咖啡是世界上重要的农产品之一，咖啡的香气和风味不仅受遗传和环境的影响，还受加工方法的影响。其中，麝香猫咖啡是通过特殊处理获得的优质咖啡豆，它是麝香猫食用咖啡果，经过胃肠道消化和发酵后，只有咖啡皮被消化，而咖啡豆则被排出。麝香猫结肠的发酵作用使咖啡豆拥有独特的香气和风味，通常被描述为泥土味、霉味、糖浆味、柔滑味和巧克力味[1]。相较于普通咖啡，麝香猫咖啡的风味特征是苦味和酸味降低，咖啡味更加醇厚柔和，口感更加丰富。但是这种咖啡加工要圈养棕榈麝香猫，存在动物伦理问题，产能有限，并且受季节控制，只有咖啡鲜果成熟季才能生产，工艺也无法标准化。因此一些研究者尝试通过微生物发酵法生产有独特风味的咖啡。
有研究者用植物乳杆菌发酵咖啡鲜果，发现所试菌株提高了最终咖啡的整体风味[2]。但这种发酵工艺需要在咖啡鲜果产地开展，不易操作。绿咖啡豆是将鲜果进行简单日晒或者水洗处理风干后的产品，可长期保存，是咖啡烘焙工厂的原料，对绿咖啡豆进行发酵则不受地点和季节的影响。可通过筛选菌株和优化发酵条件，来改善咖啡风味，甚至可产生新颖风味的咖啡。有研究表明，用鼠李糖乳杆菌GG 发酵阿拉比卡绿咖啡豆，可产生更强的焦糖味[3]；但是发酵时间过长会导致鼠李糖乳杆菌通过柠檬酸代谢产生过量的醋酸，使酸味过重。有研究发现用乳酸乳球菌发酵可提高咖啡坚果风味[4]。说明发酵咖啡的风味具有菌株依赖性，需要开发更多菌株以获得有良好风味的咖啡。植物乳杆菌、副干酪乳杆菌[5]和魏斯氏菌[6]是麝香猫肠道可分离的乳酸菌菌种[7]，具有用于发酵咖啡豆、产生受欢迎的咖啡风味的潜力，进而提高咖啡豆商业价值。
本研究探讨融合魏斯氏菌（FN015）、副干酪乳杆菌（FN037）、植物乳杆菌（QS029）发酵绿咖啡豆对烘焙后咖啡的风味的改善效果，采用美国精品咖啡协会（Specialty Coffee Association of America，SCAA）杯测法评价。这3 株菌均来自母乳，用于发酵食品有良好的安全性。本研究旨在筛选合适菌株，因此采用单一菌株发酵。通过气相色谱‐质谱联用（gas chromatography‐mass spectrometry，GC‐MS）和超高效液相色谱‐四极杆飞行时间质谱联用技术（ultra‐performance liquid chro‐matography‐quadrupole time‐of‐flight mass spectrometry，UPLC‐Q/TOF）分析这3 株乳酸菌发酵对咖啡豆风味成分和植物化学物构成的影响，以期为乳酸菌作为咖啡发酵剂在绿咖啡豆发酵的应用提供进一步的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
绿咖啡豆（品种：卡蒂姆；加工方式：咖啡鲜果日晒）：云南省临沧市蚂蚁堆乡蚂蚁堆咖啡种植基地。
植物乳杆菌（QS029）、副干酪乳杆菌（FN037）、融合魏斯氏菌（FN015）：青岛大学公共卫生学院菌种库；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国Merck 公司；3‐庚酮（纯度≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MRS 肉汤、琼脂：北京陆桥技术股份有限公司；蛋白胨：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸盐缓冲溶液（phos‐phate buffer saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
1290 Infinity 超高效液相色谱系统联合安捷伦6530Q‐TOF 质谱仪、7890A‐5975C 气相色谱‐质谱联用仪：美国安捷伦科技公司；EK43 咖啡豆研磨机：德国迈赫迪公司；SR0174 实验室咖啡烘焙机：德国博百特公司；101‐2BS 电热鼓风干燥箱：上海力辰邦西仪器科技有限公司；MD‐500 咖啡水分密度分析仪：广州光谱科技有限公司；LX‐165T2R 医用离心机：青岛海尔生物医疗科技有限公司；PHS‐3C pH 计：上海越平科学仪器有限公司；DHP‐9012B 电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵剂
将保存在-80 ℃的植物乳杆菌（QS029）、副干酪乳杆菌（FN037）和融合魏斯氏菌（FN015）解冻，分别在MRS 琼脂培养基划线培养过夜，挑选单菌落接种到MRS 肉汤培养基。在37 ℃下传代培养16 h，连续2 次活化菌株。3 株乳酸菌菌体离心（15 000×g，5 min）分离，用100 mmol/L PBS（每个10 mL）洗涤2 次。随后，在100 mmol/L PBS（10 mL）中重新悬浮，获得咖啡发酵剂。
1.3.2 接种与咖啡发酵
用3 株乳酸菌（QS029、FN015 和FN037）分别进行绿咖啡豆浸没发酵，以未添加接种剂的咖啡豆同样处理作为对照组。即将绿咖啡豆（400 g）和去离子水（800 g）混合并煮沸30 min，后冷却至室温。分别在无菌环境接种3 株乳酸菌（107 CFU/mL，悬浮于20 mL PBS），对照组仅加入PBS。在37 ℃静置发酵24 h。分别在0、6、12、18、24 h 取样5 mL 发酵液和5 g 绿咖啡豆，并测定发酵液pH 值。发酵结束后，弃去发酵液，将绿咖啡豆在45 ℃烘至水分小于12%，密封储存于-20 ℃。
1.3.3 乳酸菌的计数
将5 mL 发酵液和5 g 绿咖啡豆在8 mL 蛋白胨溶液（0.1%，8 mL）中充分混合，用蛋白胨溶液连续10 倍稀释。选取生长30 个左右菌落稀释倍数（5、6、7 倍）的稀释液涂MRS 琼脂平板，37 ℃厌氧培养48 h 后计数菌落。
1.3.4 发酵与未发酵咖啡豆的烘焙
分别准确称取绿咖啡豆或上述发酵的咖啡豆150 g 放入滚筒式咖啡烘焙机中，设置入锅温度为160 ℃，保持火力为1.5，焙炒时间为10 min，即得到中度烘焙咖啡豆。粉碎后过60 目筛，用具有单向排气阀的专用咖啡袋包装密封后置于4 ℃贮存。在15 d 内进行后续分析。
1.3.5 感官分析
参与感官评价的人员有5 名（3 女2 男），年龄20～40 岁，对他们进行咖啡杯测培训。按照《SCAA 杯测手册（2014 版）》进行咖啡杯测。在烘焙咖啡豆之后8～24 h 内进行杯测。杯测前磨粉，70%～75%的颗粒需通过美标20#筛网，并在15 min 内注水。每杯8.50 g 的焙烤咖啡豆粉，注入93 ℃热水150 mL，达到“金杯萃取”的中间值。让每位杯测人员按SCAA 的杯测表格内容进行品鉴打分。评价的感官属性为香气、风味、酸度、醇厚度、平衡感（风味、余韵、酸度、醇厚度的协同组合）、余韵、一致性、甜度、干净度和总体评价（评价者的个人味觉体验、个人评价）。所有这些被评估的属性之和即为总分。
1.3.6 UPLC‐Q/TOF 分析
1.3.6.1 样品提取
按SCAA 杯测方法冲调咖啡，取800µL 咖啡液，加入20µL 预冷的乙腈充分混匀。15 000 r/min 转速，离心5 min，吸取上清液用0.22µm 的微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC‐Q/TOF 分析[8]。每个样品各取10µL 混合作为质量监控，重复检测5 次。
1.3.6.2 色谱条件
色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×150 mm，1.8 pm）。流动相：水相为超纯水（加入0.1%甲酸，A 相）、有机相为乙腈（加入0.1% 甲酸，B 相）。洗脱梯度：0～2 min，98%A 和2%B；2～9 min，98%A 和2%B；9～15 min，55%A 和45%B；15～22 min，30%A 和70% B；22～24 min，2% A 和98% B；24～26 min，98% A和2%B。流速0.4 mL/min；柱温35 ℃；进样量4µL。
1.3.6.3 质谱条件
电喷雾离子源，采用正离子模式和负离子模式分别检测，扫描质荷比m/z 50～1 000，干燥气体设置为8 L/min，350 ℃。毛细管电压为4.0 kV。
1.3.6.4 数据提取
使用MS‐DIA 软件对色谱数据和质谱数据进行峰提取、解卷积、化合物识别和峰对齐处理，得到二级质谱图和特征量化表，基于GPNS 数据库进行化合物鉴定。用IP4M 软件提取化合物对应的峰面积进行相对含量的计算，并进行多重比较分析。
1.3.7 GC‐MS 分析
1.3.7.1 样品提取
参照Dong 等[9]的方法，并稍作修改。称取1.0 g咖啡粉于15 mL 顶空瓶中，20µL 3‐庚酮为内标液且加盖密封。置恒温水浴锅于60 ℃下平衡20 min；用50/30µm DVB/CAR/PDMS 萃取头在顶空瓶的上部空间萃取30 min，完成香气吸附后再取出，在250 ℃的GC‐MS进样口解吸3 min。立刻插入250 ℃的气相色谱进样口解吸5 min。
1.3.7.2 气相色谱条件
色谱柱为极性DB‐WAX 毛细管柱（300 m×0.25 mm，0.25µm），进样口温度250 ℃；升温程序：40 ℃保持2 min，以1.5 ℃/min 升至130 ℃；以4 ℃/min升至220 ℃，保持5 min，载气为氨气；流速1.00 mL/min，采用不分流方式进样。
1.3.7.3 质谱条件电子轰击离子源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；扫描范围m/z 30～350。
1.3.7.4 挥发性成分的定量与定性分析
定性分析：采用NIST（v17）谱库检索比对进行定性。
定量分析：采用内标法进行半定量分析，内标物为3‐庚酮。含量计算公式如下。
式中：Ci 为未知化合物含量，µg/g；Si 为未知化合物峰面积；S 为内标物峰面积；c 为内标物浓度，µg/mL；V为内标物体积，µL；m 为样品质量，g；i 为未知化合物。
1.4 统计分析
所有数据以平均值±标准差的形式表示。使用SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析，利用Tukey 多重比较检验进行统计学分析。使用GraphPad Prism 8.0软件作图。使用psych 包进行spearman 相关性分析。
2 结果与分析
2.1 绿咖啡豆发酵过程中3 株乳酸菌的生长和发酵液pH 值变化情况
3 株乳酸菌生长变化见图1。
图1 3 株乳酸菌生长变化
Fig.1 Growth of three strains of lactic acid bacteria
***表示与初始点比，不同发酵时间差异高度显著（P<0.001）；#表示与FN015 比，QS029、FN037 差异显著（P<0.05）。
由图1可知，分别接种3 株乳酸菌后，菌密度随着发酵时间延长而逐渐增加，在12 h 后进入平台期。在发酵6 h 时，融合魏斯氏菌（FN015）发酵的菌密度显著高于另外两株菌（P<0.05），比初始点增加了1.35 lg（CFU/mL）；发酵6 h 后，其他两种菌的菌密度超过了融合魏斯氏菌（FN015），最终的菌密度大小顺序为QS029>FN037>FN015（P<0.05）。
发酵过程中发酵液pH 值的变化见图2。
图2 发酵过程中发酵液pH 值的变化
Fig.2 Change of pH during fermentation
***表示与初始点比，不同发酵时间差异高度显著（P<0.001）；#表示与FN015 比，QS029、FN037 差异显著（P<0.05）。
由图2可知，未接种菌种的对照液中pH 值稳定在初始水平6.35 左右，而接种3 株乳酸菌发酵后体系的pH 值显著降低（P<0.05）；发酵6 h 时，接种融合魏斯氏菌（FN015）的发酵液pH 值显著低于另外两株菌（P<0.05），而在发酵终点时，植物乳杆菌QS029 的pH值显著低于FN015（P<0.05）。
2.2 杯测结果分析
本试验参照SCAA 杯测体系，咖啡的香气、风味、余韵、酸度、醇厚度、一致性、平衡感、干净度、甜度和总体评价10 个指标进行评分。杯测评分见图3。
图3 咖啡烘烤豆的每个指标的杯测评分
Fig.3 Cup test score chart for each indicator for roasted coffee beans
QS029 和FN015 与对照组比，*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；***表示差异高度显著（P<0.001）。对照组、QS029、FN015 与FN037 比，#表示差异显著（P<0.05）；##表示差异极显著（P<0.01）；###表示差异高度显著（P<0.001）。
由图3可知，QS029 和FN015 发酵后中烘咖啡的甜度和醇厚度都显著提高。QS029 发酵咖啡的一致性（8.00）、平衡感（7.70）、干净度（8.25）和FN015 发酵咖啡的余韵（7.70）、酸度（8.25）、醇厚度感（7.50）、总体评价（7.95）评分最高；而FN037 发酵咖啡的甜度（6.10）、平衡感（6.30）得分最低。FN037、FN015 和QS029 发酵咖啡的杯测平均分依次为未发酵咖啡的95%、110%和109%。综上所述，用魏斯氏菌FN015 和植物乳杆菌QS029 来发酵，发酵后提升了咖啡液的风味。
2.3 UPLC‐Q/TOF 分析
2.3.1 正交偏最小二乘法判别分析
用于监督模式识别的统计多元分析技术称为偏最小二乘判别分析（partial least squares‐discriminant analysis，PLS‐DA）[10]，该方法使寻找不同的差异化合物变得更加容易，并且组间分化最大化。由于正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares dis‐criminant analysis，OPLS‐DA）结合了正交信号校正（or‐thogonal signals correction，OSC）和PLS‐DA 方法，试验结果更可信。本试验建立了FN037、FN015、QS029 分别与对照组咖啡比较的OPLS‐DA 模型，如表1所示。
表1 不同乳酸菌发酵咖啡豆与未发酵咖啡豆比较的差异化合物
Table1 Differential compounds of fermented coffee beans by different lactic acid bacteria vs.unfermented coffee beans
注：VIP 值表示变量对模型的重要性；↑表示上调，↓表示下调。
化合物棕榈酸月桂酸柚皮素油酸异棕榈酸异阿魏酸烟酰胺亚油酰乙醇酰胺亚油酸亚麻酸西茶碱肉桂酰甘氨酸柠檬酸三乙酯麦芽糖咖啡因咖啡酰奎宁酸咖啡酰胆碱焦磷酸葫芦巴碱高香草酸二咖啡酰喹内酯二咖啡酰奎宁酸阿魏酰奎宁酸半二氢愈创木酸γ‐谷甾醇2‐异丙基苹果酸5‐咖啡酰奎宁酸绿原酸对照组与FN037 相比（R2 Y=1，Q2 Y=0.996）VIP 值1.09 1.13 1.14 1.12 1.14 1.08 1.15 1.13 1.09 1.14 1.13 1.15 1.13 1.12 1.09 1.05 1.15 1.14 1.04 1.00 1.03 1.11 1.01相关系数0.95 0.98 0.99 0.97 0.99-0.94 0.99 0.98 0.95 0.99 0.98 0.99 0.98-0.98 0.95 0.91 0.99-0.99 0.90 0.87 0.90 0.96 0.88变化↑ ↑↑↑↑↓↑↑↑↑↑↑↑↓ ↑ ↑↑↓↑↑↑↑↑对照组与FN015 相比（R2 Y=1，Q2 Y=0.997）VIP 值1.11 1.16 1.16 1.07 1.16 1.14 1.17 1.15 1.08 1.14 1.17 1.16 1.13 1.05 1.12 1.17 1.16 1.07 1.11 1.17 1.14 1.02 1.16相关系数0.95 0.99 0.99 0.92 0.99-0.98 0.99 0.98 0.92 0.97 0.99 0.99-0.96-0.90 0.96 0.99-0.99 0.92 0.95-0.99 0.97 0.87 0.96变化↑ ↑↑↑↑↓↑↑↑ ↑↑↑↓↓↑↑↓↑↑↓ ↑↑↑对照组与QS029 相比（R2 Y=1，Q2 Y=0.998）VIP 值1.07 1.14 1.16 1.15 1.09 1.37 1.15 1.16 1.13 1.15 1.15 1.06 1.15 1.06 1.15 1.13 1.07 1.01 1.09 1.08 1.15 1.13 1.10 1.09 1.12 1.10相关系数0.93-0.99 0.99 0.99 0.94 0.98-0.99 0.99 0.98 0.99 0.99-0.91 0.99 0.92-0.99-0.98-0.93 0.87 0.95-0.93-0.99-0.98 0.95 0.94-0.97-0.91变化↑↓↑↑↑↑↓↑↑↑↑↓↑↑↓↓↓↑ ↑↓↓↓ ↑↑↓↓
由表1可知，在这3 组模型中R2Y 和Q2Y 均高于0.50，说明这3 组模型是可靠的，并且拥有良好的预测能力，能很好地解释每两组样本之间的差异。FN037发酵咖啡有23 种差异化合物（上调20 种，下调3 种），FN015 发酵咖啡有23 种差异化合物（上调18 种，下调5 种），而QS029 发酵产生了26 种差异化合物（上调15 种，下调11 种）。
2.3.2 非挥发性差异化合物的筛选
以相关系数≥0.8、相关系数≤-0.8 和P 值≥0.05 以及变量重要性投影（variable importance in the projec‐tion，VIP）值≥1 作为筛选差异化合物的标准，筛选结果见表1。
咖啡烘焙产物主要分为非挥发性化合物和挥发性化合物，挥发性化合物主要对咖啡香气起重要作用，而非挥发性化合物主要决定咖啡的酸味、苦味和涩味。咖啡因（1，3，7‐三甲基黄嘌呤）和葫芦巴碱是咖啡果实中的主要生物碱成分，是咖啡苦涩味的来源。
咖啡因在3 株乳酸菌的处理下其变化呈下调趋势，而葫芦巴碱只在融合魏斯氏菌FN015 处理下，其变化趋势呈下调情况。表1中的差异化合物主要是酚酸及其衍生物；棕榈酸、异棕榈酸、异阿魏酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和2‐异丙基苹果酸在这3 种处理中都是成上调情况；而月桂酸、阿魏酰奎宁酸在用植物乳杆菌（QS029）处理下是下调的；焦磷酸只在融合魏斯氏菌（FN015）和植物乳杆菌（QS029）处理下是上调的；绿原酸只在植物乳杆菌（QS029）的处理下呈下调情况。碳水化合物中差异化合物麦芽糖在3 株乳酸菌的发酵下都是呈上调情况。
2.4 不同处理的烘焙咖啡豆中挥发性化合物的变化
图4 显示了中度烘焙的咖啡豆中挥发性成分分布。
图4 烘焙咖啡挥发性成分剖面热图
Fig.4 Heat map on volatile component profiles of roasted coffee beans
由图4可知，气相色谱‐质谱分析共鉴定出吡嗪类11 种、吡啶类3 种、呋喃类10 种、呋喃酮类2 种、吡咯类6 种、酸类5 种、酮类6 种、醛类5 种、酚类6 种、酯类3 种、胺类5 种、含硫类1 种和杂类8 种；吡嗪和呋喃是烘焙咖啡中两种丰富的挥发性物质。在咖啡豆中检测到的吡嗪主要由甲基和乙基取代的吡嗪组成。烘焙咖啡的挥发性成分受到这3 株乳酸菌发酵的影响。绿咖啡豆通过融合魏斯氏菌FN015 发酵产生特异上调风味物质是乙酸、三甲基‐4‐戊烯基硅烷、1‐苯乙醇、芳樟醇氧化物、2‐异戊基‐6‐甲基吡嗪、1，8‐萘啶‐2（1H）酮、3，5‐二甲基‐2‐（3‐甲基丁基）吡嗪等。而通过植物乳杆菌QS029 发酵产生了2，6‐二甲基吡嗪、苯乙醛、2，6‐二乙基吡嗪特异上调风味物质。
融合魏斯氏菌FN015 和植物乳杆菌QS029 发酵咖啡特有的化合物见表2。
表2 融合魏斯氏菌FN015 和植物乳杆菌QS029 发酵咖啡特有的化合物
Table2 Specific compounds unique to coffee fermentation by Weissella confuse FN015 and Lactiplantibacillus plantarum QS029
化合物名称FN015 特异上调化合物乙酸三甲基‐4‐戊烯基硅烷1‐苯乙醇芳樟醇氧化物2‐异戊基‐6‐甲基吡嗪1，8‐萘啶‐2（1H）酮3，5‐二甲基‐2‐（3‐甲基丁基）吡嗪5‐重氮‐1，3‐环戊二烯QS029 特异上调化合物2，6‐二甲基吡嗪苯乙醛含量/（µg/g）对照组8.03±2.72c 0.27±0.03b 2.07±0.20c 0.92±0.12c 3.48±0.39b 14.89±3.00b 2.37±0.21c 9.76±2.00b 9.07±0.06b 9.57±1.53b FN015 34.77±21.13a 3.99±0.05a 16.72±2.32a 2.50±0.12a 22.10±2.00a 22.78±2.18a 26.11±1.88a 16.79±1.22a 9.27±0.85b 11.82±0.74a QS029 24.99±21.73b 3.68±0.34a 13.23±1.44b 1.58±0.05b 25.29±1.52a 22.80±3.09a 29.18±1.63a 17.30±2.43a 12.53±3.36a 12.95±0.55a
续表2 融合魏斯氏菌FN015 和植物乳杆菌QS029 发酵咖啡特有的化合物
Continue Table2 Specific compounds unique to coffee fermentation by Weissella confuse FN015 and Lactiplantibacillus plantarum QS029
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
化合物名称2，6‐二乙基吡嗪不特异上调化合物2‐甲基吡咯并[1，2‐b]吡啶3‐苯基呋喃乙酸糠酯2，3，5‐三甲基吡嗪2‐甲基‐3‐（2‐呋喃基）丙烯醛2‐乙酰基‐3，5‐二甲基吡嗪4‐甲基吡咯并[1，2‐a]吡嗪2‐苯基‐2‐丁烯醛2‐氨基苯酚N‐（呋喃‐2‐基亚甲基）‐3‐甲基丁胺1‐丁基吡咯烷‐2‐酮3‐乙基喹喔啉‐2（1H）酮1‐（呋喃‐2‐羰基）吡咯烷‐2‐羧酸5‐甲基‐2‐苯基‐2‐己烯醛1‐乙酰氧基‐1‐苯基丁‐2‐炔含量/（µg/g）对照组3.47±0.41b 2.90±0.46b 4.09±0.01b 6.94±1.31a 42.13±8.15a 1.07±0.10a 1.93±0.27a 2.22±0.39b 1.03±0.14c 2.20±0.50b 3.39±0.84a 1.29±0.31b 1.98±0.47b 0.37±0.08a 0.04±0.02c 0.30±0.07a FN015 3.69±0.13b 4.25±0.11a 6.53±0.10a 7.61±0.52a 46.44±3.89a 1.55±0.10a 1.95±0.24a 3.33±0.42a 3.52±0.44b 3.65±0.20a 3.93±0.23a 1.99±0.25a 2.41±0.20a 0.47±0.03a 0.94±0.04a 0.44±0.04a QS029 13.18±9.82a 4.88±0.08a 7.02±0.33a 6.87±0.48a 44.20±3.60a 2.10±0.58a 1.95±0.27a 3.05±0.57a 4.80±0.13a 3.50±0.44a 3.70±0.66a 2.10±0.42a 2.14±0.37a 0.51±0.14a 1.14±0.07a 0.51±0.05a
由表2可知，FN015 发酵特异性产生的代谢物包括乙酸、三甲基‐4‐戊烯基硅烷、1‐苯乙醇、芳樟醇氧化物、2‐异戊基‐6‐甲基吡嗪、1，8‐萘啶‐2（1H）酮、3，5‐二甲基‐2‐（3‐甲基丁基）吡嗪和5‐重氮‐1，3‐环戊二烯。而QS029 发酵产生了3 种独特化合物，即2，6‐二甲基吡嗪、苯乙醛和2，6‐二乙基吡嗪。
2.5 感官属性与化学成分的相关性分析
烘焙咖啡挥发性化合物与感官评分指标的相关性分析结果如图5所示。
图5 烘焙咖啡挥发性化合物与感官评分指标的相关性热图
Fig.5 Heat map of correlation between volatile compounds in roasted coffee beans and sensory scoring indicators
*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。
由图5可知，苯乙醛、1‐乙酰氧基‐1‐苯基丁‐2‐炔、2‐氨基苯酚、5‐甲基‐2‐苯基‐2‐己烯醛、3‐苯基呋喃、1‐苯乙醇等物质与咖啡感官属性（香气、风味、酸度、醇度、余韵等属性）呈正相关；而乙酸糠酯、2，3，5‐三甲基吡嗪、2，6‐二甲基吡嗪、2‐乙酰基‐3，5‐二甲基吡嗪与咖啡感官属性指标呈负相关。而其他物质N‐（呋喃‐2‐基亚甲基）‐3‐甲基丁胺、1‐丁基吡咯烷‐2‐酮、4‐甲基吡咯并（1，2‐a）吡嗪、1‐（呋喃‐2‐羰基）吡咯烷‐2‐羧酸等化合物与咖啡感官属性并无显著相关。由此可见，在不同乳酸菌作用下所产生的这些化合物是造成咖啡味道的主要原因。综上所述，不同乳酸菌对咖啡风味的影响显著，但这些化合物对风味影响的贡献度需进一步研究。
3 讨论与结论
本研究发现，融合魏斯氏菌FN015 发酵显著提高了云南卡蒂姆普通咖啡的总体感官评分。植物乳杆菌QS029 发酵也显著提高醇厚度、甜度、干净度评分。而副干酪乳杆菌FN037 发酵没有咖啡豆品质改良作用。这说明，乳酸菌发酵改善咖啡豆风味的作用具有菌株依赖性，有必要持续开展优良发酵剂的筛选。
融合魏斯氏菌是一种广泛存在于发酵食品、肉类、牛奶、蔬菜和土壤的乳酸菌，也存在于农场湿法发酵的咖啡中[11]。魏斯氏菌参与食品发酵过程，也是多种发酵食品风味形成的重要贡献者，是泡菜的主要天然发酵菌种，促进产品中挥发性酯、醛、醇、酮和乳酸的产生，从而增加香味[12]。
绿咖啡豆通过融合魏斯氏菌FN015 发酵产生乙酸、三甲基‐4‐戊烯基硅烷、1‐苯乙醇、芳樟醇氧化物、2‐异戊基‐6‐甲基吡嗪、1，8‐萘啶‐2（1H）酮、3，5‐二甲基‐2‐（3‐甲基丁基）吡嗪等特有风味物质。其中1‐苯乙醇呈现一种水果花香味[13‐14]，使咖啡的风味更加丰富；乙酸的产生增添了咖啡的酸味，并且融合魏斯氏菌FN015发酵的咖啡中非挥发性成分咖啡因和葫芦巴碱减少，使得咖啡的苦涩味下降，酸味增加和苦涩味减少提升了咖啡的滋味，因此通过融合魏斯氏菌FN015 发酵使得咖啡的风味和味道更加丰富。而通过植物乳杆菌QS029 发酵产生了2，6‐二甲基吡嗪、苯乙醛、2，6‐二乙基吡嗪，其中的2，6‐二乙基吡嗪可被视为烘焙咖啡的挥发性标志物，这种化合物并呈现出坚果、烘焙和类似可可的风味[15]。
副干酪乳杆菌FN037 发酵咖啡不但没有改善咖啡的风味，反而使咖啡的风味品质下降，从杯测评分结果和挥发性风味物质热图分析，FN037 发酵咖啡的香气评分比较低（P<0.05），2，3，5‐三甲基吡嗪对比其他3 种显著增加（P<0.05）；2，3，5‐三甲基吡嗪像奶酪腐臭一样，是令人不快的香气[16]。
绿咖啡豆发酵过程中咖啡风味相关成分的变化主要通过乳酸菌与己糖和氨基酸代谢有关。这3 种菌株作通过糖酵解产生丙酮酸，将葡萄糖和果糖主要转化为乳酸。所有发酵咖啡豆的pH 值均显著低于未发酵咖啡豆（P<0.05），在发酵过程中，微生物可能作用于咖啡黏液中存在的果胶糖和其他能量的还原或非还原糖，这有助于乳酸、丁酸、乙酸和其他高级羧酸的产生，并倾向于使最终咖啡的酸味增加[17]。
糖和有机酸的代谢变化分别反映了糖酵解和三羧酸循环功能。一般来说，咖啡的味道分为苦味、涩味以及酸味，而酸味与成分密切相关，特别是有机酸[18]。有机酸是碳水化合物分解代谢的关键产物，是碳水化合物分解代谢的中间产物[19]。与对照组相比，3 组样品的代谢产物中棕榈酸和2‐异丙基苹果酸的含量显著增加，说明微生物接种剂能够促进该类代谢产物的形成。
在烘焙过程中，美拉德反应、焦糖化和其他涉及非挥发性前体（例如碳水化合物和氨基酸）的热解反应会产生多种挥发物，这些挥发物是烘焙咖啡香气的来源[20]。在咖啡烘焙中，更容易发生热解反应的碳水化合物是己糖，包括葡萄糖和果糖，无论是游离形式还是来自蔗糖水解。对于己糖，美拉德反应中的3‐脱氧酮路线会产生5‐羟甲基糠醛，后者降解为糠醛和5‐甲基糠醛[21‐23]。糠醛的进一步分解产生其他呋喃衍生物[24]。在氨存在下或其他氨基化合物，美拉德反应中的3‐脱氧酮途径也会生成吡咯[25]。
对于香气潜力有限的生咖啡豆，通过乳酸菌发酵使绿咖啡豆酸化产生了具有更强烈焦糖香气的烘焙咖啡，并更好地保留了甜味和酸度。这种乳酸菌发酵可以对各种生咖啡豆产生类似的风味改变，因为生咖啡豆中的生物改变以及随后在烘焙过程中对挥发性形成途径的调节很重要，足以超过不同品种和地区的咖啡成分的微小变化。本研究报告的乳酸菌发酵可以作为生咖啡豆的额外生物改性过程，以进一步改变、改善或多样化咖啡风味。发酵咖啡豆特别适用于低档云南咖啡豆的品质提升和经济价值的提高。所得咖啡也可用于生产各种咖啡相关产品，例如饮料、糕点和调味品，以便为最终产品赋予增强的咖啡风味。本研究证明FN015 发酵可改善咖啡风味。该研究为进一步筛选乳酸菌制作发酵咖啡提供依据。
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