胡椒(Piper nigrum L.)是一种多年生木本芳香植物,主要在越南、印度尼西亚等地种植[1],我国胡椒广泛种植在海南、广西、广东等地。代佳慧等[2]发现采收时间对胡椒的产量与品质都有很大影响,一般来说,胡椒产品原料的选择会根据加工产品选择适合的成熟阶段,主要的加工产品有黑胡椒、白胡椒和青胡椒3 种。
胡椒作为消费最广泛的香料,富含多种必需的营养素,果实在发育和成熟过程中涉及一系列复杂的生理和结构上的变化。胡椒鲜果含有丰富的功能活性物质,其中胡椒精油作为一种挥发性香气物质,具有良好的抗氧化和抗菌活性,可作为天然抗氧化剂和抗菌剂[3]。此外,多酚是植物中一种重要的次生代谢产物,其含量与植物本身的种类和生长环境等多种因素有关[4],已有研究表明酚类化合物具有多种生物活性并以游离、酯化、糖苷和结合的4 种形式存在于植物中[5],但胡椒在成熟过程中多酚组成和含量变化相关研究鲜见。
因此,本研究以胡椒鲜果为原料,探究成熟度对物理特性(果实大小、果皮厚度、种子大小、硬度、脆度)和化学特性(淀粉、蛋白质、维生素C、总糖、叶绿素、总酚、总黄酮、胡椒精油含量)的影响,并且通过气相色谱串联质谱技术定性及定量分析精油香气成分,以期为提高胡椒产品品质和胡椒加工原料最佳成熟度的选择提供理论参考。
胡椒鲜果:采摘于中国热带农业科学院香料饮料研究所,采摘时间分别为开花后210、240、270 d,采后立即置于-80 ℃预冻,随后真空冷冻干燥2 d,去除水分后将果实粉碎过80 目筛,待测。
无水乙醇、硫酸、乙酸乙酯、草酸、无水硫酸钠(均为分析级):四川西陇科学股份有限公司;环己酮标准品(纯度>99.90%):上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1290 高效液相色谱仪:美国安捷伦科技有限公司;NDA701 杜马斯定氮仪:意大利VELP 公司;TA.XT Plus 质构仪:英国Stable Micro Systems 公司;JDG-0.2真空冷冻干燥机:兰州科进真空冻干技术有限公司;SCION TQ 串联气质联用仪:英国布鲁克公司;SynergyH1 酶标检测仪:美国Bio-tek 公司;ZNHW-500 mL电热套:上海一凯仪器设备有限公司;SK5200HP 超声仪:上海科导超声仪器有限公司;5804R 台式高速冷冻离心机:德国艾本德股份公司;RV10 旋转蒸发仪:德国IKA 公司。
1.3.1 胡椒外观尺寸的测定
果实大小、种子大小和果皮厚度通过游标卡尺进行测量,每个试验重复20 次。
1.3.2 胡椒质构的表征
参考杨博文等[6]的方法对胡椒硬度和脆度进行测定,质构仪参数:探头采用杆式探头(SMSP/2,直径2 mm),压缩模式为单次压缩,测试中速度0.5 mm/s,测试后速度2 mm/s,目标模式为形变,形变率为100%。样品测试前用超纯水清洗,擦干后进行测定,共重复20 次。
1.3.3 淀粉含量的测定
淀粉含量参考GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》中的酸水解法[7]进行测定。
1.3.4 蛋白质含量的测定
称取3 g 冻干胡椒粉,使用杜马斯定氮仪测定蛋白质含量。
1.3.5 维生素C 含量的测定
参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》中的方法[8]测定VC 含量并稍作修改。称取2 g 冻干胡椒粉后加入10 mL 2% 草酸溶液进行提取,此过程重复3 次,合并提取液后用染料进行滴定。
1.3.6 叶绿素含量的测定
叶绿素含量参照吴悦菊等[9]的方法进行测定。称取0.5 g 冻干胡椒粉,用30 mL 丙酮水溶液(8∶2,体积比)在避光条件下超声辅助提取1 h。将提取液过滤并定容至100 mL 棕色容量瓶中,测定波长663 nm 与645 nm 下的吸光值,并通过下列公式计算叶绿素含量。
式中:Ya 为叶绿素a 含量,mg/g 干基(dry weight,DW);Yb为叶绿素b 含量,mg/g DW;Y 为总叶绿素含量,mg/g DW;A645 为波长645 nm 下的吸光值;A663 为波长663 nm 下的吸光值;V 为提取液总体积,mL;W 为样品质量,g。
1.3.7 单糖和总糖含量的测定
总糖含量通过廉伟伟等[10]的苯酚-硫酸法进行测定并稍作修改。准确称取5 g 冻干胡椒粉,加入25 mL蒸馏水,煮沸30 min。提取液在5 000 r/min 下离心15 min,收集上清液,取2 mL 上清液和0.5 mL 蒽酮溶液混合,随后加入5 mL 浓硫酸,在沸水中反应10 min,冷却后在620 nm 处测定吸光值。标准曲线测定:制备不同浓度的葡萄糖标准品(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)按上述步骤进行反应,测得在620 nm 处吸光值,绘制标准曲线,根据葡萄糖标准曲线对总糖定量,结果表示为mg/g DW。葡萄糖和果糖采用离子交换色谱测得并通过标准曲线进行定量。
1.3.8 水分含量和胡椒精油得率的测定
鲜果水分含量采用恒重法进行测定[11]。
精油得率参照GB/T 17527—2009《胡椒精油含量的测定》[12]进行测定,并作简单修改。准确称取40 g胡椒鲜果并添加100 mL 超纯水在组织研磨机中均质,随后加入300 mL 超纯水置于1 000 mL 圆底烧瓶中,蒸馏4 h 得到精油。待仪器冷却至室温后,用挥发油测定器读取精油的体积,得到的精油用无水硫酸钠脱水,4 ℃储存待用,精油提取得率(J,mL/100 g)按下列公式进行计算。
式中:V 为精油的体积,mL;m 为鲜果质量,g;H 为鲜果的水分含量,%。
1.3.9 气相色谱串联质谱(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)鉴定精油成分
胡椒精油成分通过串联气质联用系统进行分析,程序参考李鑫等[13]的方法,并稍作修改。取25 μL 胡椒精油,加入50 μL 环己酮标准品作为内标物,用正己烷定容至5 mL,过0.45 μm 有机相滤膜,待上机检测。
气相色谱条件:色谱柱为DB-5Ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、载气为氦气、进样量为1 μL、流速1 mL/min、进样口温度为250 ℃、不分流进样。柱温箱升温程序:起始温度40 ℃,保持1 min;以1 ℃/min 的速度升至67 ℃并保持1 min;以5 ℃/min 升至101 ℃并保持1 min;以10 ℃/min 升至230 ℃并保持2 min,最后以20 ℃/min 升至250 ℃并保持3 min。
1.3.9.1 质谱条件
离子源温度230 ℃、接口温度280 ℃、能量70 eV、质量扫描范围m/z 35~450、溶剂延迟3 min。正构烷烃采用相同的程序检测,且Tz< Tx<Tz+1。保留温度和保留时间具有高度的相关性,故用保留时间代替保留温度来计算保留指数。保留指数(R)计算公式如下。
式中:z 和z+1 分别为目标化合物流出前后正构烷烃碳原子的数目;Tx、Tz、Tz+1 分别为样品组分、碳数为Z和Z+1 正构烷烃的保留温度。
1.3.9.2 定性定量
通过NIST14 标准谱库检索和保留指数鉴定化合物,选择相似度大于750 的结果作为选择依据,根据下列公式计算胡椒精油成分质量浓度。
式中:ρi 为待测成分的质量浓度,mg/mL;ρ0 为内标物的质量浓度,mg/mL;Ai 为待测成分的峰面积;A0 为内标物峰面积;V1 为加入胡椒精油体积,μL;V0 为内标物体积,μL。
1.3.10 活性物质的提取
参考Zhang 等[14]的方法并稍作修改用于活性物质的提取。准确称取20 g 冻干胡椒粉,加入200 mL 70%甲醇乙醇溶液25 ℃超声1 h,过滤后用旋转蒸发仪去除滤液中的溶剂,得到粗多酚水溶液。用6 mol/L 盐酸将粗多酚水溶液pH 值调至2,随后加入等体积的乙酸乙酯,充分振荡后得到有机层和水层,有机相为游离组分。剩余水相在室温和氮气通过的条件下加入等体积4 mol/L 氢氧化钠(10 mmol/L 乙二胺四乙酸,1% 抗坏血酸)处理4 h 进行碱水解,然后用6 mol/L 盐酸将水溶液pH 值调至2,加入等体积的乙酸乙酯,振荡后分层,有机相为酯化组分。剩余水相用6 mol/L 盐酸在85 ℃条件下处理30 min 进行酸水解,冷却后用4 mol/L氢氧化钠调节pH 值至2,加入等体积的乙酸乙酯,振荡后分层,有机相为糖苷组分。剩余滤渣在室温和氮气通过的条件下用4 mol/L 氢氧化钠碱水解4 h,随后用6 mol/L 盐酸调节pH 值至2,8 000 r/min 离心15 min,收集上清液,随后加入等体积的乙酸乙酯,振荡后分层,有机相为不溶性-结合组分。上述过程均重复5 次,合并有机相,将有机相浓缩至黏稠、低流动性的状态,随后用无水乙醇将各组分定容至25 mL 棕色容量瓶中。
1.3.11 总酚含量的测定
总酚含量参考Mokhtar 等[15]的方法并稍作修改。分别吸取1 mL 各组分提取物加入25 mL 棕色容量瓶中,加入1 mL 1 mol/L 福林酚试剂,摇匀,随后加入4 mL 7%碳酸钠溶液,摇匀后将终体积定容至25 mL,在室温下避光反应2 h,在750 nm 处测定吸光值,按上述步骤制备没食子酸标准曲线。各组分提取物总酚的含量表示为每克冻干胡椒粉中含有的没食子酸当量毫克数(mg GAE/g DW)。
1.3.12 总黄酮含量的测定
总黄酮含量的测定参考Hossain 等[16]的比色法。分别吸取0.5 mL 各组分提取物加入试管中,随后分别加入1 mL 蒸馏水和1 mL 15%亚硝酸钠,混匀反应6 min,加入0.5 mL 10% 氯化铝溶液,反应5 min 后加入1 mL 4%氢氧化钠溶液,最后定容至25 mL,按上述步骤制备槲皮素标准曲线。各组分提取物总黄酮的含量表示为每克冻干胡椒粉中含有的槲皮素当量毫克数(mg QE/g DW)。
所有试验均重复3 次,使用SPSS 26.0 统计软件对试验数据进行方差分析,结果表示为平均值±标准差;采用邓肯检验进行显著性分析,p<0.05 表示存在显著性差异,使用Prism 9 软件进行绘图。
不同成熟阶段胡椒鲜果剖面图如图1 所示,通过游标卡尺对鲜果尺寸进行测量,并且使用质构仪对鲜果硬度和脆度进行分析,结果如表1 所示。
表1 不同成熟阶段胡椒果实形状变化及质构分析
Table 1 Shape changes and textural analysis of pepper berries at different stages of maturity
注:同列不同字母表示差异显著,p<0.05。
成熟度脆度/g 硬度/g成熟中期(MM)成熟后期(LM)完全成熟(FM)果实大小/mm 4.50±0.15c 5.90±0.11b 6.25±0.09a种子大小/mm 3.63±0.20b 4.47±0.11a 4.54±0.07a果皮厚度/mm 0.87±0.06c 1.43±0.04b 1.70±0.03a 1 012.53±88.69c 2 226.96±339.27b 3 238.21±130.59a 2 261.89±64.07c 2 721.25±222.38b 4 045.50±165.90a
图1 3 个生长阶段浆果的剖面和外观特征
Fig.1 Profiles and appearance characteristics of berries at three growing stages
a.剖面;b.外观特征。A.开花后210 d,定义为果实在成熟中期(middle-maturity, MM);B.开花后240 d,定义为果实在成熟后期(late-maturity, LM);C.开花后270 d,定义为果实完全成熟(fullymaturity, FM)。
由图1 和表1 可知,果实大小、种子大小和果皮厚度与成熟度呈现明显的正相关,其中果实大小在4.50~6.25 mm 间变化并且平均大小为5.55 mm,略高于前期研究结果[17]。另外,果皮厚度变化显著,这是因为浆果在生长的过程中,为在完全成熟之前更好地抵御外界伤害,果皮会急剧增厚。结果表明,随果实的逐渐成熟,浆果的硬度和脆度显著增加,并且在完全成熟时具有最高的硬度和脆度。大多数果实在成熟后期,由于细胞壁水解酶的作用,维持果皮硬度的纤维素和果胶被分解,最终导致果实软化,脆度增加[18]。同时在胡椒的生长发育过程中,由于淀粉大量积累,并且伴随种子大小的增加,导致果实硬度的增加。
淀粉是浆果的重要组成物质,其含量的变化与浆果的品种、成熟度和加工方法密切相关。胡椒3 个成熟阶段淀粉含量变化如图2 所示。
图2 不同成熟阶段果实淀粉含量
Fig.2 Starch content of pepper berries at different stages of maturity
不同字母表示差异显著,p<0.05。
由图2 可知,淀粉含量随浆果成熟度的增加而增加,在完全成熟阶段达到最大值(43.86%)。根据成熟度的不同,胡椒主要加工产品分别为青胡椒、黑胡椒和白胡椒,Rathnawathie 等[19]研究发现黑胡椒的淀粉含量为13.2%~51.9%,由于品种和成熟度的差异,青胡椒淀粉含量为13.8%~49.3%,白胡椒淀粉含量为50.6%~60.7%,白胡椒淀粉含量较高与其高成熟度有关,本研究中完全成熟阶段的淀粉含量略低于文献值,可能是由于品种的不同。
与大多数其他种类的水果相比,胡椒浆果中的维生素C 含量较低。维生素C 和蛋白质含量如图3 所示。
图3 不同成熟阶段果实维生素C 和蛋白质含量
Fig.3 Vitamin C and protein contents of pepper berries at different stages of maturity
由图3 可知,胡椒3 个成熟阶段维生素C 含量为4.02~7.42 mg/100 g DW,且在LM 阶段达到最大值,随成熟度的增加含量降低至5.21 mg/100 g DW,在对马铃薯的研究中也发现了相同的趋势[20]。在成熟前期,蛋白质的含量随果实成熟度的增加而增加,在LM 阶段含量最高,其值为15.75%,在完全成熟时含量略有下降,其值为15.02%。化学成分间的Pearson 相关性如图4 所示。
图4 化学成分间的Pearson 相关性
Fig.4 Pearson correlation between chemical components
*表示指标含量变化相关性显著,p<0.05。
由图4 可知,表明各理化性质间存在复杂的相关性,其中,蛋白质含量与维生素C 含量呈显著正相关,这一现象与猕猴桃成熟过程的研究结果相似[21]。
叶绿素降解主要发生在成熟阶段,并产生黄色或红色类胡萝卜素,其中叶绿素酶在发生降解前具有最高活性[21]。Win 等[22]研究发现橙子的过氧化物酶活性在全黄期迅速增加,这表明过氧化物酶可能在后期叶绿素降解的过程中发挥主要作用。不同成熟阶段胡椒果实叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量如图5 所示。
图5 不同成熟阶段果实叶绿素含量
Fig.5 Chlorophyll content of pepper berries at different stages of maturity
同一指标不同字母表示差异显著,p<0.05。
由图5 可知,叶绿素a 含量随着成熟度的增加由6.69 mg/g DW 降低至4.53 mg/g DW。叶绿素b 的含量在LM 阶段达到最大值,为9.01 mg/g DW,在FM 阶段快速下降到2.78 mg/g DW。总叶绿素含量在MM 和LM 阶段相近,在FM 阶段最低,为7.38 mg/g DW,并且胡椒剖面图也表明在完全成熟阶段浆果呈现红色或黄绿色,从另一方面证实了叶绿素含量的减少。
糖作为胡椒风味物质的主要成分,在果实发育和成熟过程中起着重要的作用,不同成熟阶段果实中的葡萄糖、果糖和总糖含量变化如图6 所示。
图6 不同成熟阶段果实糖类含量
Fig.6 Sugar content of pepper berries at different stages of maturity
同一指标不同字母表示差异显著,p<0.05。
由图6 可知,葡萄糖、果糖和总糖含量随着成熟度的增加呈上升趋势,最明显的为总糖含量,其值由38.50 mg/g DW 增加到50.26 mg/g DW。葡萄糖和果糖在成熟过程中缓慢积累,葡萄糖含量最低,为6.56~7.91 mg/g DW,果糖含量明显高于葡萄糖含量,为12.38~14.88 mg/g DW,这一变化趋势与Yang 等[23]的研究结果一致,多种水果在成熟后期均表现出总糖含量增加的趋势。
不同成熟阶段鲜果的精油提取得率如图7 所示。
图7 不同成熟阶段果实胡椒精油得率
Fig.7 Essential oil yield of pepper berries at different stages of maturity
不同字母表示差异显著,p<0.05。
由图7 可知,随胡椒果实的成熟,精油得率逐渐降低,MM 阶段得率最高(2.91 mL/100 g),FM 阶段得率最低(2.40 mL/100 g)。
对精油组成成分进行GC-MS 分析,结果如表2所示。
表2 不同成熟阶段果实精油的GC-MS 分析
Table 2 GC-MS analysis of essential oils from pepper berries at different stages of maturity
序号简式质量浓度/(mg/mL)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28化合物名称(+)-α-蒎烯桧烯莰烯β-蒎烯月桂烯α-水芹烯左旋-β-蒎烯邻伞花烃4-异丙基甲苯α-松油烯萜品油烯(-)-α-荜澄茄油烯D-柠檬烯3-蒈烯罗勒烯γ-松油烯芳樟醇L(-)-樟脑4-萜烯醇α-松油醇反式-橙花叔醇马鞭草烯醇胡椒酮十九烷δ-榄香烯β-榄香烯(-)α-古芸烯(-)-反式石竹烯C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H14 C10H14 C10H16 C10H16 C15H24 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H18 O C10H16O C10H18O C10H18O C10H16O C10H14O C10H16O C19H40 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 MM 40.41 1.70 0.82 70.52 18.87 38.37 0.12 0.15 2.30 0.10 15.94 0.38 128.93 168.66 0.20 1.45 2.03 0.13 0.15 0.66 0.02 0.02 0.11 0.08 23.78 2.10 0.20 138.68 LM 31.80 1.47 0.75 68.21 16.76 37.21 0.12 0.08 4.11 0.09 8.07-143.04 151.10 0.17 1.12 1.37 0.14 0.14 0.33 0.03-0.09 0.06 16.04 1.79 0.20 106.21 FM 31.80 1.20 0.69 59.02 14.89 33.76 0.10-2.44 0.09 5.39 0.25 104.94 146.91 0.15 1.03 1.29 0.09 0.10 0.31 0.02 0.11 0.06 0.04 15.22 1.31 0.17 79.98保留指数935 976 953 975 991 1 005 979 1 021 1 026 1 025 1 086 1 346 1 031 1 011 1 041 1 061 1 099 1 139 1 179 1 192 1 170 1 253 1 262 1 300 1 338 1 393 1 407 1 430
续表2 不同成熟阶段果实精油的GC-MS 分析
Continue table 2 GC-MS analysis of essential oils from pepper berries at different stages of maturity
注:- 表示未检出。
序号29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45化合物名称大根香叶烯D α-石竹烯γ-古云烯(-)α-瑟林烯α-木罗烯β-红没药烯Δ-杜松烯(E,E)-α-法呢烯α-红没药烯橙花叔醇反式-橙花叔醇石竹烯(-)-桉油烯醇A-毕橙茄醇(±)-α-红没药醇(2Z,6E)-金合欢醛E,E-金合欢醛简式C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H26O C15H26O C15H24O C15H24O C15H26O C15H26O C15H24O C15H24O质量浓度/(mg/mL)MM 0.05 17.39 0.05 0.91 0.13 0.43 3.33 0.02 0.03 0.02 0.04 1.28 0.81 0.08 0.11 0.03 0.04 LM 0.19 10.70 0.13 0.88 0.13 0.54 3.52 0.04-0.04-0.80 1.66 0.06 0.12 0.03 0.02 FM 0.19 4.03-0.70 0.07 0.24 2.63-0.02- -0.71 0.79 0.05 0.08 0.05 0.04保留指数1 479 1 465 1 474 1 494 1 499 1 506 1 515 1 522 1 539 1 562 1 564 1 580 1 619 1 638 1 686 1 717 1 730
由表2 可知,随胡椒果实成熟度的增加,胡椒精油中挥发性物质的浓度和数量均呈下降趋势。本试验定性并定量了45 种化合物,其中含量最高的香气成分为3-蒈烯,其他主要化合物为D-柠檬烯、(-)-反式石竹烯、β-蒎烯、α-水芹烯和(+)-α-蒎烯。对已鉴定出的香气成分物质进行分类,共鉴定出9 类物质。大多数香气成分随着果实的成熟,其含量明显减少,如β-蒎烯、月桂烯、(-)-反式石竹烯等。4-异丙基甲苯、(-)-桉油烯醇和橙花叔醇等香气成分随着成熟度的增加呈现先增加后减少趋势,其中4-异丙基甲苯和(-)-桉油烯醇含量增加最为明显,分别增加了78.7%和105.0%。另外,驱蚊剂的主要成分如3-蒈烯、D-柠檬烯和4-异丙基甲苯等物质都在精油中被大量发现,这与先前的研究结果一致[24],因此,胡椒精油具有很大的驱蚊潜力。香气化合物种类组成如图8 所示。
图8 香气化合物种类组成
Fig.8 Composition of aroma compounds
由图8 可知,其中萜烯类物质占主导地位,其次是醇类化合物。
胡椒在3 个不同成熟阶段的不同组分中总酚和总黄酮含量的变化情况如图9 所示。
图9 不同成熟阶段果实甲醇提取物不同组分中总酚和总黄酮含量的变化
Fig.9 Changes in total phenol and total flavonoid contents in different components of methanolic extracts of pepper berries at different stages of maturity
A.总酚含量;B.总黄酮含量。不同字母表示差异显著,p<0.05。
由图9 可知,总酚含量从MM 阶段的10.53 mg GAE/g DW 下降至FM 阶段的8.39 mg GAE/g DW,结果表明,随胡椒果实成熟度的增加,总酚含量呈逐渐下降的趋势,这与橘子总酚含量的变化趋势一致[25]。总酚含量在MM 阶段和FM 阶段存在显著变化 (p<0.05),但总酚含量在LM 阶段和FM 阶段间只有轻微变化,前期研究也有类似结果[26]。在4 种组分中,游离形式多酚是构成总酚的主要形式,含量为3.20~4.17 mg GAE/g DW,其次是酯化形式和不溶性-结合形式,且MM 阶段含有最丰富的不溶性-结合形式多酚,说明胡椒废渣是活性物质的良好来源。各组分总黄酮含量(0.12~0.16 mg QE/g DW)的变化与总酚相似,总黄酮含量随果实成熟度的增加呈现先降低后增加的趋势。
以开花后210、240、270 d 的胡椒鲜果为研究材料,比较不同成熟阶段胡椒鲜果淀粉、蛋白质、维生素C、叶绿素、总糖、精油及其组成、总酚和总黄酮等物质的含量变化。结果表明,随着果实的逐渐成熟,完全成熟果实的平均大小为6.25 mm,淀粉含量增加至43.86%、蛋白质含量增加至15.75%,物质的积累导致果实硬度的增加;叶绿素和维生素C 在成熟后期发生降解,MM阶段鲜果有最丰富的功能活性物质,总酚含量为10.53 mg GAE/g DW,总黄酮含量为0.16 mg QE/g DW。本研究为胡椒加工原料最佳成熟度的选择提供参考。
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