富源酸菜是云南省富源县一种口味独特的美食，其独特的风味得益于当地独特的气候和水源，它是以萝卜、新鲜小油菜、玉米面和纯净水为主要原料，通过自然发酵制成[1]。近年来，酸菜的消费需求呈现增长趋势。富源酸菜富含膳食纤维、钙、磷、铁和硒等营养物质，具有健胃消食、减肥消暑、醒酒去腻等功效[2]。富源酸菜的生产目前以家庭小作坊为主，其发酵过程通常是在开放环境中自然进行，这种生产模式下，原料和加工环境中存在的复杂微生物群落易导致富源酸菜发酵周期延长、产品质量不稳定及产生不良气味，这些问题已成为工业生产的瓶颈[3]。
乳酸菌群属于酸菜发酵体系中的核心微生物[4‐5]，其发酵可以提高维生素、过氧化氢、氨基酸、有机酸、醇类和醛类等化合物的含量，增加酸度，赋予酸菜特有的风味、口感及质地，有助于抑制不良微生物；降低亚硝酸盐浓度、增强发酵酸菜的安全性[6‐7]；产生抗真菌毒素剂和细菌素等益生性物质预防腹泻和肝硬化等。发酵蔬菜除了能延缓衰老、降低胆固醇、刺激免疫系统，还能防止动脉粥样硬化、抗氧化、抗肿瘤和抗肥胖，降低细菌感染、炎症、突变和癌症的风险[8‐9]。乳酸菌除必须具备安全性外，还需要耐受胃部的高酸环境和肠道消化液中高渗透压的胆盐环境才能起益生作用[10‐11]。因此，筛选耐酸、耐胆盐的益生菌株具有重要研究意义和应用价值。
目前，国内外对富源酸菜的研究包括危害分析与关键控制点体系应用[12]、亚硝酸盐含量控制[13]、乳酸菌筛选和添加外源乳酸菌[1]或本土乳酸菌[14]的研究，结果表明不同区域的富源酸菜存在不同菌种，且菌株发酵特性存在显著差异；添加外源乳酸菌可以提高富源酸菜的安全性和品质、缩短发酵周期和延长保质期；添加本土乳酸菌布氏乳杆菌可以提高富源酸菜的感官品质和安全性、增加总酸含量、降低pH 值和亚硝酸含量、缩短发酵周期。但富源酸菜发酵过程中细菌区系的组成也尚未明确解析。
因此，本试验采用16S rDNA 技术对富源酸菜酸水中细菌进行测序，并从中分离乳酸菌，采用形态观察、乳酸菌定性试验、耐酸性试验、耐胆盐试验及16S rDNA 测序等对其进行鉴定，从而筛选出富源酸菜中优良的乳酸菌，以期为富源酸菜发酵过程中乳酸菌菌种资源开发提供理论依据，为提高富源酸菜品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 材料与试剂
酸红萝卜丝：云南满地金食品开发有限公司；MRS肉汤培养基、琼脂：广州环凯微生物科技有限公司；革兰氏染色液试剂盒：雷根生物科技有限公司；牛胆盐：国药集团化学试剂有限公司；高锰酸钾：大茂化学试剂厂；硫酸：重庆川东化工有限公司；引物、1×TSE101 金牌mix、TSINGKE 高纯度低电渗琼脂糖、DNA 凝胶回收试剂盒、DL5000 Marker、植物DNA 提取试剂盒：北京擎科生物技术有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
LDZM‐60KCS 高温高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；HWS 型恒温恒湿培养箱：宁波东南仪器有限公司；Minitron Cell 恒温振荡培养箱：伊孚森生物技术有限公司；Eci Bion LED 显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司；2720 thermal cycler 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、3730XL 测序仪：美国应用系统生物公司；FA2204E 电子天平：常州市幸运电子设备有限公司；Legend Micro17 离心机：赛默飞世尔科技公司；JY300C 电泳仪、JYDF 电泳槽、JY04S‐3C 凝胶成像仪：北京君意东方电泳设备有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 富源酸菜的制作及取样
采用传统自然发酵制作酸菜，取发酵罐中不同部位酸菜酸水样本混合均匀，-4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 细菌多样性分析
从富源酸菜酸水中提取总DNA，对16S rDNA 的V3～V4 可变区PCR扩增，扩增引物为正向引物520F：5´‐CCTAYGGGRBGCASCAG‐3´，反向引物802R：5´‐GGACTACNNGGGTATCTAAT‐3´，然后检测扩增序列，将合格序列进行文库扩建并上机进行高通量测序。测序平台为NovaSeq 6000[15]。测序结果先根据标签序列进行拆分获得每个样品的原始数据，并去除标签序列和引物，随后通过FLASH 软件对R1 和R2 序列数据进行拼接。对拼接的数据标签进行质控，得到高质量测序标签，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据。选用Greengenes 数据库（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）进行注释。
1.2.3 扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）聚类及物种组成分析
用DADA2 方法对全部有效数据做ASV 聚类分析。采用定量洞察微生物生态学2（quantitative in‐sights into microbial ecology 2，QIIME2）的sklearn 算法对每个ASV 使用预先训练好的贝叶斯分类器进行物种注释。根据ASV 注释结果和各样品特征表，获得界、门、纲、目、科、属、种水平物种丰度表，在门和属水平上统计样品的物种组成。
1.2.4 乳酸菌分离纯化
吸取25 mL 保存于-4 ℃冰箱中的样品于三角瓶中，加入225 mL 无菌生理盐水中充分混匀制备成1∶10（体积比）样品稀释液，按照梯度稀释法10 倍梯度稀释，取10-4、10-5、10-6 3 个梯度各0.2 mL 样品稀释液，将其均匀涂布于MRS 固体培养基中，37 ℃培养36～48 h，挑取白色或微白色、呈圆形或梭形的菌落，划线接种到MRS 固体培养基上，37 ℃培养36～48 h，划线2～3 次，观察其个体形态，直至确定是单菌落后编号并置于-4 ℃冰箱中保存，以待送检及后期取用[16‐17]。
1.2.5 菌株的鉴定
观察纯化后固体平板中微生物菌落形态（菌落颜色、边缘整齐度等）。分别进行革兰氏染色试验、产过氧化氢酶试验和乳酸菌定性试验，将10% 的硫酸与2%的高锰酸钾按1∶1（体积比））混合后滴入菌种发酵液中，将含硝酸银溶液的滤纸条搭于试管口，加热试管，发酵液中若有乳酸生成则与硫酸和高锰酸钾反应生成乙醛，加热后的乙醛蒸汽在管口处接触硝酸银会使试纸变黑[17]。
1.2.6 乳酸菌耐性试验
1.2.6.1 乳酸菌耐酸能力
用4 mol/L 盐酸将MRS 液体培养基pH 值调至4.0、3.5、3.0 和2.5，121 ℃灭菌20 min，冷却备用。以2%（体积分数）的接种量将菌悬液接种到不同pH 值的MRS 液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，每种乳酸菌做3 个重复，在600 nm 波长条件下对每一组菌液的吸光度进行测定。与未经过酸化的培养基培养的菌株做对比，根据下列公式计算乳酸菌的存活率[18]。
式中：R 为乳酸菌在不同pH 值条件下的存活率，%；N1 为不同pH 值条件下菌液的吸光度；N0 为未调节pH 值条件下菌液的吸光度。
1.2.6.2 乳酸菌耐胆盐能力
参考李旭阳等[19]的方法，分别配制牛胆盐含量为0（空白）、0.1、0.2、0.3（g/100 mL）的MRS 液体培养基，并调节pH 值至6.5±0.2，121 ℃灭菌15 min，冷却备用。按2%（体积分数）的接种量将菌悬液分别接种至不同牛胆盐含量的MRS 培养基中，37 ℃培养24 h。观察不同浓度胆盐培养液中菌体的生长情况，测定600 nm 波长处的吸光度，根据下列公式计算乳酸菌对胆盐的耐受力。
式中：R 为乳酸菌在不同胆盐含量下的存活率，%；N1 为含胆盐培养基的吸光度；N0 为空白培养基的吸光度。
1.2.7 菌株DNA 纯化及16S rDNA 测序分析
使用TSINGKE 植物DNA 提取试剂盒对挑选的乳酸菌进行基因提取，采用通用引物27F（5´‐AGTTT‐GATCMTGGCTCAG‐3´）和1492R（5´‐GGTTACCTTGT‐TACGACTT‐3´）进行PCR 扩增。PCR 扩增条件见表1。扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后进行16S rDNA 测序[20]，测序由云南普利斯生物科技有限公司完成。测序结果在美国国家生物技术信息中心（National center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中进行基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析。
表1 PCR 扩增条件
Table1 PCR amplification conditions
阶段预变性循环阶段延伸阶段保存阶段温度/℃98 98 56 72 72 4时间2 min 10 s 10 s 10 s 5 min 24 h循环数/次35
1.3 数据分析
所有试验均重复进行3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 23.0 进行数据分析，采用GraphPad Prism 9.5 绘制图形。
2 结果与分析
2.1 高通量测序技术分析富源酸菜酸水细菌区系及优势菌属
2.1.1 ASV 聚类
将酸水均分为3 份（分别为酸水1、酸水2 和酸水3，即S1、S2 和S3）进行高通量测序分析，结果分别获得66 496、72 232、64 325 条有效序列。有效序列按100% 一致性进行ASV 聚类，出现频次多的序列为代表性序列，并注释其物种。富源酸菜酸水样品韦恩图如图1所示。
图1 富源酸菜酸水样品韦恩图
Fig.1 Venn diagram of pickling liquid samples of Fuyuan pickles
由图1可知，3 份酸水样本中共得到1 588 个ASV，S1、S2 和S3 分别含561、540、487 个ASV，其中3 组共有的ASV 数量为212 个，特有的ASV 数量分别为226、239、185 个。
2.1.2 细菌α 多样性分析
Dominance 和Ace 表征群落物种均匀度，均匀度越好，指数越大；Goods_coverage 为覆盖率，测序覆盖度越高，指数越大；Observed_otus 表示直观观测到的物种数目，指数越大，观测到的物种越多；Chao1 指数用来表征物种的丰富度，群落中低丰度物种越多，Chao1指数越大；Simpson 指数和Shannon 指数常用于表征群落物种多样性[21]。α 多样性可以反映样品微生物群落的丰富度和多样性，3 份酸水样品α 多样性分析见表2。
表2 富源酸菜酸水样品细菌α 多样性分析
Table2 The α diversity of bacteria in the pickling liquid samples of Fuyuan pickles
样本S1 S2 S3有效序列66496.00 72232.00 64325.00 Dominance 0.16 0.20 0.19 Goods_coverage 1.00 1.00 1.00 Observed_otus 561.00 540.00 487.00多样性指数Chao1 561.00 540.43 487.00 Ace 0.54 0.47 0.50 Shannon 4.93 4.29 4.48 Simpson 0.84 0.80 0.81
由表2可知，酸水样品的覆盖率均为1，Ob‐served_otus 指 数 在487.00～561.00，Shannon 指 数 在4.29～4.93，Chao1 指数在487.00～561.00，表明测序结果可以完整地反映样品信息。通过计算样品的多样性指数发现，S1 样品的Chao1 指数（561.00）和Shannon指数（4.93）最高，说明S1 样品的物种丰度最高，细菌菌群结构更复杂；相反，S3 样品的Chao1 指数为487.00，细菌丰富度最低；S2 样品的Shannon 指数为4.29，菌群结构最简单，说明酸水样品中细菌种类和数量分布上存在差异。
2.1.3 细菌的组成分布
基于门水平的细菌结构见图2。
图2 富源酸菜酸水样品基于门水平的细菌结构
Fig.2 Bacterial community structures in the pickling liquid samples of Fuyuan pickles at the phylum level
由图2可知，在门水平上，3 份酸水中优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和蓝细菌门（Cyanobacteria），在3 份酸水样品中其相对丰 度 分 别 为 71.94%、17.22% 和 3.42%，79.64%、11.74%和3.87%，78.45%、11.02%和4.87%，分别占总细菌的92.58%、95.25%和94.34%。3 份酸水样品的属水平结构组成见图3。
图3 富源酸菜酸水样品基于属水平的细菌结构
Fig.3 Bacterial community structures in the pickling liquid samples of Fuyuan pickles at the genus level
由图3可知，相对丰度前10 的菌属包括乳杆菌属（Lactobacillus）63.46%～71.48%、Chloroplast 属3.38%～4.80%、Mitochondria 属1.29%～3.07%、乳球菌属（Lacto⁃coccus）2.15%～2.56%、不动杆菌（Acinetobacter）0.93%～2.38%、副球菌属（Paracoccus）0.45%～1.79%、肠球菌属（Enterococcus）0.66%～1.59%、瘤胃解蛋白质菌属（Pro⁃teiniclasticum）0.97%～1.56%、生丝微菌属（Hyphomicro⁃bium）0.84%～1.18% 和厌氧醋菌属（Acetoanaerobium）0.07%～1.11%。
上述结果表明，3 份酸水样品细菌区系相似，门水平和属水平上菌群组成没有明显差异，丰度前10 的菌属种类一致，仅是相对丰度有略微差别，优势菌属均为乳杆菌属。与Song 等[6]关于接种植物乳杆菌和戊糖片球菌酸菜细菌多样性的报道相同，酸菜样品的优势细菌属为乳杆菌属。相关研究表明，乳杆菌具有较强的肠细胞黏附能力，可阻止大肠杆菌的生长，还可以通过调节结肠组织的微环境，防止肠道菌群的变化来预防结肠癌的发生，具有降低血液胆固醇水平、抑制胃肠道疾病和平衡肠道菌群的能力[22]。乳酸菌发酵产生了有机酸、过氧化氢和肽聚糖水解酶等具有抗菌性能的益生菌物质，可以预防食源性致病菌和增强发酵食品的贮藏性。乳酸作为酸菜中的主要有机酸，不仅赋予酸菜柔和的酸味特征，还能有效降低涩味，同时提高发酵产品的微生物稳定性[3]。
2.2 菌株的初步分离鉴定
在MRS 培养基上共挑选出5 株最具特点的单菌落进行纯化，菌落形态和生物学鉴定结果见表3，5 株乳酸菌的菌落形态见图4，革兰氏染色镜检结果见图5。
图4 乳酸菌菌落形态特征
Fig.4 Colony morphology of lactic acid bacteria
从左至右依次分别为J1～J5。
图5 乳酸菌菌株形态特征
Fig.5 Cell morphology of lactic acid bacteria
从左至右依次分别为J1～J5。
表3 乳酸菌菌落形态及生物学鉴定
Table3 Colony morphology and biochemical test results of the isolated lactic acid bacteria
注：+表示阳性；-表示阴性。
菌株编号J1 J2 J3 J4 J5菌落形态圆形、不透明、大菌落、中间隆起、边缘整齐、平滑、白色圆形、不透明、大菌落、中间隆起、边缘整齐、平滑、颜色偏黄圆形、不透明、菌落较小、中间隆起、边缘整齐、平滑、白色圆形、不透明、大菌落、扁平、边缘不规则、颜色偏黄圆形、不透明、大菌落、扁平、边缘不规则、白色菌株形态呈长杆状，单个或簇状排列呈长杆状，单个、簇状或链状排列呈短杆状，单个、簇状或链状排列呈长杆状，单个、簇状或链状排列呈长杆状，单个或簇状排列革兰氏染色+++++过氧化氢酶-----乳酸菌定性试验+++++
由表3、图4、图5可知，通过革兰氏染色初步判定这5 株单菌落均为革兰氏阳性菌，在显微镜下均为杆状，单个、成对或成簇排列。菌株的过氧化氢酶试验结果为阴性。含硝酸银溶液的滤纸条均变为黑色，经生物学初步鉴定均为乳酸菌。
2.3 耐酸和耐胆盐能力
2.3.1 耐酸能力
益生菌必须以活菌形式进入人体的胃肠道才能发挥其益生功能，在从口腔到人体肠道的过程中益生菌需要耐受胃部的低pH 值环境[23]，胃液中胃酸的主要成分为盐酸，其pH 值通常为3.0 左右，在空腹情况下可达2.5[24]。所以，乳酸菌对酸的耐受能力是衡量优良益生菌的重要指标。本试验用盐酸对5 株乳酸菌的生长环境进行调节，观察其在pH 值为2.5、3.0、3.5、4.0环境下存活24 h 的情况，结果见图6。
图6 乳酸菌在不同pH 值条件下的存活率
Fig.6 Survival rates of lactic acid bacteria under different pH conditions
不同小写字母表示同一pH 值不同乳酸菌差异显著（p<0.05）。
由图6可知，5 株乳酸菌的存活率均随着pH 值的降低而降低。在pH 值为4.0 的酸性条件下孵育24 h后，J1、J2 和J3 存 活率分别为91.10%、96.48% 和93.15%，J4 和J5 存活率低于74.00%；在pH 值为3.5的酸性条件下孵育24 h 后，J1、J2 和J3 存活率分别为53.14%、76.38% 和70.34%，J4 和J5 存 活 率 低 于40.00%；综合显著性差异和存活率来看，在pH 值为4.0 和3.5 的酸性条件下孵育24 h 后，J1、J2 和J3 耐酸性更好。在pH 值为3.0 的酸性条件下孵育24 h 后，J1、J2、J3、J4 和J5 存 活 率 分 别 为8.93%、9.93%、16.87%、11.21% 和7.00%；在pH 值为2.5 的酸性条件下孵育24 h 后，J1、J2、J3、J4 和J5 存活率分别 为7.00%、7.26%、10.65%、7.51%和2.93%；综合显著性差异和存活率来看，在pH 值为3.0 和2.5 的酸性条件下孵育24 h 后，J3 耐酸性较为突出，J1、J2 和J4 存活率无显著性差异，J5 耐酸性最差。综上所述，菌株J1、J2、J3 的耐酸性能较好。
2.3.2 耐胆盐能力
胆盐具有抑菌功能，小肠的胆汁盐含量为0.03%～0.30%[25]，乳酸菌只有适应人体小肠中的胆盐胁迫才能发挥益生功能，因此，对胆盐的耐受也是衡量优良益生菌的重要指标[23]。观察菌株在不同胆盐浓度的MRS培养基中培养24 h 后的生长情况，通过计算菌株的存活率表征它们的耐胆盐能力。5 株乳酸菌在胆盐含量为0.1、0.2、0.3 g/100 mL 条件下的存活率结果见图7。
图7 乳酸菌在不同胆盐浓度条件下的存活率
Fig.7 Survival rates of lactic acid bacteria under different bile salt concentrations
不同小写字母表示同一胆盐含量不同乳酸菌差异显著（P<0.05）。
由图7可知，5 株乳酸菌的存活率均随着胆盐含量升高而降低。在胆盐含量为0.1 g/100 mL 条件下孵育24 h 后，J1、J2 和J3 存活率分别为59.56%、31.38%和14.56%，J4 和J5 存活率均低于11.00%，各菌株间存活率具有显著性差异；在胆盐含量为0.2 g/100 mL条件下孵育24 h 后，J1、J2 和J3 存活率均高于10.00%，J4 和J5 存活率均低于4.00%；在胆盐含量为0.3 g/100 mL 条件下孵育24 h 后，J1、J2 和J3 存活率均高于9.00%，J4 和J5 存活率均低于3.00%；在胆盐含量为0.2 g/100 mL 和0.3 g/100 mL 条件下孵育24 h后，J1、J2 和J3 存活率均无显著性差异（P>0.05），且以上3 株菌株存活率显著高于J4 和J5 存活率。综合看来，菌株J1、J2、J3 的耐胆盐性能较好。
2.4 16S rDNA 序列鉴定
综合以上耐酸和耐胆盐能力，选取在pH2.5 和牛胆盐含量为0.3 g/100 mL 条件下培养24 h 后存活率分别大于7% 和9% 的菌株J1、J2 和J3 作为优良菌株，提取DNA 并进行PCR 扩增，通过16S rDNA 测序后，经NCBI 基因库的BLAST 软件比对获得近源物种信息（仅列举了相似度前3 的菌株），结果见表4，并利用MEGA11 软件构建系统进化树，结果见图8。
图8 3 株乳酸菌基因序列系统发育树
Fig.8 Phylogenetic tree of the three strains of lactic acid bacteria based on gene sequences
表4 耐酸、耐胆盐乳酸菌菌株分子鉴定
Table4 Molecular identification of lactic acid bacterial strains with acid and bile salt tolerance
菌株编号J1 J2 J3相似模式种Levilactobacillus brevis Levilactobacillus brevis Levilactobacillus brevis系列比对/%99 100 99相似度/%99.93 99.86 99.86 99.86 99.69登录号MG462018.1 MT611665.1 MT512175.1 MT611665.1 MT604624.1 MT597706.1 MF992224.1 OR481918.1 FJ227309.1
由表4和图8可知，经鉴定菌株J1、J2 和J3 均为Levilactobacillus（乳杆菌属）的短乳杆菌Levilactobacil⁃lus brevis，相似度在99%以上。叶朋飞等[2]从富源酸菜中分离得到植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌；黄慧福等[14]分离得到乳杆菌属布氏乳杆菌，与本研究结果均不一致，说明不同区域采集的富源酸菜存在不同优势菌种。
3 结论
通过研究富源酸菜酸水中细菌多样性发现，不同富源酸菜酸水样本细菌多样性和丰富度存在差异，但其中优势菌门均为厚壁菌门、变形菌门和蓝细菌门，优势菌属均为乳杆菌属。从富源酸菜酸水中筛选出5 株乳酸菌，其中J1、J2、J3 3 株乳酸菌耐酸和耐胆盐性能更佳。经16S rDNA 鉴定，3 株乳酸菌均为短杆乳酸菌（Levilactobacillus brevis），后续可作为富源酸菜的发酵剂备选菌株。
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