莲芯（Lotus plumule）由睡莲科睡莲属植物莲（Ne⁃lumbo nucifera Gaertn.）成熟种子中间的绿色胚去除子叶后所得[1]。《本草纲目》中记载其性味苦寒，归属于心肺肾三经，具有清心去热、固精止血等功效[2]。莲芯中含有21 种生物碱类化合物[3]，主要活性成分为甲基莲心碱、异莲心碱、莲心碱、前荷叶碱和莲心季铵碱等，均为异喹啉类生物碱[4]。其中含量较高的是甲基莲心碱、异莲心碱和莲心碱[5]，这3 种双苄基异喹啉类生物活性成分已被证实具有显著的抗心律失常、抗缺血以及降压等生理活性[6‐9]，并且已经成为现代中医药领域的一个重要研究热点之一。
调味是白酒生产过程中的最后一道工序，使用少量的调味酒来增强或调整基础酒的口感和香气，使其更加完美和协调[10]。调味所用的调味酒通常具有独特风格的香气或口感，例如特甜、特香、特醇、特浓等，在调制过程中起着重要作用[11]。我国传统白酒一直采用调味酒进行调配。近年来，人们从各种传统草药、水果和野生植物中提取相应成分，并将其应用于各类白酒的调味中[12]。李意等[13]采用冷凝回流浸提工艺生产出别具风格的罗汉果白酒调味液；郭蔓等[14]以肉苁蓉为原料制备了一款提升白酒功能的肉苁蓉白酒调味液。然而莲芯作为药食同源的物质，用其生产白酒调味液的研究鲜见报道。
本研究以冷凝回流的方式浸提莲芯生产莲芯白酒调味液，通过优化浸提工艺和澄清操作条件，得到一款莲芯白酒调味液，以期为研发新型白酒调味液提高白酒多样性以及提升白酒品质提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
莲芯：市售；食用酒精：天津市冠达实业总公司宁河县酒精厂；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：天津康科德科技有限公司；无水甲酸（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；甲基莲心碱标准品：北京索莱宝科技有限公司；活性炭：宁夏万盛工贸有限公司；明胶、硅藻土、壳聚糖、干酪素：山东万邦化学工业有限公司。
1.2 主要仪器与设备
SY‐1‐4 数显式电热恒温水浴锅：天津欧诺仪器股份有限公司；TDZ5‐WS 低速多管架自动平衡离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1260 型高效液相色谱仪（配有紫外检测器）：美国安捷伦公司；XL‐60C高速中药粉碎机：天津华鑫仪器厂；DH‐101 型电热恒温鼓风干燥箱：天津市中环实验电炉有限公司；UV3600Plus 紫外可见近红外分光光度计：日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 莲芯提取液提取工艺
工艺流程：莲芯→洗净→烘干→粉碎→浸提→分离→澄清→过滤→成品。
1.3.2 操作要点
1）将莲芯进行清洗，然后放入58 ℃干燥箱处理5 h，直至莲芯被烘干。
2）将烘干后的莲芯放入粉碎机中粉碎后，过40 目筛。
3）取粉碎过的莲芯粉末，按一定的比例加入食用酒精，用冷凝回流装置进行浸提，提取结束后，4 000 r/min离心20 min，将上清液和沉淀分离，得到提取液[15]。
4）在提取液中加入澄清剂，处理一段时间后以4 000 r/min 离心20 min，得到澄清透亮的莲芯提取液。
1.3.3 莲芯提取液表征物的选取
莲芯中共有21 种生物碱，其中以甲基莲心碱的含量最高，因此本研究中选取甲基莲心碱作为莲芯提取液中的表征物。提取量以从每克莲芯中提取得到的甲基莲心碱的量计算，以mg/g 表示。
1.3.4 甲基莲心碱标准曲线绘制
精确称取10 mg 甲基莲心碱标准品置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成1 000µg/mL 甲基莲心碱标准储备液。准确量取甲基莲心碱标准储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成20、40、60、80、100µg/mL 的甲基莲心碱标准溶液。将标准溶液注入高效液相色谱仪中分析，以甲基莲心碱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
采用高效液相色谱仪，配StableBond Anaiytical SB‐C18（5µm，4.6 mm×150 mm）色谱柱进行检测，检测条件：0.3% 三乙胺水溶液∶乙腈=2∶1（体积比）（A）‐甲醇（B）为流动相，洗脱过程为初始A 40%、B 60%，0～10 min；A 40%～20%、B 60%～80%，10～13 min；A 20%、B 80%，13～15 min，检测波长282 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，进样量10µL。
1.3.5 莲芯白酒调味液浸提工艺优化
1.3.5.1 料液比对甲基莲心碱提取效果
在固定浸提温度60 ℃、浸提时间2 h、乙醇浓度60% 的条件下，考察不同料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]对甲基莲心碱的提取效果。
1.3.5.2 浸提时间对甲基莲心碱提取效果
在固定浸提温度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）、乙醇浓度60%的条件下，考察不同浸提时间（1、2、3、4、5 h）对甲基莲心碱的提取效果。
1.3.5.3 乙醇浓度对甲基莲心碱提取效果
在固定浸提温度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）、浸提时间4 h 的条件下，考察不同乙醇浓度（60%、65%、70%、75%、80%）对甲基莲心碱的提取效果。
1.3.5.4 浸提温度对甲基莲心碱提取效果
在固定料液比1∶50（g/mL）、乙醇浓度70%，浸提时间2 h 的条件下，考察不同浸提温度（40、50、60、70、80 ℃）对甲基莲心碱的提取效果。
1.3.5.5 正交试验
根据单因素试验结果，选择料液比、乙醇浓度、浸提时间以及浸提温度进行四因素三水平的正交试验，对浸提工艺进行优化。正交试验因素与水平如表1所示。
表1 正交试验因素水平
Table1 Factors and levels of orthogonal test
水平1 2 3 A 料液比/（g/mL）1∶40 1∶50 1∶60 B 乙醇浓度/%65 70 75 C 浸提时间/h 2 3 4 D 浸提温度/℃50 60 70
1.3.6 莲芯白酒调味液澄清工艺优化
1.3.6.1 澄清剂种类对提取液的澄清效果的影响
选取明胶、活性炭、硅藻土、壳聚糖和干酪素5 种澄清剂[16]，按0.8 g/L 添加到莲芯提取液中，混合均匀后，在25 ℃下静置24 h。取上清液测定透光率，通过比较5 种澄清剂的透光率，优选出最佳澄清剂，试验平行操作3 次。
1.3.6.2 硅藻土澄清工艺单因素试验
1）硅藻土添加量对澄清效果的影响
固定静置温度为25 ℃，静置时间为24 h，硅藻土分别按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L 加入到提取液中，取上清液在波长520 nm 处测透光率，波长480 nm 处测色度，确定硅藻土的最适添加量。
2）静置时间对澄清效果的影响
固定静置温度为25 ℃，硅藻土添加量为0.6 g/L，静置时间分别按照4、8、12、16、20、24、28 h 室温静置，取上清液在波长520 nm 处测透光率，波长480 nm 处测色度，确定硅藻土的最适处理时间。
3）静置温度对澄清效果的影响
固定静置时间为20 h，硅藻土添加量为0.6 g/L，静置温度分别按照15、20、25、30、35 ℃室温静置，取上清液在波长520 nm 处测透光率，波长480 nm 处测色度，确定硅藻土的最适处理温度。
1.3.6.3 正交试验
在单因素水平分析，即硅藻土添加量、静置温度和静置时间对调味液澄清效果的影响的基础上，以硅藻土添加量、静置温度和静置时间为影响因素，用透光率和色度综合考察硅藻土对提取液澄清效果的影响，设计三因素三水平正交试验，试验设计见表2。
表2 澄清工艺的正交试验因素水平
Table2 Factors and levels for clarification of orthogonal test
水平1 2 3 A 硅藻土添加量/（g/L）0.4 0.6 0.8 B 静置时间/h 20 24 28 C 静置温度/℃20 25 30
1.3.7 指标测定
1.3.7.1 色度测定
以蒸馏水为对照，吸取上清液，加入到光程1 cm石英比色皿中，测定480 nm 波长处的吸光度（即色度）。
1.3.7.2 澄清度测定
以蒸馏水为对照，吸取上清液，加入到光程1 cm石英比色皿中，测定520 nm 波长处的吸光度，计算透光率[17]，计算公式如下。
T = 10-A × 100
式中：T 为澄清度，%；A 为样品在520 nm 处的吸光度。
1.4 数据统计分析
所有试验均平行操作3 次，结果以平均值表示，采用SPSS 25.0、Origin 9.0、Excel 2013 等软件进行数据处理及图形绘制。
2 结果与分析
2.1 甲基莲心碱标准曲线测定
依据标准品的色谱分析结果，以甲基莲心碱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，如图1所示。
图1 甲基莲心碱标准曲线
Fig.1 Methyl liensinine standard curve
由图1可知，甲基莲心碱浓度与峰面积之间的线性回归方程为y=7.786 2x-2.419 3，（R2=0.999），线性关系良好，满足分析要求。
2.2 浸提条件对浸提效果的影响
2.2.1 单因素试验结果
单因素试验结果见图2。
图2 单因素对浸提效果的影响
Fig.2 Influence of single factor on extraction effect
A.料液比；B.浸提时间；C.浸提温度；D.乙醇浓度。
由图2A可知，莲芯提取液中的甲基莲心碱提取量随溶剂体积的增加先增大后趋于平稳，当料液比达到1∶50（g/mL）后，甲基莲心碱的提取量增加变得缓慢，综合考虑成本和后期的使用效果，料液比1∶50（g/mL）是较合适的操作条件。
由图2B可知，甲基莲心碱的提取量和浸提时间在3 h 之前呈正相关，在3 h 达到最大值，之后逐渐降低，这可因为较长时间的高温导致甲基莲心碱的结构被破坏从而导致提取量下降[18]。因此，适宜的浸提时间为3 h。
由图3C可知，浸提温度低于60 ℃时，莲芯提取液中甲基莲心碱的提取量随着浸提温度的增加逐渐增加；当浸提温度达到60 ℃时，甲基莲心碱提取量达到最大。然而，在浸提温度超过60 ℃时，甲基莲心碱的提取量逐渐下降。这可能因为高温环境导致甲基莲心碱分子结构不稳定，发生分解[18]。因此，适宜的浸提温度为60 ℃。
图3 澄清剂种类对分离效果的影响
Fig.3 Influence of clarifying agent type on separation effect
由图2D可知，甲基莲心碱提取量随乙醇浓度的增大呈现先增大后减小的趋势，这和甲基莲心碱在有机相物中溶解度增加一致，考虑到高浓度乙醇在高温下提取的危险性，选取乙醇浓度70% 作为适宜浓度。
2.2.正交试验结果与分析
根据单因素试验结果，以甲基莲心碱提取量为评价指标，进行正交试验，结果见表3。方差分析结果见表4。
表3 正交试验方案及结果
Table3 Orthogonal test schemes and results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R A 料液比1 1 1 2 2 2 3 3 3 20.689 3 22.605 2 20.922 7 6.896 4 7.535 1 6.974 2 0.638 6 B 乙醇浓度1 2 3 1 2 3 1 2 3 19.521 1 22.252 4 22.443 7 6.507 0 7.417 5 7.481 2 0.974 2 C 浸提时间1 2 3 2 3 1 3 1 2 19.633 2 20.693 4 23.890 6 6.544 4 6.897 8 7.963 5 1.419 1 D 浸提温度1 2 3 3 1 2 2 3 1 22.902 4 20.128 8 21.186 0 6.709 6 7.634 1 7.062 0 0.924 5甲基莲心碱提取量/（mg/g）6.176 2 6.515 6 7.997 5 6.596 2 9.144 5 6.864 5 6.748 7 6.592 4 7.581 7
表4 方差分析结果
Table4 Results of variance analysis
注：*表示影响显著，P<0.05。
方差来源A B C D误差离差平方和0.728 4 1.782 0 3.274 6 1.306 3 0.728 4自由度2 2 2 2 2均方0.364 2 0.891 0 1.637 3 0.653 1 F 值0.500 0 1.223 2 2.247 7 0.896 6 F0.1 临界值1.19 1.19 1.19 1.19显著性**
根据表3可以得出，各因素对提取效果的影响主次顺序为C>B>D>A。通过表4可知，B 乙醇浓度、C浸提时间这两个因素，对结果有显著性影响，A 料液比和D 浸提温度对结果的影响不显著。综合表3和表4可得，最优方案为A2B3C3D2，即甲基莲心碱提取液最佳的提取方案为料液比1∶50（g/mL）、乙醇浓度75%、浸提温度60 ℃、浸提时间4 h。该条件下，甲基莲心碱的提取量平均值可达14.365 mg/g，高于正交试验中的最优组合。
2.3 澄清试验条件对莲芯提取液澄清效果的影响
2.3.1 澄清剂的筛选
澄清剂种类对分离效果的影响如图3所示。
由图3可知，5 种澄清剂中，硅藻土的澄清效果优于其它澄清剂，透光率达到98.38%，因此，硅藻土适宜作为莲芯提取液的澄清剂。这主要是因为不同澄清剂的澄清机制有一定的差异[19]。壳聚糖颗粒是一种带有正电荷的多糖，可以结合酒体中带负电荷的浑浊物质，如果胶、鞣酸和电负型蛋白质等，使其形成絮凝物质，加速酒体澄清[20]。硅藻土是一种生物成因的硅质岩石，显微镜下可以观察到特殊的多孔结构，其容重轻、悬浮性能好、吸附性能强，对于果胶、色素、蛋白质、酵母菌等大分子悬浮物具有较好的吸附作用[21]。明胶是一种胶原部分水解后的蛋白质，能与单宁形成絮状沉淀，这些絮状物质可与提取液中的浑浊物凝聚而共沉[22]。干酪素与蛋白质形成络合物沉淀下来，随着络合物的沉降，酒液中的悬浮物颗粒被缠绕而随之沉降下来[23]。活性炭是一种多孔材料，其内部孔隙结构发达，具有比表面积大，可选择性地吸附分子质量大、极性较强以及引起浑浊的物质，因此活性炭对提取液中的杂味及浑浊物有较强的吸附力[24‐25]。
2.3.2 单因素试验条件对莲芯提取液澄清效果的影响各因素对澄清效果的影响见图4。
图4 各因素对澄清效果的影响
Fig.4 Influence of various factors on clarifying effect
由图4A可知，未添加硅藻土时，提取液的透光率仅为88.43%，随着硅藻土添加量的增加，提取液的透光率逐渐增大，然后趋于稳定，色度呈现先减少后趋于稳定的变化。当硅藻土添加量为0.6 g/L 时，提取液的透光性能最好，澄清度最优，透光率为98.42%；继续增加硅藻土的添加量，提取液的透光率和色度不再明显变化，因此，硅藻土的最适添加量为0.6 g/L。
由图4B可知，当静置时间在0～24 h，提取液的透光率呈现升高的趋势，透光性能越来越好，当静置时间超过24 h 时，提取液的透光率趋于稳定，说明24 h 之后，硅藻土和提取液中的部分浑浊物之间的反应结束，沉淀量逐渐稳定。当静置时间为24 h 时，透光率达到最大值98.48%，澄清效果最好。因此，确定选取硅藻土的最适静置时间为24 h。
由图4C可知，随着静置温度的升高，提取液的透光率呈现先上升后缓慢下降的趋势，色度呈现先下降后缓慢上升的趋势。当温度大于25 ℃，提取液的透光率在逐渐降低。这可能是温度过高，降低了硅藻土的吸附作用。在25 ℃时，提取液的透光率效果最好，透光率为98.46%。综合考虑提取液的透光率、色度这两个因素，选取25 ℃作为提取液较优静置温度。
2.3.3 澄清试验因素的正交试验结果与分析
澄清试验因素的正交试验结果与分析见表5。方差分析结果见表6。
表5 正交试验结果
Table5 Orthogonal test results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9透光率色度K1 K2 K3 k1 k2 k3 R K1 K2 K3 k1 k2 k3 R A 硅藻土添加量1 1 1 2 2 2 3 3 3 293.305 294.991 295.067 97.768 98.330 98.356 0.588 0.029 0.022 0.022 0.010 0.007 0.007 0.003 B 静置时间1 2 3 1 2 3 1 2 3 294.123 294.750 294.490 98.041 98.250 98.163 0.209 0.026 0.023 0.024 0.009 0.008 0.008 0.001 C 静置温度1 2 3 2 3 1 3 1 2 294.007 295.275 294.082 98.002 98.425 98.027 0.423 0.026 0.021 0.026 0.009 0.007 0.009 0.002 D（空白）1 2 3 3 1 2 2 3 1 294.331 295.210 293.822 98.110 98.403 97.941 0.170 0.025 0.021 0.027 0.008 0.007 0.009 0.002透光率/%97.468 98.392 97.445 98.283 98.264 98.445 98.373 98.094 98.600色度0.011 0.007 0.011 0.008 0.008 0.007 0.007 0.008 0.006
表6 方差分析结果
Table6 Results of variance analysis
注：*表示影响显著，P<0.05。
指标透光率色度方差来源A B C D（误差）A B C D（误差）离差平方和0.662 0.066 0.337 0.329 0.001 8 0.001 7 0.001 7 0.001 7自由度2 2 2 2 2 2 2 2均方0.331 0 0.033 0 0.168 6 0.164 4 0.000 91 0.000 88 0.000 89 0.000 89 F 值2.013 2 0.201 0 1.025 8 1.011 0 0.991 4 1.000 3显著性* * * *
根据表5可知，影响澄清效果的因素主次顺序为A>C>B。通过表6可知，硅藻添加量和静置温度对结果均具有显著性影响，而静置时间对试验结果的影响显著。综合考虑表5和表6，考虑到色度的数据相差不大且不具有代表性，因此以透光率为参考指标得出正交试验中最优方案为A3B2C2，即硅藻土添加量为0.8 g/L、静置时间24 h、静置温度25 ℃，所得莲芯白酒调味液中甲基莲心碱含量为13.749 mg/L。
3 结论
研究结果表明，提取液最佳浸提工艺条件为料液比1∶50（g/mL）、乙醇浓度75%、浸提温度60 ℃、浸提时间4 h；最佳澄清条件为硅藻土添加量0.8 g/L、静置时间24 h、静置温度25 ℃。通过冷凝回流提取和硅藻土过滤的方法制备莲芯白酒调味液的生产工艺可行。该工艺操作简单，成本低廉。此外，该工艺显著增加了莲芯调味液中活性物质的含量，这为将其应用于制备保健酒等产品奠定了基础，并且可为开发新型调味液提供更好的试验依据。
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