抗性淀粉（resistant starch，RS）是在健康人体小肠中不被吸收的淀粉及其降解产物[1‐2]，可被肠道菌群发酵产生短链脂肪酸[3]，从而降低肠道pH 值，影响葡萄糖的代谢[4]，抑制肿瘤细胞的生长与繁殖[5]，降低血浆胆固醇和甘油三酯的浓度[6]，促进肠道有益菌群的生长、繁殖[7‐8]，促进肠道蠕动，预防便秘、痔疮、结肠癌等疾病[9‐11]，已作为营养功能成分应用于普通食品和特殊食品中[12]。研究者根据抗性淀粉的结构、来源和抗酶解性的不同将抗性淀粉分为5 种类型，分别为淀粉酶无法接近的抗性淀粉（RS1）、天然具有抗消化性的抗性淀粉（RS2）、主要由糊化淀粉回生后形成凝沉的淀粉聚合物（RS3）、基因改造或化学改性的抗性淀粉（RS4）、直链淀粉‐脂质复合物（RS5）[13]。
目前关于抗性淀粉含量的测定包括体内和体外两方面。体内测定法主要有3 种，即氢气呼吸法、回肠造口术法和插管法[13‐14]。体外测定法的基本原理是在体外模拟体内的消化环境，先用消化酶将非抗性淀粉消化洗涤后，加入淀粉葡萄糖苷酶（amyloglucosidase，AMG）将粗抗性淀粉酶解为葡萄糖，通过计算水解后的葡萄糖含量，计算抗性淀粉的含量[15‐19]；或者测定淀粉和可溶性淀粉的含量，计算两者的差值来间接计算抗性淀粉的含量[20‐22]。抗性淀粉含量常见的体外分析法有Bjorck 法、Berry 法、Engly 法、Champ 法、Goni 法和McCleary 法等[13]。Bjorck 法高温处理会使RS2 失去抗消化性，导致测定结果偏低；Berry 法对含RS1 样品的测定结果偏低；Engly 法操作时间长、对测试人员操作水平要求高；Champ 法简单快速、易于操作，但需体内验证；Goni 法操作简单，但结果准确度低；Mc‐Cleary 法测定结果准确、重复性好，但是方法成本高。NY/T 2638—2014《稻米及制品中抗性淀粉的测定 分光光度法》适用于抗性淀粉含量2%～64%的稻米及制品的测定，NY/T 4358—2023《植物源性食品中抗性淀粉的测定分光光度法》适用于植物源性食品中抗性淀粉含量1～70 g/100 g 的测定，美国分析化学家协会（Association of Offical Analytical chemists，AOAC）2002.02[23]方法适用于植物性食品中抗性淀粉含量的测定，但是该方法需使用剧毒试剂叠氮化钠，该方法的推广和使用受限。
国家标准尚未建立对食品中抗性淀粉含量的测定，因此，本试验选取不同基质的样品，通过探究混合酶的使用量、水解时间和乙醇沉淀洗涤次数等条件对样品中抗性淀粉含量的影响，优化去除非抗性淀粉的条件；通过探究淀粉葡萄糖苷酶添加量、反应时间和反应温度等条件对样品中抗性淀粉含量的影响，筛选最佳抗性淀粉水解条件，建立一个准确性高、精密度好，应用范围广的食品中抗性淀粉含量的测定方法，以期为食品中抗性淀粉含量的测定提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试剂与材料
α‐胰腺淀粉酶（≥5 U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（3 260 U/mL）、葡萄糖氧化酶（238 U/mg）、过氧化物酶（≥300 U/mg）、马来酸、对羟基苯甲酸、4‐氨基安替比林、D‐葡萄糖（均为分析纯）：美国Sigma 化学公司；氢氧化钠、氢氧化钾、二水合氯化钙、磷酸二氢钾、盐酸、无水乙醇、冰乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；高直链玉米粉、祥玉1945、甘薯抗性淀粉、高抗性淀粉米、淀粉、摩棒蛋糕、马铃薯淀粉、高直链玉米抗性淀粉1、豆粉、豆浆、高直链玉米抗性淀粉（7012）、苏打饼干、小麦粉、红豆、玉米粉、功能稻米、四季豆、红薯、芋头、马铃薯、杂粮粥、黄豆、白菜、苹果、质控样品：市售。
1.1.2 仪器与设备
BS224S 型分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DZKW‐4 电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；IKA VORTEX 3 涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ZHWY‐110X30 往复式恒温水浴摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；FiveEasy Plus pH 计：梅特勒‐托利多国际贸易（上海）有限公司；CF16RXII 高速冷冻离心机：日本日立科技有限公司；T6新世纪分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 葡萄糖氧化酶‐过氧化物酶（glucose oxidase‐peroxidase，GOD‐POD）‐氨基安替比林混合液的配制
称取磷酸二氢钾13.60 g、氢氧化钠4.2 g 和对羟基苯甲酸3.0 g 至90 mL 水中溶解，混匀，用2.0 mol/L盐酸溶液调pH 值至7.4，转入100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度后混匀备用。取50 mL 上述缓冲液，加入800 mL 水混匀，加入葡萄糖氧化酶505 mg、过氧化物酶2.2 mg 和4‐氨基安替比林81.3 mg，转入1 000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混匀后-18 ℃避光保存备用。
1.3 试验方法
1.3.1 去除非抗性淀粉条件的选择
称取0.5 g 高直链玉米抗性淀粉（7012）、红豆和红薯样品于离心管中，分别加入4.0 mL 混合酶溶液[α‐胰腺淀粉酶（15 U/mL）+淀粉葡萄糖苷酶（1.5 U/mL）、α‐胰腺淀粉酶（30 U/mL）+淀粉葡萄糖苷酶（3 U/mL）、α‐胰腺淀粉酶（60 U/mL）+淀粉葡萄糖苷酶（6 U/mL）]，于涡旋振荡器混匀。将离心管放入恒温水浴摇床，37 ℃振荡孵育4、8、16、24 h。加入50% 乙醇溶液8.0 mL，涡旋振荡混匀，3 000 r/min 离心5 min，弃上清液。重复洗涤2 次，离心管中沉淀物为粗抗性淀粉。向上述离心管中加入2.0 mol/L 氢氧化钾溶液2.0 mL，涡旋振荡混匀，冰水浴20 min，期间搅拌4 次。向离心管中加入1.2 mol/L 乙酸钠缓冲液（pH3.8）8.0 mL，涡旋振荡混匀，分别加入淀粉葡萄糖苷酶0.1 mL，涡旋振荡混匀。将离心管放入50 ℃恒温水浴摇床孵育30 min。取出离心管冷却至室温。对于抗性淀粉含量<10%的待测液于3 000 r/min 离心5 min。对于抗性淀粉含量≥10%待测液全部转移至100 mL 容量瓶，定容后，用定性滤纸过滤到100 mL 离心管中。
1.3.2 洗涤次数的选择
称取1.3.1 样品于离心管中，分别加入α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL 混合酶溶液4.0 mL，涡旋振荡器混匀。将离心管放入恒温水浴摇床，37 ℃振荡孵育16 h，孵育后取出试样，加入无水乙醇4.0 mL，涡旋振荡1 min，3 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入50% 乙醇溶液8.0 mL，涡旋振荡混匀，3 000 r/min 离心5 min。弃上清液，分别重复洗涤2 次和3 次，抗性淀粉水解条件同1.3.1。
1.3.3 抗性淀粉水解条件的选择
称取1.3.1 样品于离心管中，分别加入α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL 混合酶溶液4.0 mL，涡旋振荡器混匀。将离心管放入恒温水浴摇床，37 ℃振荡孵育16 h，孵育后取出试样，加入无水乙醇4.0 mL，涡旋振荡1 min，3 000 r/min 离心5 min。弃上清液，加入50% 乙醇溶液8.0 mL，涡旋振荡混匀，3 000 r/min 离心5 min，弃上清液，重复洗涤2 次。然后加入2.0 mol/L 氢氧化钾溶液2.0 mL，涡旋振荡混匀，冰水浴20 min，期间搅拌4 次。向离心管中加入1.2 mol/L乙酸钠缓冲液（pH3.8）8.0 mL，涡旋振荡混匀。
1.3.3.1 淀粉葡萄糖苷酶添加量对抗性淀粉含量的影响
分别向上述离心管中加入淀粉葡萄糖苷酶0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mL，涡旋振荡混匀后将离心管放入50 ℃恒温水浴摇床孵育30 min，取出离心管冷却至室温。
1.3.3.2 水解温度对抗性淀粉含量的影响
向上述离心管中加入淀粉葡萄糖苷酶0.10 mL，涡旋振荡混匀。将离心管分别放入40、45、50、55、60 ℃恒温水浴摇床孵育30 min，取出离心管冷却至室温。
1.3.3.3 水解时间对抗性淀粉含量的影响
向上述离心管中加入淀粉葡萄糖苷酶0.10 mL，涡旋振荡混匀后将离心管放入50 ℃恒温水浴摇床孵育15、30、45、60、75 min，取出离心管冷却至室温。
1.3.4 抗性淀粉含量的测定
共选取20 种含抗性淀粉的食品，采用分光光度法测定样品中抗性淀粉的含量。分光光度计最佳吸光度范围为0.2～0.8，当样品中抗性淀粉含量≥10%时，分光光度计测定的吸光度超过1.0，且数据不稳定，需要将样品进行稀释。对于抗性淀粉含量<10%的待测液于3 000 r/min 离心5 min。对于抗性淀粉含量≥10%的待测液全部转移至100 mL 容量瓶，定容后，用定性滤纸过滤到100 mL 离心管中。分别吸取0.10 mL 试样上清液、1.0 mg/mL D‐葡萄糖标准工作液和100 mmol/L乙酸钠缓冲液（pH4.5）于10 mL 试管中，加入GOD‐POD‐氨基安替比林混合液3.0 mL，混匀，50 ℃孵育20 min 后取出，以100 mmol/L 乙酸钠缓冲溶液作为空白溶液，在510 nm 处测定试样（A1）和D‐葡萄糖标准比色液的吸光度（A0）。抗性淀粉含量≥10% 样品的抗性淀粉含量（ω1，%）按公式（1）计算，试样中抗性淀粉含量<10%样品的抗性淀粉含量（ω2，%）按公式（2）计算。
式中：ΔE 为相对于空白溶液的吸光度；F 为从吸光度到微克的转换系数，µg；100/0.1、10.3/0.1 分别为抗性淀粉含量≥10%样品的体积校正系数（从100 mL 取0.1 mL）、抗性淀粉含量<10%样品的体积校正系数（从10.3 mL 取0.1 mL）；100/m 为抗性淀粉占试样质量百分比的因子；162/180 为游离D‐葡萄糖转换到淀粉中存在的无结晶水D‐葡萄糖的因子。
1.3.5 方法学验证
1.3.5.1 精密度
选取高直链玉米抗性淀粉（7012）、红豆和红薯样品，分别进行10 次重复测定样品中抗性淀粉的含量，考察方法的精密度。
1.3.5.2 准确度
选取已知抗性淀粉含量为39.00%的质控样品，用试验建立的方法测定质控样品中抗性淀粉的含量，比较测定值与标示值之间的误差，评价试验建立方法的准确度。
1.3.5.3 检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）
选择杂粮粥、黄豆、白菜和苹果为空白样品，进行10 次重复试验。检出限根据GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中的空白标准偏差法测定，样品空白独立测试10 次。定量限根据GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中的方法测定。检出限（D，%）、定量限（Q，%）计算公式如下。
式中：W 空白为空白试样中抗性淀粉含量，%；S 为空白试样的标准偏差，%。
1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2010 进行数据统计。
2 结果与讨论
2.1 去除非抗性淀粉条件的优化
以高直链玉米抗性淀粉（7012）、红豆和红薯为样品，选取不同水解时间和不同混合酶浓度进行非抗性淀粉水解试验，以样品中抗性淀粉含量的变化分析非抗性淀粉是否被完全水解，结果如图1所示。
图1 不同混合酶浓度、不同水解时间对样品中抗性淀粉含量的影响
Fig.1 Effect of different mixed enzyme concentrations and hydrolysis time on the content of resistant starch in samples
A.高直链玉米抗性淀粉（7012）；B.红豆；C.红薯。
由图1A、图1B可知，高直链玉米抗性淀粉（7012）和红豆样品中添加α‐胰腺淀粉酶15 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶1.5 U/mL 混合酶时，随着水解时间的延长，抗性淀粉含量明显降低，表明样品中非抗性淀粉未完全水解，即样品中添加α‐胰腺淀粉酶15 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶1.5 U/mL 混合酶不能将样品中非抗性淀粉水解完全。当样品中添加α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL 和α‐胰腺淀粉酶60 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶6 U/mL 混合酶时，随着水解时间的延长，样品中抗性淀粉含量降低，当水解时间达到16 h 和24 h时，抗性淀粉含量无明显变化，表明样品中非抗性淀粉已经水解完全。由图1C可知，红薯样品添加3 种混合酶时，随着水解时间的延长，样品中抗性淀粉含量均明显降低，当水解时间达到16 h 和24 h 时，抗性淀粉含量无明显变化。
综上，随着水解时间的延长，高直链玉米抗性淀粉（7012）和红豆样品中的抗性淀粉含量均降低，添加α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL 混合酶水解至16 h 抗性淀粉含量稳定，继续增大酶浓度和延长水解时间，对样品中抗性淀粉含量无明显影响，表明此时样品中非抗性淀粉已全部被水解。随着水解时间的延长，红薯样品中抗性淀粉含量均降低，添加α‐胰腺淀粉酶15 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶1.5 U/mL 混合酶水解至16 h 抗性淀粉含量稳定，继续增大酶浓度和延长水解时间，对样品中抗性淀粉含量无明显影响，表明此时样品中非抗性淀粉已全部被水解，由于红薯样品中抗性淀粉含量相对较低，添加α‐胰腺淀粉酶15 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶1.5 U/mL 混合酶即可将样品中非抗性淀粉完全水解，但对于抗性淀粉含量比较高的样品[高直链玉米抗性淀粉（7012）、红豆样品]，需添加α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL 混合酶将样品中非抗性淀粉完全水解。因此，选择添加α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL 混合酶水解16 h 作为去除非抗性淀粉的最适水解条件。
2.2 洗涤次数对抗性淀粉含量的影响
不同乙醇洗涤次数对样品中抗性淀粉含量的影响见表1。
表1 不同乙醇洗涤次数对样品中抗性淀粉含量的影响
Table1 Effect of different ethanol washing times on the content of resistant starch in samples
注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05。RSD 为相对标准偏差（relative standard deviation）。
样品高直链玉米抗性淀粉（7012）红豆红薯洗涤次数1 2 3 1 2 3 1 2 3抗性淀粉含量/%14.58±0.16a 14.73±0.70a 14.99±0.52a 11.48±0.59b 11.24±0.71b 10.84±0.55b 3.25±0.12c 3.40±0.23c 3.27±0.52c RSD/%1.10 4.75 3.47 5.14 6.32 5.07 3.69 6.76 15.90
由表1可知，随着洗涤次数的增加，高直链玉米抗性淀粉（7012）、红豆、红薯样品中抗性淀粉含量无显著性差异。红薯样品洗涤3 次时，抗性淀粉含量的RSD为15.90%，结果的稳定性较差，为保证非抗性淀粉被完全洗去且结果稳定，选择洗涤2 次。
2.3 抗性淀粉水解条件的优化
2.3.1 淀粉葡萄糖苷酶添加量对抗性淀粉含量的影响结果分析
不同淀粉葡萄糖苷酶添加量对样品中抗性淀粉含量的影响见图2。
图2 不同淀粉葡萄糖苷酶添加量对样品中抗性淀粉含量的影响
Fig.2 Effect of different amounts of starch glucosidase on the content of resistant starch in samples
由图2可知，同一样品不同淀粉葡萄糖苷酶添加量下，抗性淀粉含量差异不明显，为保证抗性淀粉充分水解，选择淀粉葡萄糖苷酶添加量为0.10 mL。
2.3.2 水解温度对抗性淀粉含量的影响结果分析
水解温度对样品中抗性淀粉含量的影响见图3。
图3 水解温度对样品中抗性淀粉含量的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the content of resistant starch in samples
由图3可知，水解温度对抗性淀粉含量无明显影响，为保证抗性淀粉充分水解，选择水解温度为50 ℃。
2.3.3 水解时间对抗性淀粉含量的影响结果分析
水解时间对样品中抗性淀粉含量的影响见图4。
图4 水解时间对样品中抗性淀粉含量的影响
Fig.4 Effect of hydrolysis time on the content of resistant starch in samples
由图4可知，水解时间对抗性淀粉含量无明显影响，为保证抗性淀粉充分水解，选择水解时间为30 min。
2.4 方法学验证
2.4.1 精密度
方法的精密度结果见表2。
表2 方法的精密度
Table2 Precision of the method
样品高直链玉米抗性淀粉（7012）红豆红薯抗性淀粉含量/%1 13.13 11.86 4.03 2 13.96 10.41 3.87 3 14.73 10.41 3.77 4 15.15 10.37 3.79 5 12.91 11.48 3.73 6 15.02 11.61 3.49 7 14.76 10.57 3.65 8 14.39 11.60 3.28 9 15.08 11.05 3.46 10 14.81 13.15 3.55平均值/%14.35 11.35 3.62 RSD/%5.14 7.89 7.78
由表2可知，高直链玉米抗性淀粉（7012）、红豆和红薯10 次测定结果的RSD 不超过10%，表明方法精密度好，能满足食品中抗性淀粉含量测定结果对于重复性的要求（不超过10%）。
2.4.2 方法的准确度
方法的准确度结果见表3。
表3 方法的准确度
Table3 Accuracy of the method
样品质控样品抗性淀粉含量/%1 38.99 2 42.02 3 39.06平均值/%40.02标示值/%39.00测定值与标示值间的误差/%2.62
由表3可知，质控样品中抗性淀粉含量测定值与标示值间的误差为2.62%，表明方法准确度高，可以满足要求（不超过10%）。
2.4.3 方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）
方法的检出限和定量限结果见表4。
表4 方法的检出限和定量限
Table4 Detection limit and quantitative limit of the method
样品杂粮粥黄豆白菜苹果抗性淀粉含量/%1 0.334 0.113 0.123 0.043 2 0.338 0.097 0.118 0.060 3 0.320 0.105 0.141 0.063 4 0.420 0.089 0.110 0.048 5 0.456 0.081 0.115 0.042 6 0.456 0.073 0.132 0.062 7 0.337 0.089 0.092 0.045 8 0.324 0.081 0.097 0.046 9 0.402 0.098 0.101 0.042 10 0.336 0.113 0.125 0.045平均值/%0.372 0.094 0.115 0.05标准偏差/%0.055 0.014 0.016 0.009 LOD/%0.537 0.136 0.163 0.077 LOQ/%0.922 0.234 0.275 0.140
由表4可知，杂粮粥的检出限、定量限均最高，分别为0.537%、0.922%，因此确定该方法中抗性淀粉含量的检出限为0.6%，定量限为1.0%。
2.5 样品中抗性淀粉含量
不同食品中抗性淀粉含量如表5所示。
表5 不同食品中抗性淀粉含量
Table5 Content of resistant starch in different foods
样品高直链玉米粉祥玉1945甘薯抗性淀粉高抗性淀粉米淀粉摩棒蛋糕马铃薯淀粉高直链玉米抗性淀粉1豆粉豆浆高直链玉米抗性淀粉（7012）苏打饼干小麦粉红豆玉米粉功能稻米四季豆红薯芋头马铃薯抗性淀粉含量/%15.00±0.51 44.96±0.57 2.09±0.08 7.04±0.28 30.72±0.57 4.43±0.19 71.38±1.07 66.20±1.58 3.71±0.19 0.61±0.05 14.82±0.67 0.93±0.06 2.44±0.18 10.94±0.56 17.44±0.76 13.23±0.44 1.30±0.10 3.34±0.30 4.70±0.29 6.79±0.63 RSD/%3.40 1.27 3.83 3.98 1.86 4.29 1.50 2.39 5.12 8.20 4.52 6.45 7.38 5.12 4.36 3.33 7.69 8.98 6.17 9.28
由表5可知，马铃薯淀粉中抗性淀粉含量最高，为71.38%，高直链玉米抗性淀粉1 中抗性淀粉含量仅次于马铃薯淀粉，为66.20%。各样品3 次独立测定结果的RSD 均小于10%，表明该方法适用于食品中抗性淀粉含量的测定。
3 结论
本研究通过规定测试所用的试剂材料、仪器、取样、分析步骤等关键测试要素，建立了一个能够对食品中的抗性淀粉含量进行测定的分光光度法。去除非抗性淀粉的最佳条件为添加α‐胰腺淀粉酶30 U/mL+淀粉葡萄糖苷酶3 U/mL，于37 ℃水浴振荡水解16 h，50%乙醇溶液洗涤2 次。水解抗性淀粉的最佳条件为添加3 260 U/mL 淀粉葡萄糖苷酶0.10 mL 于50 ℃水浴振荡水解30 min。所建立方法在选择性、精密度、准确性、检测限和分析效率较好，具有准确性高、重现性好的优点。
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