏中LPS 含量的影响见图7。
图7 TSCPs 对小鼠血清中DAO 含量与肝脏中LPS 含量的影响
Fig.7 Effects of TSCPs on DAO levels in serum and LPS levels in liver of mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
小鼠体内的DAO 水平与LPS 含量可以用来评价肠道的通透性，由图7 可知，与ND 组相比，MOD 组小鼠血清中的DAO 含量显著升高（P＜0.05）。与MOD 组相比，TSCPs 可以显著降低DAO 含量（P＜0.05）。此外，与ND 组相比，MOD 组小鼠肝脏组织中的LPS 含量显著增加（P＜0.05），说明HFD 导致的肠道通透性增加可能会使肠道有害菌产生的内毒素在肝脏中积累，从而引发炎症反应与氧化应激反应，而TSCPs 可以显著降低肝脏中的LPS 含量（P＜0.05）。实验结果表明，TSCPs 可以缓解HFD 导致的小鼠肠道通透性的增加并减少肝脏中的LPS。
3 讨论与结论
体质量和脂肪组织质量是反映小鼠肥胖程度以及给药干预效果的最重要的表观指标之一，本研究通过HFD 诱导7 周，成功建立小鼠肥胖模型。在给药干预4 周后，MOD 组小鼠表现为体质量下降幅度小，体质量、附睾脂肪组织质量和肾周脂肪组织质量显著高于ND 组。与MOD 组相比，TSCPs 能减少肥胖小鼠的体质量，TSCPs 组小鼠的实验结束体质量与ND 组趋于一致，表明TSCPs 对减肥降脂具有一定的促进效果。
长期的HFD 会导致肥胖，而肥胖通常伴随着机体的脂质代谢障碍和肝脏氧化应激，从而形成轻度NAFLD[15]。因此，改善血脂紊乱现象和缓解肝脏氧化应激可能是预防肥胖或NAFLD 的潜在策略。本研究结果显示，TSCPs 和阳性药物的干预抑制了附睾脂肪组织中脂肪细胞的增大，并缓解了肝脏的脂肪变性。同时，TSCPs 改善了TC、TG 的过度堆积，并调节了LDL-C 和HDL-C 的含量，从而使小鼠的脂质代谢接近正常。此外，基于活性氧过度产生导致的氧化应激与NAFLD 的发展密切相关[16]，而TSCPs 可以提高小鼠肝脏中SOD、CAT 和GSH-Px 的活力，并减少MDA 的产生。因此，TSCPs 可以增强内源性抗氧化系统，抵抗活性氧的侵袭，减轻脂肪堆积和氧化应激反应。
已有研究发现，HFD 与肠道黏膜屏障的破坏有关，这可能是由于HFD 引起的肠道微生物群落组成被改变[17-18]。结肠中的微生物密度最高、黏液层最厚，黏液主要由杯状细胞分泌，黏液层作为化学屏障可以将肠腔中的细菌与肠上皮细胞分隔开来，完整的肠道屏障也有助于营养物质的吸收[19-21]。然而，微生态失调会导致肠道屏障功能障碍，从而使部分有害菌产生的毒素通过门静脉进入肝脏引发氧化应激与炎症反应[22]。因此，肠道与肝脏之间的相互作用部分依赖于微生物群，有益菌的减少或有害菌的增加，会使肠道产生过氧化炎症因子和脂质抑制因子，这些因子和其他微生物产物可能会直接抑制脂质的氧化代谢，并对免疫耐受和异生代谢有影响[23-24]。DAO 和LPS 是评价肠道屏障损伤的常用指标，其中，血清中DAO 含量的增加表明肠道通透性增加，意味着肠道细菌产生的LPS更容易穿过黏膜屏障进入体内循环，从而流向肝脏[25]。肝脏长期暴露于氧化应激和高水平的LPS 可能会激活与TLR4/NF-κB 通路相关的炎症反应，这可能是肠道与NAFLD 之间的联系[26-27]。本实验通过对小鼠血清 DAO 含量和肝脏LPS 含量的检测发现，HFD 诱导会使小鼠肠道的通透性增加，从而增加了肝脏中的炎症因子含量。此外，对肠道组织染色并观察后发现，HFD 会破坏正常的肠道结构，而给予TSCPs 后显著逆转了肠道通透性的改变并增加了回肠肠道绒毛长度与结肠杯状细胞的数量。这些结果证实了TSCPs 对HFD 引起的肠道损伤具有一定的疗效。
综上所述，TSCPs 能够增强机体的抗氧化能力，减轻HFD 引起的肝脏氧化应激，并缓解HFD 诱导的脂肪积累与肠道屏障损伤。因此，TSCPs 在抗肥胖以及相关代谢综合征方面起着重要的作用，同时说明了生物活性肽在预防或治疗肥胖方面具有良好的前景。
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