食用菌是一种健康食品，富含蛋白质、氨基酸、维生素、多糖和膳食纤维，是人体必需营养素的丰富来源。此外，还富含酚类化合物、甾醇、生物碱、萜类化合物、凝聚素等多种生物活性物质，对癌症、心脑血管疾病、传染病、高血压、高血脂和糖尿病具有预防作用[1-3]，日益受到消费者的青睐。在人类慢性疾病高发和饮食营养问题突出的情况下，食用菌的营养和药用价值研究受到国内外学者的关注，进一步研究功能性成分的提取技术以及开发食用菌的精深加工食品、保健品和药品迫在眉睫，人们期待食用菌能进一步促进人类健康福祉。
干巴菌（Thelephora ganbajun）又名绣球菌、对花菌、马牙菌等，是担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、革 菌 目（Thelephorales）、革 菌 科（Thelephoraceae）、革菌属（Thelephora）野生食用菌[4]。该菌主要产地在云南省，此外在四川省南部、贵州省西部、福建省三明地区等局部地区也有少量分布，至今无法人工栽培[5]。干巴菌是一种具有浓郁鲜香味且营养价值极高的食用菌，含蛋白质、多种氨基酸、维生素、矿物元素、多糖等大量营养物质，对人体的健康有益[4]。据报道，在我国49 种食用菌中，干巴菌具有较强的抗氧化能力，是一种潜在的天然抗氧化剂来源[6]。优化干巴菌的提取工艺是挖掘其发挥抗氧化活性物质的重要手段，不仅有利于提高有效成分的提取效率，还能进一步指导干巴菌的精深加工。Xu 等[7]进一步优化干巴菌的提取工艺，发现超声辅助提取技术有助于从干巴菌乙醇水提取物中提取抗氧化剂，且干巴菌提取物对人癌细胞表现出抗增殖活性，这归因于其所含的酚类化合物，例如原儿茶酸、对羟基苯甲酸、芦丁、2-羟基肉桂酸和表儿茶素。已有研究证明，在干巴菌活性成分中，多糖含量较高，发现其具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤等作用[8-11]。赵红艳等[8]采用热水法提取干巴菌多糖，在提取温度为70 ℃、提取时间为2.5 h、料液比为1∶15（g/mL）条件下，多糖提取率达到10.08%。陆文娟等[12]研究发现干巴菌经超声细胞破碎处理后再热水浸提，可使多糖充分地溶出。干巴菌的功能活性成分及其功效正逐渐被深入研究，然而，尚需进一步挖掘有效的干巴菌活性物质提取方法。因此，本文以干巴菌为研究对象，采用6 种不同极性溶剂对其进行提取，探索不同溶剂提取物中活性成分含量、抗氧化性及对α-葡萄糖苷酶抑制活性的差异，以期为干巴菌资源的精深加工和产品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干巴菌：市售，产于云南昆明；没食子酸（纯度≥98%）、福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-three pyridyl three triazine， TPTZ）、麦角甾醇、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG）：美国Sigma 公司；乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚（均为分析纯）、乙腈、甲醇（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（UltiMateTM 3000）、酶标仪（Multiskan FC）：美国Thermo Fisher 公司；高速离心机（HC-3018）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；超声波清洗机（CQ-250A-DST）：上海恒跃医疗器械有限公司；万能粉碎机（SF-130）：上海超亿制药机械设备有限公司；鼓风干燥箱（DHG-9075A）：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 干巴菌预处理
将干巴菌置于60 ℃鼓风干燥箱中干燥，粉碎机粉碎后过40 目筛，得到的干巴菌粉在-20 ℃下保存、备用。
1.3.2 制备干巴菌提取物
准确称取10 g 干巴菌粉6 份，按料液比1∶10 （g/mL）分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和石油醚，超声波辅助（功率100 W）处理2 h，4 000 r/min 离心10 min，分别收集上清液和残渣。重复提取残渣2 次，合并上清液后进行减压浓缩，甲醇溶解后定容至25 mL，放于4 ℃备用。
1.3.3 总酚含量的测定
干巴菌提取物中总酚含量的测定采用福林酚比色法[13]。干巴菌提取物中总酚含量按式（1）计算。
式中：W 为总酚含量，mg/g；ρ 为多酚质量浓度，mg/mL；V 为待测液体积，mL；N 为稀释倍数；m 为干巴菌粉的质量，g。
1.3.4 多酚的组成成分及含量测定
参照葛鑫会等[14]的方法并稍作修改，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪对干巴菌提取物中酚类化合物组成进行分析。色谱柱：Thermo Dionex Acclaim 120 C18 柱（150 mm×3 mm，3 μm），流动相A：0.2% 甲酸水，流动相B：乙腈/甲醇（4∶1，体积比），梯度洗脱程序：0～2 min，10%～20% B；2～7 min，20%～30% B；7～9 min，30%～60% B；9～14 min，60% B；14～16 min，60%～10% B；16～18 min，10% B。流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测波长280 nm。干巴菌提取物过0.22 μm 有机滤膜，进样量10 μL。
1.3.5 麦角甾醇含量的测定
采用HPLC 法测定干巴菌提取物中麦角甾醇含量[15]。将提取物过0.22 μm 有机滤膜后上样检测。色谱柱为Inertsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇和水，梯度洗脱程序：0～10 min，30% 甲醇～80% 甲醇；10～30 min，80% 甲醇～100% 甲醇。流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长283 nm。干巴菌提取物中麦角甾醇含量按式（2）计算。
式中：M 为麦角甾醇含量，μg/g；c 为麦角甾醇质量浓度，μg/mL；V 为待测液体积，mL；N 为稀释倍数；m为干巴菌粉的质量，g。
1.3.6 抗氧化性测定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除能力测定
干巴菌提取物对DPPH 自由基清除能力的测定参照Yan 等[13]的方法，取0.5 mL 样品溶液与2.5 mL 的60 μmol/L DPPH 溶液均匀混合，暗室反应30 min，于波长517 nm 处测吸光度。DPPH 自由基清除率按式（3）计算。
式中：X 为DPPH 自由基清除能力，%；A0 为甲醇与DPPH 溶液混合液的吸光度；A1 为样品与DPPH 溶液混合液的吸光度。
1.3.6.2 ABTS+自由基清除能力测定
干巴菌提取物对ABTS+自由基清除能力的测定参照颜征等[16]的方法，7 mmol/L ABTS 储备液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液按1∶1（体积比）混合制备ABTS 溶液。取0.1 mL 样品溶液与3.8 mL ABTS 溶液均匀混合，暗室反应6 min，于波长734 nm 处测吸光度。ABTS+自由基清除率按式（4）计算。
式中：Y 为ABTS+自由基清除能力，%；A2 为甲醇与ABTS 溶液混合液的吸光度；A3 为样品与ABTS 溶液混合液的吸光度。
1.3.6.3 铁还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定
干巴菌提取物FRAP 的测定参照张山佳等[17]的方法并稍作修改，0.3 mol/L 醋酸盐溶液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3 溶液三者按10∶1∶1（体积比）混合制备FRAP 工作液。向0.1 mL 提取物中加入3.1 mL 蒸馏水和1.8 mL FRAP 工作液，在37 ℃条件下孵育30 min，于波长593 nm 处测吸光度。FRAP 表示为μmol Fe2+/g 干重（dry weight，DW）。FRAP 值越大表示抗氧化能力越强。
1.3.7 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
干巴菌提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定参照Yan 等[13]的方法，向80 μL 样品溶液中加入20 μL的0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃下温育5 min。随后，加入100 μL 的4 mmol/L PNPG 溶液，37 ℃下反应30 min，最后加入100 μL 的4 mmol/L Na2CO3 终止反应，于波长405 nm 处测吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（5）计算。
式中：Z 为α-葡萄糖苷酶抑制率，%；Ac 为磷酸盐缓冲液、α-葡萄糖苷酶溶液、PNPG 混合液的吸光度；A0为磷酸盐缓冲液与PNPG 混合液的吸光度；As 为样品、α-葡萄糖苷酶溶液、PNPG 混合液的吸光度；Ab 为样品、磷酸盐缓冲液、PNPG 混合液的吸光度。
1.4 数据处理
试验均重复3 次，用平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，以Duncan 检验确定各处理组之间的显著性差异，P＜0.05 时差异具有统计学意义，使用Origin 2018 软件进行图表的绘制。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂对总酚含量的影响
采用福林酚比色法对干巴菌提取物中多酚含量进行检测，结果见图1。
图1 不同提取溶剂对干巴菌提取物中总酚含量的影响
Fig.1 Effect of extraction solvents on the content of total phenols in extracts from Thelephora ganbajun
不同小写字母表示组间差异显著，P＜0.05。
由图1 可知，不同溶剂对干巴菌提取物中总酚含量具有显著性影响，各溶剂提取的干巴菌中总酚含量由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚。乙醇作为提取溶剂时，干巴菌提取物中总酚含量最高，为（14.95±0.58） mg/g，而石油醚作为提取溶剂时，总酚含量最低。赵玉红等[18]采用不同溶剂提取刺蔷薇叶总酚，结果与本研究结果一致，即乙醇提取物中总酚含量最高。说明多酚类物质是一种极性化合物，在极性有机溶剂中有较高的溶解性[19]，但由于多酚组成较复杂，也使得酚类化合物在不同极性溶剂中溶解性存在较大差异。因此，在提取多酚时应选择合适的提取溶剂。
2.2 提取溶剂对多酚类物质组成的影响
酚酸和黄酮类物质作为药食用真菌中多酚的关键成分，具有重要的生物活性功能。参考相关研究对野生食用菌酚类物质组成的分析[14]，选取7 种多酚成分（绿原酸、表儿茶素、对羟基苯甲酸、槲皮素、肉桂酸、山奈酚和水杨酸）作为分析干巴菌多酚组成的研究对象。7 种多酚类物质标准品的HPLC 色谱图见图2。
图2 7 种酚类化合物标准品的HPLC 色谱图
Fig.2 HPLC of 7 polyphenol components standards
1. 绿原酸；2. 表儿茶素；3. 对羟基苯甲酸；4. 槲皮素；5. 肉桂酸；6. 山奈酚；7. 水杨酸。
由图2 可知，通过HPLC 分析，得到了7 种酚类化合物出峰的保留时间和峰面积，且峰型良好，出峰位置无干扰峰，这有助于进一步利用HPLC 对干巴菌不同溶剂提取物中多酚类物质进行定量分析。
干巴菌不同溶剂提取物中多酚组成及7 种多酚类物质的定量分析见表1。
表1 干巴菌不同溶剂提取物中多酚组成和含量
Table 1 Polyphenol components and content of extracts from different solvents of Thelephora ganbajun
注：- 表示未检测到该物质；同列不同小写字母表示组间差异显著（P＜0.05）。
提取溶剂水乙醇丙酮乙酸乙酯氯仿石油醚多酚类物质含量/（μg/g）绿原酸-60.50±2.64a 13.89±0.19b 14.88±0.26b 16.16±0.37b 14.02±0.23b表儿茶素-554.53±22.17a肉桂酸----3.03±0.15b-对羟基苯甲酸0.06±0.01d 97.25±3.74a 13.72±0.22b 14.39±0.25b 8.22±0.17c 14.78±0.30b槲皮素95.82±2.48d 105.12±2.68d 532.38±27.92a 548.32±30.15a 386.60±12.33b 236.08±9.71c 5.59±0.08b 9.84±0.21a 9.74±0.22a 2.54±0.07c山奈酚614.64±34.19a 68.99±1.41e 63.20±0.36e 110.55±3.15d 382.45±18.10b 217.19±6.72c水杨酸47.79±2.27c-335.90±15.01a 42.31±3.42c 189.70±8.44b 313.51±12.98a
由表1 可知，在选定的7 种多酚类物质标样中，干巴菌不同溶剂提取物中多酚类物质的种类和含量存在差异。氯仿提取物中含有7 种多酚类成分，丙酮、乙酸乙酯和石油醚提取物中均含有绿原酸、对羟基苯甲酸、槲皮素、肉桂酸、山奈酚和水杨酸6 种多酚类物质，乙醇提取物中含有绿原酸、表儿茶素、对羟基苯甲酸、槲皮素和山奈酚5 种多酚类物质，而水提取物中含有对羟基苯甲酸、槲皮素、山奈酚和水杨酸这4 种多酚类物质。乙醇作为提取溶剂时，对绿原酸、表儿茶素和对羟基苯甲酸3 种酚类物质的提取效果优于其他溶剂，而乙酸乙酯对槲皮素和肉桂酸的提取效果优于其他溶剂。山奈酚在水提取物中含量最高，水杨酸在丙酮提取物和石油醚提取物中的含量显著高于其他4 种溶剂提取物。
2.3 提取溶剂对麦角甾醇含量的影响
采用HPLC 法对麦角甾醇标准品进行检测，结果见图3。
图3 麦角甾醇标准品的色谱图
Fig.3 HPLC of ergosterol standards
由图3 可知，麦角甾醇色谱峰的保留时间为17.15 min，呈现单一对称的尖峰，说明该HPLC 法能够检测提取物中的麦角甾醇含量。
干巴菌不同溶剂提取物中麦角甾醇含量测定结果见图4。
图4 不同提取溶剂对干巴菌提取物中麦角甾醇含量的影响
Fig.4 Effect of extraction solvents on the content of ergosterol in extracts from Thelephora ganbajun
不同小写字母表示组间差异显著，P＜0.05。
由图4 可知，不同溶剂对干巴菌中麦角甾醇含量具有明显影响，乙酸乙酯为提取溶剂时麦角甾醇含量最高，为（1.33±0.13） mg/g，其次为乙醇提取物、丙酮提取物、氯仿提取物，石油醚提取物较低，水提取物中没有检出。这与麦角甾醇易溶于有机溶剂而不溶于水的特性相符。栗铭鸿等[20]在研究鸡枞菌不同极性溶剂（蒸馏水、甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇和石油醚）提取物中麦角甾醇含量时，发现甲醇提取物含量最高，为0.21 mg/g。俞明君等[15]测定了8 种食用菌中麦角甾醇含量，由高到低依次为香菇（‘伏牛山嫂’）、香菇（‘西峡9608’）、杏鲍菇、猴头菇、金针菇、银耳、平菇、黑木耳。本研究结果干巴菌乙酸乙酯提取物和乙醇提取物中麦角甾醇含量仅低于香菇（最高可达2.13 mg/g），但高于杏鲍菇、猴头菇、金针菇、银耳、平菇、黑木耳和鸡枞菌7 种食用菌[15，20]，这为深入开发利用干巴菌中的麦角甾醇提供了理论依据。
2.4 提取溶剂对干巴菌的抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响
提取溶剂对干巴菌的抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响见表2。
表2 干巴菌不同溶剂提取物的抗氧化性及其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
Table 2 Antioxidant activity and inhibitory effect on the activity of α-glucosidase of extracts from different solvents of Thelephora ganbajun
注：- 表示未检测到；同列不同小写字母表示组间差异显著（P＜0.05）。
DPPH 自由基IC50/（μg/mL）44.96±1.80a 10.10±0.93d 15.79±0.40c 19.68±0.80b ABTS+自由基IC50/（μg/mL）92.94±1.23a 66.50±0.63d 74.40±1.03c 80.20±1.40b FRAP/（μmol Fe2+/g DW）29.83±1.42c 155.54±9.80a 124.71±5.64b 121.38±6.71b α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50/（μg/mL）128.88±2.65a 1.62±0.11c 1.14±0.08c 2.48±0.11c提取溶剂水乙醇丙酮乙酸乙酯氯仿石油醚14.12±1.39c-79.11±0.82b-29.14±0.99c 0.97±0.05d 21.48±1.80b-
通过DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力和FRAP 抗氧化能力3 个指标来比较干巴菌不同溶剂提取物的抗氧化性。由表2 可知，不同溶剂对干巴菌DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率的影响差异较大。除石油醚外，干巴菌不同溶剂提取物对DPPH 自由基的清除能力由高到低的顺序为乙醇＞氯仿＞丙酮＞乙酸乙酯＞水，对ABTS+自由基的清除能力由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞氯仿＞乙酸乙酯＞水。其中，乙醇提取物对DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力最强，乙酸乙酯和水提取物最弱。从表1 可知，与其他提取物相比，乙醇提取物中表儿茶素的含量最高。Park 等[21]研究了蓝桉叶含有多种与抗氧化作用有关的酚类物质，其中表儿茶素是其50%乙醇提取物表现出强抗氧化能力的特定酚类化合物，Xiang 等[22]也证实表儿茶素是多齿山茶花70% 甲醇提取物中含量最高的酚类化合物，并在抗氧化活性中起着重要作用，因此，猜测干巴菌乙醇提取物具有较高的抗氧化活性可能与表儿茶素有关。此外，不同溶剂提取物对DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力不同还有可能是受到提取物中的麦角甾醇等其他成分的影响。干巴菌FRAP 受提取溶剂的影响，存在较大的差异。干巴菌不同溶剂提取物的FRAP 由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚。这个顺序与总酚含量的顺序基本一致。综合以上结果可以看出，干巴菌乙醇提取物的抗氧化性最好，表现为DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除能力最强，FRAP 值最高。
α-葡萄糖苷酶是催化多糖水解成单糖（如葡萄糖）的关键酶，抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以减缓小肠对葡萄糖的吸收，抑制餐后血糖升高，预防糖尿病的发生[23-24]。由表2 可知，乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力最强，IC50 值分别为（1.62±0.11）、（1.14±0.08）、（2.48±0.11） μg/mL；其次是氯仿提取物，水提取物的抑制能力较差，石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的活性无抑制作用。Kaewnarin 等[25]研究表明4 种野生食用菌甲醇提取物均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，酚类化合物可能是其抑制活性的主要来源。Shamim 等[26]研究表明食用菌（侧耳属、灵芝等）中的萜类化合物可防止单糖分子的形成并促进肝脏和肌肉中糖原的形成，具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。本研究观察到的α-葡萄糖苷酶抑制作用可能归因于干巴菌提取物中所含的酚类化合物和麦角甾醇等物质。
2.5 相关性分析
利用SPSS 双变量相关性分析，通过Pearson 相关系数计算得到干巴菌不同溶剂提取物的各项指标之间的相关性，结果见图5。
图5 干巴菌提取物各项指标的相关性分析
Fig.5 Correlation analysis of various indexes of extracts from Thelephora ganbajun
*表示显著相关（P＜0.05）；**表示极显著相关（P＜0.01）。
由图5 可知，干巴菌提取物中DPPH 自由基清除率与山奈酚、麦角甾醇含量及ABTS+自由基清除率呈显著相关；FRAP 与总酚含量和山奈酚呈显著相关；α-葡萄糖苷酶抑制活性与山奈酚及ABTS+自由基清除率呈显著相关，与麦角甾醇含量和DPPH 自由基清除率呈极显著相关；山奈酚与麦角甾醇含量、抗氧化性、α-葡萄糖苷酶抑制活性呈显著相关；绿原酸、表儿茶素及对羟基苯甲酸三者之间呈极显著相关。因此，干巴菌提取物中所含的酚类化合物、麦角甾醇等成分协同作用使得其具有抗氧化性及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
3 结论
通过探究6 种不同溶剂对干巴菌中总酚、麦角甾醇和多酚类物质组成及含量的影响，得出乙醇提取物中总酚含量最高，乙酸乙酯和乙醇提取物中麦角甾醇含量高于其他溶剂提取物，不同溶剂对干巴菌多酚类物质的组成及含量影响差异显著。这可能与提取溶剂的种类、干巴菌的化学组成和物理特性有关。抗氧化研究结果表明，乙醇提取物具有较强的铁还原能力以及DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力。对α-葡萄糖苷酶抑制效果中，乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物比其他溶剂提取物抑制能力强。综上，干巴菌乙醇提取物表现出显著的体外抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。相关性分析表明，酚类化合物、麦角甾醇是干巴菌提取物发挥抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制能力的重要活性物质，未来可通过细胞或者动物模型深入系统的研究干巴菌发挥抗氧化性和潜在降血糖能力的具体活性成分及作用机制。
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