多糖是指由10 个以上的单糖组成的具有一定生物活性的天然高分子聚合物，结构复杂而庞大，其来源分为高等光合植物、真菌、藻类、细菌等[1]。多糖作为真菌最重要的组成成分之一，毒性小，且普遍具有潜在免疫和抗癌功能，可作为辅助药物用于肿瘤化疗治疗，在临床治疗中发挥重要作用，如香菇多糖能够辅助化疗方案治疗晚期结肠癌，有效改善化疗所致的免疫功能损伤，减少不良反应且安全性较高[2]；黑木耳多糖与化疗药物环磷酰胺联合治疗时，其对肿瘤细胞的抑制作用明显增加[3]。
不同真菌多糖的生物学活性不同，真菌多糖的免疫活性及抗肿瘤活性可以更加显著、广谱，因此寻找这种良好活性多糖已成为研究热点。例如郑恒光等[4]研究发现杏鲍菇菇头多糖能够抑制人胃癌细胞（MGC-803）的生长，其抑制率呈浓度依赖性增长。Xue 等[5]研究发现桑黄多糖以剂量依赖性的形式抑制肝癌细胞（HepG2）的增殖。Luo 等[6]研究发现云芝多糖能够体外抑制小鼠乳腺癌细胞（4T1）迁移和侵袭，但不抑制小鼠乳腺癌细胞（4T1）增殖。Li 等[7]研究发现紫丁香蘑能够抑制黑色素瘤细胞（A375）的增殖并诱导其凋亡。Zhang 等[8]发现羊肚菌多糖可显著促进巨噬细胞（RAW264.7）的增殖、吞噬作用和NO 的产生。陈茜等[9]发现灰褐纹口蘑多糖具有较强的体外免疫活性，能够显著地促进淋巴细胞（T、B）及巨噬细胞（RAW264.7）增殖。王晶等[10]发现一定浓度的鳞柄小奥德蘑多糖可增强巨噬细胞（RAW264.7）的免疫功能。
真姬菇是生长在北纬30°～60°的一种大型木质腐生真菌，外形美观且味道具有海蟹味，又称其为蟹味菇、海鲜菇、斑玉蕈，属于担子菌门、伞菌纲、白蘑科、玉蕈属。多糖是真姬菇子实体中重要的生物活性成分之一，已有部分研究初步鉴定真姬菇多糖的结构及其生物活性。野外采集真姬菇的数量少、难度大，而提取菌多糖需要足量的菌种，人工栽培菌种具有产量大、来源稳定的优势，是作为试验材料的普遍选择，如Song等[11]以天津市人工栽培的真姬菇菌株作为试验材料，鉴定其多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖以含量比例1.145∶5.282∶1.157 组成，通过凝胶过滤法测定多糖平均分子量为1.92×106 Da。聂莹等[12]以北京市人工栽培的真姬菇菌株作为试验材料，鉴定其多糖的结构特性以及探究其抗氧化活性，发现真姬菇多糖的单糖组分包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸，并具有较好的还原能力、Fe2+螯合能力、清除超氧离子自由基（O2-·）和羟自由基（·OH）能力。Oliveira 等[13]以巴西地区人工栽培的真姬菇菌株作为试验材料，提取出分子量为1.71×104 Da 的真姬菇多糖，由岩藻糖、甘露糖及半乳糖按含量比1.00∶1.08∶3.17 组成，其中多糖主链为α-（1→6）-D-Galp，支链为β-D-Manp 和α-L-Fucp。目前，四川省人工栽培的真姬菇多糖的结构及体外抗肿瘤活性鲜见报道。本研究以真姬菇为研究对象，对其子实体进行内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列鉴定，经热水浸提法分离纯化后得到真姬菇多糖（HM-P），利用凝胶渗透色谱、傅里叶变换红外光谱和高效液相色谱等技术对HM-P 的结构进行初步解析。以肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180）为对象，采用CCK-8 法及细胞划痕法，对HM-P的体外抗肿瘤活性进行研究，以期为真姬菇多糖资源的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
真姬菇子实体：西充县星河生物科技有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物：成都生工生物工程股份有限公司；植物基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒：天根生物科技（北京）有限公司；DEAE-52 纤维素：南京生兴生物技术有限公司；溴化钾（分析纯）、三氟乙酸（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Thermo 公司；巨噬细胞（RAW264.7）、肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180）：中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美国Sigma 公司；甘露聚糖肽（mannatide，MAN）：四川奥邦药业有限公司；CCK-8 试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PCR 仪（Thermal Cycler2720）、化学凝胶成像系统（ChemiDoc XRS+）：美国Bio-Rad 公司；电泳仪（DYY- 6C）：北京六一有限公司；高效液相色谱仪（HPLC1260）：美国Agilent 公司；二氧化碳细胞培养箱（BPN-80CH UV）、傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet 5700）：美国Thermo公司；酶标仪（318MC）：上海三科仪器有限公司；倒置显微镜（DMI3000）：徕卡显微系统（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 真菌的ITS 鉴定
依据DNA 提取试剂盒说明书进行总DNA 提取并检测其浓度。
rDNA ITS 扩增引物：ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC3'-）、ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3'-）。扩增体系（30 μL）：1 μL 的ITS4，1 μL 的ITS5，1 μL DNA 模板，12 μL 双蒸水，15 μL Q5 酶。扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，共40 个循环，4 ℃保温。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
切取500～750 bp 之间有明显亮度的ITS 扩增条带，依据凝胶回收试剂盒说明书回收纯化，回收产物送至成都生工生物工程股份有限公司进行上下游引物双向测序。将测序结果上传至GenBank 并申请登录号，利用MEGA7.0 软件采用邻接（neighbor-joining，N-J）法构建系统发育进化树。
1.3.2 HM-P 的提取与纯化
采用热水浸提法提取HM-P。以蒸馏水、NaCl 溶液（0.05、0.10 mol/L）为流动相，使用DEAE-52 纤维素柱进一步层析纯化真姬菇多糖，每段收集50 管洗脱液，每管5 mL。取每管70 μL 洗脱液于96 孔板中，采用硫酸-苯酚法[14]测定490 nm 处的吸光值并在Origin软件上绘制洗脱曲线图。透析、冷冻干燥得多糖组分，并将蒸馏水段多糖命名为HM-P。
1.3.3 HM-P 的分子量测定
称取10 mg 的HM-P 溶解于纯水中，过滤后采用凝胶渗透色谱法检测HM-P 的重均分子量（weight average molecular weight，MW）、峰位分子量（peak molecular weight，Mp）、数均分子量（number average molecular weight，Mn），并计算分散性指数（polymer dispersity index，PDI）。
1.3.4 HM-P 的傅里叶变换红外光谱测定
称取2 mg 的HM-P 与200 mg 溴化钾混合，经过研磨、压片并使用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～400 cm-1 波数范围内扫描。
1.3.5 HM-P 的高效液相色谱测定
称取10 mg 的HM-P 与5 mL 2 mol/L 三氟乙酸溶液混匀密封，100 ℃水浴水解6 h，12 000 r/min 离心5 min并弃去沉淀，烘干样品后加入纯水洗涤，重复3 次以除去残留的三氟乙酸。将HM-P 水解液和单糖标准品分别加入75%乙腈溶剂，配制成质量浓度为5 μg/mL 的待测样品。
高效液相色谱条件：示差折光检测器温度为35 ℃；Zorbax Carbohydrate 色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；25 ℃柱温；75% 乙腈为流动相；上样量为10 μL；流速为1.4 mL/min。
1.3.6 HM-P 的体外抗肿瘤活性检测
1.3.6.1 肿瘤细胞的抑制率测定
根据CCK-8 试剂盒说明书检测HM-P 对肿瘤细胞的抑制率。体外抑制试验分为空白对照组（CK）、HM-P 药物组（5、10、15、20、25、30 μg/mL）、阳性对照组（MAN），每组设置6 个重复。
1）铺板：取处于对数生长期的肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180），将细胞浓度分别调至1×105 个/mL，接种于96 孔培养板，每孔100 μL，置于细胞培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养24 h，待细胞完全贴壁且状态良好后进行肿瘤细胞抑制效用检测。
2）加药：空白对照组加入100 μL 的细胞培养液，药物组分别加入100 μL 终浓度为5、10、15、20、25、30 μg/mL 的HM-P 溶液，阳性对照组加入100 μL 浓度为10 μg/mL 的MAN 溶液，继续培养24 h。
3）检测：每孔分别加入5 μL CCK-8 试剂，放入细胞培养箱中培养3 h，在酶标仪450 nm 波长下检测其OD 值。按以下式子计算细胞抑制率（p，%）。
式中：A0 为细胞培养基的平均OD 值；A1 为空白对照组的平均OD 值；A2 为HM-P 药物组或阳性对照组的OD 值。
1.3.6.2 肿瘤细胞的迁移率测定
采用细胞划痕法检测HM-P 对肿瘤细胞迁移的抑制作用。细胞迁移试验分为空白对照组（CK）、HM-P药物组（10、15、20、25 μg/mL）、阳性对照组（MAN）。
1）铺板：在6 孔板底面画5 条平行线，肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）及胃癌细胞（MFC）的铺板操作同1.3.6.1，接种量改为每孔1 mL。使用10 μL 枪头制造与标记线垂直的划痕，并用1 mL 磷酸缓冲盐溶液洗3 次，充分洗去悬浮细胞，在显微镜下观察并对细胞形态进行拍照记录，记为0 h。
2）加药：加药操作同1.3.6.1，加药量改为1 mL，药物组改为终浓度10、15、20、25 μg/mL 的HM-P 溶液，并放入细胞培养箱中培养，每隔6 h 用倒置显微镜观察划痕并拍照记录。
3）检测：结果使用Image J 软件进行数据分析，根据倒置显微镜记录的图像，统计划痕面积的平均值。按以下公式计算迁移率（m，%）。
式中：A1 为0 h 的划痕面积；A2 为培养后的划痕面积。
1.3.6.3 肿瘤细胞的杀伤率测定
参照CCK-8 试剂盒说明书检测HM-P 对肿瘤细胞的杀伤率。体外杀伤试验分为空白对照组（CK）、HM-P 药物组（5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL ）、阳性对照组（LPS），每组设置6 个重复。
1）铺板：巨噬细胞（RAW264.7）、肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180）的铺板操作同1.3.6.1。
2）加药：取巨噬细胞（RAW264.7）板，加药操作同1.3.6.1，药物组终浓度改为5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL 的HM-P 溶液，阳性对照组改为10 μg/mL 的LPS 溶液。将巨噬细胞（RAW264.7）板的上清液按照对应组依次加入肿瘤细胞板，继续培养24 h。
3）检测：检测操作同1.3.6.1。按以下式子计算杀伤率（k，%）。
式中：A0 为细胞培养基的平均OD 值；A1 为空白对照组的平均OD 值；A2 为药物组或阳性对照组的OD 值。
1.4 数据处理
采用SPSS 19.0 软件对数据进行单因素方差分析，数据用平均值±标准差表示，所有组间数据的比较均采用t 检验。采用GraphPad Prism 8.0 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 进化树的建立
真菌菌株的rDNA-ITS 序列的N-J 系统发育树见图1。
图1 真菌菌株的rDNA-ITS 序列的N-J 系统发育树
Fig.1 N-J phylogenetic tree of rDNA-ITS sequences from fungal strains
利用ITS4、ITS5 引物对本样品菌株DNA 进行扩增、测序，测序结果上传至GenBank 申请rDNA-ITS 的序列登录号，获得真菌样品登录号为OK599036.1。由图1 可知，N-J 系统发育树结果显示目标序列与俄罗斯的真姬菇菌株（MW036174.1）同源性达到了98.07%，置信度达到97%（图1），表明本试验菌株为真姬菇（Hypsizygus marmoreus）。
2.2 HM-P 的洗脱曲线
HM-P 的洗脱曲线见图2。
图2 HM-P 的洗脱曲线
Fig.2 Elution curve of HM-P
采用蒸馏水（0～50 管）、0.05 mol/L NaCl 溶液（51～100 管）作为流动相时分别出现了一个较高的单一对称峰、一个较低的峰，0.1 mol/L NaCl 溶液（101～150 管）作为流动相时无洗脱峰。由图2 可知，蒸馏水段的洗脱液中多糖含量最高，收集所有蒸馏水段的洗脱液，经过浓缩、透析、真空冷冻干燥后得到固体样品命名为HM-P。
2.3 HM-P 的分子质量
HM-P 的凝胶渗透色谱结果见图3。
图3 HM-P 的凝胶渗透色谱
Fig.3 Gel permeation chromatography of HM-P
由图3 可知，HM-P 在13～14 min 呈现单一洗脱峰且对称性较好，其Mw 为25 232 Da，Mp 为21 960 Da，Mn 为16 352 Da，PDI 为1.54，分子量分布宽度大于1。分子量过高的多糖不仅溶解度较低，并且很难进入体内直接发挥活性[15]。过低的分子量则无法形成活性聚合结构从而导致活性差[16]。一般认为分子量的范畴在10 000～50 000 Da 能够保持最大生物活性[17]，HM-P 的分子量为25 232 Da，满足这一范畴。
2.4 HM-P 的傅里叶变换红外光谱
HM-P 的傅里叶变换红外光谱结果见图4。
图4 HM-P 的红外光谱图
Fig.4 Infrared spectrum of HM-P
由图4 可知，3 432.10 cm-1 处出现了一个强且宽的吸收峰，为HM-P 的—OH 伸缩振动峰[18]；在2 923.53 cm-1 处是糖环上次甲基C—H 的伸缩振动峰[19]；在1 633.21 cm-1 处归属为HM-P 的C
O 非对称伸缩振动峰[20]；在1 406.67 cm-1 处为C—H 面内弯曲振动峰；1 078.96 cm-1 处的吸收峰指定为HM-P 的吡喃糖环上C—O—C 的伸缩振动峰[21]；673.50 cm-1 处归属为
C—H 面外弯曲振动峰；在1 740 cm-1 处无明显吸收峰，表明HM-P 无糖醛酸。以上信号峰显示HM-P是一种含有吡喃糖结构的多糖。
2.5 HM-P 的高效液相色谱
HM-P 的高效液相色谱结果见表1 和图5。
表1 HM-P 的单糖组成分析
Table 1 Monosaccharide composition analysis of HM-P
注：- 表示未检测出的单糖种类。
单糖种类木糖葡萄糖半乳糖果糖岩藻糖鼠李糖甘露糖标准品保留时间/min 5.431 6.228 7.664 6.517 5.738 4.881 6.734水解单糖保留时间/min 5.300 6.267 7.147峰面积占比/%9.933 17.661 72.406- - - -- - - -
图5 HM-P 的高效液相色谱图
Fig.5 High performance liquid chromatography results of HM-P
由表1 和图5 可知，单糖标准品木糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、岩藻糖、鼠李糖、甘露糖的出峰时间分别为5.431、6.228、7.664、6.517、5.738、4.881、6.734 min，HM-P水解后单糖的出峰时间分别为5.300、6.267、7.147 min，与7 种单糖标准品的出峰时间对比，5.300、6.267、7.147 min 处分别对应为木糖、葡萄糖、半乳糖。各水解单糖的峰面积显示HM-P 中木糖、葡萄糖及半乳糖含量比例为9.933∶17.661∶72.406。
2.6 HM-P 的体外抗肿瘤活性
2.6.1 HM-P 对肺癌细胞（A549）的抑制作用
HM-P 对肺癌细胞（A549）的抑制作用见图6。
图6 HM-P 对肺癌细胞（A549）活性的抑制作用
Fig.6 Anti-tumor activity inhibition of HM-P on lung cancer cells（A549）
A.HM-P 体外刺激后肺癌细胞A450 nm 与抑制率；B.HM-P 体外刺激后肺癌细胞（A450 nm）迁移率；C.HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液处理后肺癌细胞A450 nm 与杀伤率。与空白对照组（CK）比，*表示组间差异显著（P＜0.05），**表示组间差异极显著（P＜0.01）。
部分多糖具有直接的抑制肿瘤作用，如直接破坏肿瘤细胞结构，诱导细胞凋亡[22]。由图6A、6B 可知，与空白对照组（CK）相比，HM-P 能够极显著地直接抑制贴壁型肺癌细胞增殖、迁移（P＜0.01），HM-P 终浓度为20 μg/mL 时，其抑制率达到27.1%；HM-P 终浓度为15 μg/mL 时，其迁移率为25.8%。间接杀伤肿瘤细胞包括通过使用不同浓度的药物激活巨噬细胞释放细胞因子，间接实现其抗肿瘤功能[23]。由图6C 可知，HM-P能够极显著地通过巨噬细胞（RAW264.7）间接杀伤肺癌细胞（P＜0.01），杀伤效果呈现先增加后减少的趋势，HM-P 终浓度为20 μg/mL 时，杀伤率高达42.6%，与直接抑制率相比，杀伤率提高了57.2%。
2.6.2 HM-P 对结肠癌细胞（CT26.WT）的抑制作用
HM-P 对结肠癌细胞（CT26.WT）的抑制作用见图7。
图7 HM-P 对结肠癌细胞（CT26.WT）活性的抑制作用
Fig.7 Anti-tumor activity inhibition of HM-P on colon cancer cells （CT26.WT）
A.HM-P 体外刺激后结肠癌细胞A450 nm 与抑制率；B.HM-P 体外刺激后结肠癌细胞（A450 nm）迁移率；C.HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液处理后结肠癌细胞A450 nm 与杀伤率。与空白对照组（CK）比，*表示组间差异显著（P＜0.05），**表示组间差异极显著（P＜0.01）。
由图7A、7B 可知，在直接抑制肿瘤方面，HM-P 能够显著抑制贴壁型结肠癌细胞（CT26.WT）增殖（P＜0.05）及迁移（P＜0.05），当HM-P 终浓度为15 μg/mL时，其抑制率高达18.2%；当HM-P 终浓度为20 μg/mL时，其迁移率为25.0%。由图7C 可知，在间接杀伤方面，当HM-P 终浓度为30 μg/mL 时，对结肠癌细胞（CT26.WT）的杀伤率高达到28.9%（P＜0.01），与直接抑制率相比，杀伤率高了58.8%。
2.6.3 HM-P 对成纤维细胞（L929）的抑制作用
HM-P 对成纤维细胞（L929）的抑制作用见图8。
图8 HM-P 对成纤维细胞（L929）活性的抑制作用
Fig.8 Anti-tumor activity inhibition of HM-P on fibroblast（L929）
A.HM-P 体外刺激后成纤维细胞A450 nm 与抑制率；B.HM-P 体外刺激后成纤维细胞（A450 nm）迁移率；C.HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液处理后成纤维细胞A450 nm 与杀伤率。与空白对照组（CK）比，*表示组间差异显著（P＜0.05），**表示组间差异极显著（P＜0.01）。
由图8A、8B 可知，与空白对照组（CK）相比，HM-P能够直接抑制贴壁型成纤维细胞（L929）增殖（P＜0.01）、迁移（P＜0.01），当HM-P 终浓度为10 μg/mL 时，其抑制率达到19.6%，迁移率为29.1%。由图8C 可知，药物终浓度为30 μg/mL 时，HM-P 通过介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液间接杀伤成纤维细胞（L929）的杀伤率达到最佳，为27.3%（P＜0.01），杀伤率比直接抑制率高出39.3%，其杀伤效果优于直接抑制作用。
2.6.4 HM-P 对胃癌细胞（MFC）的抑制作用
HM-P 对胃癌细胞（MFC）的抑制作用见图9。
图9 HM-P 对胃癌细胞（MFC）活性的抑制作用
Fig.9 Anti-tumor activity inhibition of HM-P on mouse forestomach carcinoma （MFC）
A.HM-P 体外刺激后胃癌细胞A450 nm 与抑制率；B.HM-P 体外刺激后胃癌细胞（A450 nm）迁移率；C.HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液处理后胃癌细胞A450 nm 与杀伤率。与空白对照组（CK）比，*表示组间差异显著（P＜0.05），**表示组间差异极显著（P＜0.01）。
由图9A、9B 可知，与空白对照组（CK）相比，HM-P终浓度为20 μg/mL 时，能够极显著地抑制贴壁型胃癌细胞（MFC）的增殖（P＜0.01）和迁移（P＜0.01），其抑制率达到27.9%，迁移率达到19.0%。由图9C 可知，HMP 终浓度为25 μg/mL 时，能够极显著地杀伤胃癌细胞（MFC）（P＜0.01），杀伤率达到42.0%。HM-P 在抑制胃癌细胞（MFC）增殖、迁移以及间接杀伤胃癌细胞（MFC）方面，其抑制作用随着药物浓度的增加，均呈现出先增加后减少的趋势，杀伤率比直接抑制率高出50.5%，且其杀伤效果优于直接抑制作用。
2.6.5 HM-P 对腹水癌细胞（S180）的抑制作用
HM-P 对腹水癌细胞（S180）的抑制作用见图10。
图10 HM-P 对腹水癌细胞（S180）活性的抑制作用
Fig.10 Anti-tumor activity inhibition of HM-P on ascites cancer cells （S180）
A.HM-P 体外刺激后腹水癌细胞A450 nm 与抑制率；B.HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液处理后腹水癌细胞A450 nm 与杀伤率。与空白对照组（CK）比，*表示组间差异显著（P＜0.05），**表示组间差异极显著（P＜0.01）。
由图10A、10B 可知，腹水癌细胞（S180）属于悬浮型肿瘤细胞。与空白对照组（CK）相比，HM-P 能够直接抑制腹水癌细胞（S180）增殖（P＜0.01），抑制率呈现剂量依赖性减少，HM-P 终浓度为5 μg/mL 时，其抑制率达到18.1%；HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液间接杀伤腹水癌细胞（S180），其杀伤率在5～30 μg/mL药物浓度范围内呈现剂量依赖性增加，当HM-P 终浓度为30 μg/mL 时，杀伤率高达26.1%（P＜0.01），杀伤率比直接抑制率高出44.2%，其杀伤效果优于直接抑制作用。
3 讨论与结论
真姬菇作为一种珍稀食用菌品种，其多糖具有生物活性及无明显毒副作用的特点，是开发抗癌药物的潜在候选药物。有研究发现多糖在体外试验中能够直接抑制肿瘤细胞增殖，如李艺萌[24]发现青头菌多糖在低剂量和高剂量时，对肺癌细胞（A549）的增殖均表现出较好的抑制效果，在药物浓度达到1 200 μg/mL 时，抑制率达到52.96%。唐贤等[25]发现黑牛肝菌多糖在浓度为15 μg/mL 时，对结肠癌细胞（CT26.WT）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180）的抑制率分别为32.68%、30.68%及38.90%。本试验结果显示，HM-P 能够直接抑制肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180）的增殖（P＜0.05），抑制率为18.1%～27.9%。直接抑制肿瘤作用除了表现在抑制肿瘤细胞增殖方面，还表现在抑制肿瘤细胞迁移侵袭方面。目前，细胞划痕法是评估肿瘤细胞迁移能力的主要方法，如包晓玮等[26]通过细胞划痕法检测出沙棘多糖呈剂量依赖性地抑制肝癌细胞（HepG2）迁移，且当药物浓度为500 μg/mL 时，肝癌细胞（HepG2）的迁移率仅为5.59%。万茜淋等[27]采用细胞划痕法检测出香菇多糖能够显著抑制神经胶质瘤细胞（SHG-44）迁移，并呈剂量依赖关系，迁移率为（-10.55±7.78）%。本文采用细胞划痕法检测出HM-P能够显著抑制肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）及胃癌细胞（MFC）迁移（P＜0.05），迁移率为19.0%～29.1%。
有研究表明多糖不仅能够直接抑制肿瘤细胞增殖、迁移，还能够活化巨噬细胞，诱导巨噬细胞分泌免疫因子，在杀伤肿瘤细胞过程中起到间接作用，如刘蓝月[28]发现金针菇多糖通过介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液处理肺癌细胞（A549），在药物浓度为100 μg/mL的条件下，肺癌细胞（A549）活力最低，多糖的抑制效果最佳。赵姝雯等[29]发现与3 种金针菇多糖直接作用于成纤维细胞（L929）相比，3 种金针菇多糖介导的巨噬细胞（RAW264.7）上清液对成纤维细胞（L929）的杀伤作用更显著，其抑瘤率分别增强了27.35%、20.79%、77.07%。本研究发现HM-P 介导巨噬细胞（RAW264.7）上清液对肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（CT26.WT）、成纤维细胞（L929）、胃癌细胞（MFC）及腹水癌细胞（S180）具有极显著的杀伤效果（P＜0.01），与HM-P 对肿瘤细胞的直接抑制作用相比，HM-P 的杀伤效果远超出39.3%～58.8%，起到更好杀伤肿瘤细胞的作用。
综上所述，本研究通过ITS 鉴定西充星河生物科技有限公司人工培育的菌株为真姬菇。HM-P 的分子量为25 232 Da，由木糖、葡萄糖及半乳糖按含量比例9.933∶17.661∶72.406 组成。体外抗肿瘤活性研究显示，HM-P 对5 种肿瘤细胞均有直接抑制作用，但是效果一般，对其展开HM-P 间接杀伤肿瘤细胞研究，发现杀伤作用的抑瘤效果显著提高，且HM-P 对贴壁型肿瘤细胞的抑制、杀伤效果均高于悬浮型肿瘤细胞。本试验中，HM-P 对胃癌细胞（MFC）的直接抑制效果最佳，当HM-P 终浓度为20 μg/mL 时，其抑制率高达27.9%（P＜0.01），迁移率低至19.0%（P＜0.01）；HM-P 对肺癌细胞（A549）的间接杀伤效果最好，当HM-P 终浓度为20 μg/mL 时，其杀伤率高达42.6%（P＜0.01）。本研究表明HM-P 有望作为一种高效、低毒的抗肿瘤制剂，为真姬菇多糖的开发与应用提供了一定的科学依据。
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