凤冈锌硒茶是贵州特色茶类之一，其主要产区集中于贵州省凤冈县，因茶叶中含有的锌、硒微量元素是人体所需的适宜量，且在浸泡后析出可被人体吸收，2006 年1 月24 日国家质检总局批准对“凤冈富锌富硒茶”实施地理标志产品保护。由于茶树品种、产地和采制方法的不同，凤冈锌硒茶形成了独具特色的品质特征：成品外形扁平直滑，色泽翠绿或谷黄、汤色翠黄绿，香气呈栗香，滋味醇和甘甜。
目前对于凤冈锌硒茶的加工过程研究较少，大多数研究集中在其活性的作用机制[1]，如Yu 等[2]研究凤岗锌硒茶对高糖高脂饮食诱导肥胖大鼠代谢综合征的保护作用；也有学者通过电子鼻中的Loadings 分析发现氮氧化合物、萜烯类、硫化物、芳香类化合物、烷烃类化合物传感器在湄潭翠芽茶、石阡苔茶、凤冈锌硒茶、都匀毛尖的鉴别中起到主要作用[3]。近年来，指纹图谱在中药、中成药等质量控制和评价等方面均发挥重要作用[4‐5]，茶叶中的成分信息与中药类似[6‐7]，因此可以通过借鉴指纹图谱的研究经验对凤冈锌硒茶的加工过程进行研究，从整体性方面对凤冈锌硒茶加工过程中茶叶的品质以及加工工艺进行评价。
香气对茶叶品质至关重要，其主要由挥发性组分决定[8]。挥发性组分的成分类别、含量主要由原料和加工技术等因素决定[9‐11]。目前凤冈锌硒茶在顶空固相微萃取（headspace solid‐phase microextraction，HS‐SPME）和气相色谱（gas chromatography，GC）方面的研究较少[12]，鲜见指纹图谱应用于凤冈锌硒茶质量控制方面的研究。基于此，为探究凤冈锌硒茶加工过程中组分的变化情况，以凤冈锌硒茶的鲜叶、杀青叶、成品茶为研究对象，基于HS‐SPME‐GC 技术对凤冈锌硒茶加工过程中挥发性组分进行测定，并建立凤冈锌硒茶的GC 指纹图谱，利用聚类分析（cluster analysis，HCA）、主成 分分析（principal comp‐onent analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS‐DA）法对凤冈锌硒茶加工前后的共有峰进行判定、区分和筛选，探究加工过程中凤冈锌硒茶挥发性组分的差异，以期为综合评价凤冈锌硒茶的品质、生产及质量控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香叶醇（纯度98.3%）：德国Dr.Ehrenstorfer 公司；芳樟醇（纯度98.4%）：上海安谱实验科技股份有限公司。凤冈锌硒茶鲜叶（编号为Y1～Y10）、杀青叶（编号为B1～B10）、成品茶（编号为C1～C10）各10 批，2023 年4 月采集于贵州省遵义市凤冈县。
1.2 仪器与设备
7890B 型气相色谱仪：美国Agilent 公司；DF‐101S集热式恒温磁力加热搅拌器、顶空进样瓶、固相微萃取手动进样手柄、50/30µm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取针：美国Sup‐elco 公司：Milli‐Q 超纯水制备系统：美国Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
取鲜叶、杀青叶、成品茶各0.5 g，加入搅拌子，加入3 mL 超纯水，置于恒温磁力加热搅拌器，加热至80 ℃并恒温保持，转速500 r/min，用50/30µm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取针进行萃取，萃取加热60 min，手动进样。
1.3.2 色谱条件
采用Agilent J＆W GC Columns HP‐5 色谱柱（30 m×0.320 mm，0.25µm），进样口温度为250 ℃，不分流，流速为1 mL/min，氢火焰离子化检测器温度为260 ℃，升温程序见表1。
表1 升温程序
Table1 Temperature rise programming
速率/（℃/min）0 2 4 20温度/℃40 70 200 250保留时间/min 5 10 0 5运行时间/min 5 30 62.5 70
1.4 数据处理
相似度采用《中药指纹图谱相似度评价系统（2012版）》中的方法进行计算；数据统计采用Excel 2021 软件，结果采用相对百分含量表示；图表绘制采用Origin 2018 软件；聚类分析和主成分分析采用SPSS26.0 软件计算；正交偏最小二乘法回归分析采用SIMCA 14.1软件。
2 结果与分析
2.1 凤冈锌硒茶鲜叶、杀青叶、成品茶3 个阶段指纹图谱
将凤冈锌硒茶的气相色谱数据导入中药指纹图谱相似度评价软件，所有样品的指纹图谱如图1所示，相似度结果如表2所示。
图1 凤冈锌硒茶鲜叶、杀青叶、成品茶的指纹图谱
Fig.1 Fingerprints of fresh leaves，inactivated leaves，and finished product of Fenggang zinc‐selenium tea
a.鲜叶；b.杀青叶；c.成品茶。峰上数字为共有峰编号。
表2 凤冈锌硒茶鲜叶、杀青叶、成品茶加工阶段各自的相似度
Table2 Individual similarities between fresh leaves，inactivated leaves，and finished product of Fenggang zinc‐selenium tea at different processing stages
编号Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10相似度0.852 0.918 0.933 0.933 0.984 0.893 0.991 0.979 0.909 0.993编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10相似度0.941 0.931 0.879 0.902 0.971 0.962 0.959 0.975 0.751 0.974编号C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10相似度0.957 0.969 0.985 0.932 0.936 0.962 0.837 0.977 0.945 0.957
由图1和表2可知，鲜叶、杀青叶、成品茶3 个加工阶段的凤冈锌硒茶样品的相似度均大于0.7，其中鲜叶有35 个共有峰，杀青叶有26 个共有峰，成品茶有29 个共有峰，表明在不同加工阶段凤冈锌硒茶样品较为稳定。
2.2 凤冈锌硒茶不同加工过程中的相似度比较
将鲜叶、杀青叶、成品茶的1 号样品作为代表进行指纹图谱绘制，结果见图2。30 批不同加工过程的凤冈锌硒茶进行相似度评价，结果见表3。
图2 凤冈锌硒茶不同加工过程中的代表物质的指纹图谱
Fig.2 Fingerprint spectra of representative substances in different processing of Fenggang zinc‐selenium tea
a.对照品；b.代表物质。R 为对照图谱；峰上数字为共有峰序号。
表3 凤冈锌硒茶不同加工过程相似度
Table3 Similarity of different processing processes of Fenggang zinc‐selenium tea
编号Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10相似度0.821 0.894 0.914 0.936 0.970 0.861 0.970 0.959 0.907 0.969编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10相似度0.987 0.978 0.868 0.888 0.957 0.973 0.972 0.981 0.814 0.974编号C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10相似度0.973 0.980 0.964 0.930 0.897 0.936 0.883 0.986 0.951 0.974
由图2和表3可知，相似度结果均大于0.8，共有21 个共有峰，其中3 号共有峰为芳樟醇，9 号共有峰为香叶醇，结果表明加工过程中凤冈锌硒茶的主要挥发性物质散失较少，加工工艺较为成熟稳定。
2.3 聚类分析
通过SPSS 26.0 软件对30 批不同加工阶段的凤冈锌硒茶指纹图谱21 个共有峰的峰面积进行聚类分析，结果见图3。
图3 凤冈锌硒茶样品聚类分析树状图
Fig.3 Cluster analysis dendrogram of Fenggang zinc‐selenium tea samples
纵轴数字1～10 代表鲜叶（依次编号Y1～Y10）、11～20 代表杀青叶（依次编号B1～B10）、21～30 代表成品茶（依次编号C1～C10）。
由图3可知，不同加工过程的峰面积（即成分含量）存在一定差异。当临界值为15 时，30 批样品大致可分为三大类：杀青叶、成品茶为第一类；鲜叶的1、2、6、9 号样品为第二类，剩余的鲜叶样品为第三类。说明采摘工艺以及茶树生长年限等可能对凤冈锌硒茶鲜叶产生一定的影响，但是经过加工后，凤冈锌硒茶的挥发性成分基本稳定。
2.4 主成分分析
主成分分析是在尽可能保持原有数据信息的前提下，通过降维处理达到简化指标的计量学方法[13‐14]。将30 批凤冈锌硒茶样品的21 个共有峰峰面积导入SPSS 26.0 软件，进行主成分分析，结果见表4。
表4 特征根、各主成分的贡献率
Table4 Contribution rate of characteristic roots and principal components
成分1 2 3 4 5 6初始特征值总计9.135 2.242 1.910 1.801 1.146 1.048方差百分比43.498 10.676 9.095 8.577 5.458 4.989累积贡献率/%43.498 54.174 63.269 71.846 77.304 82.293提取载荷平方和总计9.135 2.242 1.910 1.801 1.146 1.048方差百分比43.498 10.676 9.095 8.577 5.458 4.989累积贡献率/%43.498 54.174 63.269 71.846 77.304 82.293
由表4可知，提取特征值大于1 的6 个成分，其方差的累积贡献率为82.293%，表明这6 个成分能够代表21个指标在这批样品中大部分的信息。
通过将各特征向量标准化后，将共有峰数据导入SIMCA 14.1 软件，由PC1（43.498%）和PC2（54.174%）为坐标轴构建PCA 得分散点图见图4。
图4 30 批凤冈锌硒茶样品PCA 得分图
Fig.4 PCA score chart of 30 batches of Fenggang zinc‐selenium tea
由图4可以看出，加工前后的凤冈锌硒茶样品明显分开，加工后的20 批凤冈锌硒茶样品被归为一类，与HCA 结果完全一致。
2.5 OPLS‐DA 结果
为了更好地分析加工过程中凤冈锌硒茶样本之间的差异，采用SMICA 14.1 软件对30 批凤冈锌硒茶21 个共有峰进行OPLS‐DA，模型的拟合效果通过
这3 个指标来评价，指标大于0.5 表示较为可信，并且越接近1 说明模型的拟合效果越好[15‐16]。将杀青叶、成品茶的凤冈锌硒茶样品作为1 组，鲜叶作为另外一组，其R2X 为0.576，R2Y 为0.982，Q2 为0.932，其值均大于0.5，表明其模型具有较好的预测能力。OPLS‐DA 得分图如图5所示。
图5 30 批凤冈锌硒茶样品OPLS‐DA 得分图
Fig.5 OPLS‐DA score plots of 30 batches of Fenggang zinc‐selenium tea
由图5可知，鲜叶和杀青叶、成品茶被区分。对模型进行验证，设定检验数为200 次，结果如图6所示。
图6 30 批凤冈锌硒茶样品OPLS‐DA 模型的置换验证
Fig.6 OPLS‐DA permutation test of 30 batches of Fenggang zinc‐selenium tea
由图6可知，左边的R2 点和Q2 点均低于右边，Q2 点的回归线与纵轴相交于原点以下，表明未产生过分拟合，模型可靠。30 批凤冈锌硒茶样品21 个共有峰的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值见图7和表5。
图7 30 批凤冈锌硒茶样品21 个共有峰的VIP 值
Fig.7 VIP values of 21 common peaks of 30 batches of Fenggang zinc‐selenium tea
表5 VIP 值
Table5 Variable importance in projection values
编号6 2 1 5 1 1 3 8 16 14 17 10 19 18 5 21 20 11 12 9 4 3 7 VIP 值1.37 1.36 1.29 1.28 1.23 1.21 1.15 1.14 1.07 1.04 0.99 0.95 0.89 0.85 0.79 0.77 0.72 0.69 0.50 0.41 0.37 Y 误差0.18 0.11 0.52 0.39 0.46 0.60 0.40 0.43 0.40 0.22 0.69 0.39 0.49 0.46 0.56 0.56 0.41 0.85 0.47 0.54 0.58
由图7和表5可知，根据VIP 值大于1 筛选出10 种差异标志物。通常来说，VIP 值大于1 的香气成分被认为是导致组间差异的关键香气成分。而3 号峰为芳樟醇，9 号峰为香叶醇，但3 号和9 号峰并未出现在VIP 值大于1 的色谱峰中，说明芳樟醇和香叶醇两种挥发性成分较为稳定，不是区分不同加工阶段的主要挥发性成分。
3 讨论与结论
本研究以凤冈锌硒茶鲜叶、杀青叶、成品茶为研究对象，收集30 批不同加工过程的凤冈锌硒茶样品进行指纹图谱研究，并通过相似度分析、HCA、PCA 以及OPLS‐DA 综合评价凤冈锌硒茶不同加工过程的差异性。
采用顶空固相微萃取对30 批不同加工过程的凤冈锌硒茶的样品进行富集，通过气相色谱对其进行检测，将其图谱导出后建立凤冈锌硒茶指纹图谱，结合化学模式识别法分析，对凤冈锌硒茶醇类中的2 种挥发性成分（芳樟醇、香叶醇）于同一气相色谱条件下进行指认，且9 号共有峰（香叶醇）在指纹图谱中的响应最高，在挥发性组分的研究中醇类挥发性化合物常带有特殊的花香和果香[17‐18]，这也对凤冈锌硒茶香气形成有着关键作用。在指纹图谱相似度分析中，对鲜叶、杀青叶、成品茶的各10 批样品进行相似度评价，其结果显示凤冈锌硒茶在3 个阶段各自的相似度均高于0.7，表明各加工过程的样品较为稳定，但各阶段的各批次凤冈锌硒茶样品之间化学成分含量存在一定差异。将收集的30 批不同加工过程凤冈锌硒茶样品进行总相似度评价，其相似度高于0.8，表明加工前后的30 批凤冈锌硒茶的化学成分组成较为相似，主要的成分损失较少。通过计算21 个共有峰的相对百分含量，芳樟醇在加工前的鲜叶阶段相对含量为（8.13±3.26）%，杀青和成品阶段的相对含量分别为（12.03±2.83）%、（9.07±1.68）%，香叶醇在鲜叶阶段的相对含量为（19.64±8.58）%，杀青和成品阶段的相对百分含量分别为（18.21±6.46）%、（20.18±4.52）%，说明凤冈锌硒茶在整体加工过程中样品的相对百分含量较为稳定。
HCA 和主成分分析结果显示，加工后的凤冈锌硒茶样品聚为第一类，鲜叶的1、2、6、9 号凤冈锌硒茶样品聚为第二类，剩余的鲜叶样品聚为第三类；在加工（杀青）后其样品差别较小，说明杀青是凤冈锌硒茶加工过程中的关键工序，同时可能因杀青等一系列的加工工艺而产生的酶促和热裂解、美拉德反应、机械损伤胁迫等作用[19‐21]，使凤冈锌硒茶在加工前后产生差异。由于本研究凤冈锌硒茶样本均为凤冈县内的茶园采摘，其采摘工艺、不同茶树生长年限等信息均会影响聚类分析的结果。通过OPLS‐DA，凤冈锌硒茶加工过程中挥发性成分的变化主要是在杀青阶段发生，其结果与HCA、PCA 的结果相互印证，说明这个阶段对品质影响较大，经过摊青、杀青等一系列的加工后，凤冈锌硒茶样品基本稳定，表明凤冈锌硒茶的加工工艺较为稳定可靠。
本研究可为凤冈锌硒茶的质量控制全面化、规范化、标准化提供参考依据，为加工过程中茶凤冈锌硒茶质量差异性评价提供科学方法。基于以上研究，可为后续加工前后凤冈锌硒茶的差异性成分深入分析提供思路。
[1] 王晓宁,赵茹茹,张建永.基于代谢组学技术研究凤冈锌硒茶对正常大鼠机体代谢调节规律[J]. 食品工业科技, 2020, 41(6):99‐105.WANG Xiaoning, ZHAO Ruru, ZHANG Jianyong. Global meta‐bolic regulation of Fenggang zinc‐selenium tea in normal rat based on metabolomics technology[J].Science and Technology of Food In‐dustry,2020,41(6):99‐105.
[2] YU J, YANG J, LI M Z, et al. Protective effects of Chinese Feng‐gang zinc selenium tea on metabolic syndrome in high‐sucrose‐high‐fat diet‐induced obese rats[J].Scientific Reports,2018,8(1):3528.
[3] 罗冬兰,邵勇,巴良杰,等.贵州四种名优茶叶的电子鼻鉴别与香气成分分析[J].保鲜与加工,2020,20(3):183‐190.LUO Donglan, SHAO Yong, BA Liangjie, et al. Electronic nose identification and analysis of aroma components of four famous and excellent teas in Guizhou[J].Storage and Process,2020,20(3):183‐190.
[4] 文阳,海来约布,蔡晓霞,等.基于指纹图谱结合化学模式识别对接骨草的质量评价[J].中草药,2023,54(24):8206‐8213.WEN Yang, HAI Laiyuebu, CAI Xiaoxia, et al. Evaluation of qual‐ity markers of Sambucus javanica based on fingerprint and chemi‐cal pattern recognition[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,2023,54(24):8206‐8213.
[5] 吴晶,周萍,杨怀镜.云南不同产地红花挥发性成分气相指纹图谱研究[J].食品研究与开发,2020,41(6):43‐47.WU Jing, ZHOU Ping, YANG Huaijing. Study on gas phase finger‐print of volatile constituents from Carthamus safflower from differ‐ent areas in Yunnan Province[J]. Food Research and Development,2020,41(6):43‐47.
[6] 范方媛,徐鹏程,李春霖,等.基于HPLC 多元指纹图谱的龙井茶产地判别研究[J].中国食品学报,2019,19(10):278‐285.FAN Fangyuan, XU Pengcheng, LI Chunlin, et al. Studies on geo‐graphical discrimination of Longjing teas based on multiple HPLC fingerprints[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2019,19(10):278‐285.
[7] JIN G,ZHU Y Y,CUI C J,et al.Tracing the origin of Taiping Hou‐kui green tea using 1H NMR and HS‐SPME‐GC‐MS chemical fin‐gerprints, data fusion and chemometrics[J]. Food Chemistry, 2023,425:136538.
[8] 李炫烨,陈思,刘毓婕,等.基于顶空固相微萃取‐气相色谱‐飞行时间质谱联用技术分析固样方法对茶叶挥发性成分的影响[J].食品与发酵工业,2022,48(16):257‐263.LI Xuanye, CHEN Si, LIU Yujie, et al. Effect of drying methods on volatile compounds of tea leaves based on headspace solid‐phase microextraction coupled with gas chromatography time‐of‐flight mass spectrometry[J]. Food and Fermentation Industries, 2022, 48(16):257‐263.
[9] 孙红玉,陈义琴,石琳琳,等.不同产地金花白茶滋味代谢物组成及差异分析[J].食品研究与开发,2023,44(16):177‐184.SUN Hongyu, CHEN Yiqin, SHI Linlin, et al. Taste metabolite composition and differences of Jinhua white tea from different ori‐gins[J].Food Research and Development,2023,44(16):177‐184.
[10] 向昊,LI Zhenfeng,宋飞虎,等.基于电子鼻和GC‐MS 的不同烘焙条件铁观音品质分析及其鉴别[J].安徽农业大学学报,2023,50(4):721‐730.XIANG Hao,LI Zhenfeng,SONG Feihu,et al.Quality analysis and identification of Tieguanyin with different baking treatments based on electronic nose and GC‐MS[J]. Journal of Anhui Agricultural University,2023,50(4):721‐730.
[11] FANG Q T, LUO W W, ZHENG Y N, et al. Identification of key aroma compounds responsible for the floral ascents of green and black teas from different tea cultivars[J]. Molecules, 2022, 27(9):2809.
[12] 何婷,吴其妹,向丽萍,等.凤冈锌硒茶挥发性成分提取及其香气成分分析[J].食品工业科技,2023,44(18):342‐351.HE Ting, WU Qimei, XIANG Liping, et al. Extraction of volatile compounds and analysis of aroma characteristics in Fenggang zinc‐selenium tea[J].Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):342‐351.
[13] WANG Y S, FANG M Z, ZHENG S D, et al. Identification of Chi‐nese green tea (Camellia sinensis) marker metabolites using GC/MS and UPLC‐QTOF/MS[J].Food Science and Biotechnology,2021,30(10):1293‐1301.
[14] DAI Q Y, LIU S T, JIANG Y R, et al. Recommended storage tem‐perature for green tea based on sensory quality[J]. Journal of Food Science and Technology,2019,56(9):4333‐4348.
[15] ZOU Y S,TANG C,YANG X Y,et al.Discovery and flavor charac‐terization of high‐grade markers in baked green tea[J]. Molecules,2023,28(6):2462.
[16] LU X F, LIN Y Y, TUO Y M, et al. Optimizing processing tech‐niques of oolong tea balancing between high retention of catechins and sensory quality[J].Foods,2023,12(23):4334.
[17] YANG P, SONG H L, LIN Y P, et al. Differences of characteristic aroma compounds in Rougui tea leaves with different roasting tem‐peratures analyzed by switchable GC‐O‐MS and GC×GC‐O‐MS and sensory evaluation[J].Food&Function,2021,12(11):4797‐4807.
[18] SONG N E, KIM M K, LEE K G, et al. Analysis of volatile com‐pounds in rooibos tea (Aspalathus linearis) using different extrac‐tion methods and their relationship with human sensory perception[J].Food Research International,2021,141:109942.
[19] LIU H C,XU Y J,WU J J,et al.GC‐IMS and olfactometry analysis on the tea aroma of Yingde black teas harvested in different seasons[J].Food Research International,2021,150:110784.
[20] 曾淋,毛雅琳,汪芳,等.不同遮荫方式及加工工艺对碾茶品质的影响[J].食品研究与开发,2023,44(15):118‐126.ZENG Lin, MAO Yalin, WANG Fang, et al. Effects of different shading treatments and processing techniques on the quality of tencha[J].Food Research and Development,2023,44(15):118‐126.
[21] QI K K,XU M G,YIN H,et al.Online monitoring the key interme‐diates and volatile compounds evolved from green tea roasting by synchrotron radiation photoionization mass spectrometry[J]. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2021, 32(6): 1402‐1411.