灵芝（Ganoderma lucidum）在我国已有2 000 多年种植历史。现代药学研究表明，灵芝含有多糖类、三萜类、甾醇类、核苷类、氨基酸、微量元素等物质[1]，其中多糖与三萜是灵芝最主要的活性物质，存在于灵芝子实体、菌丝体、孢子粉和发酵液中，具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、镇静止痛、抑制组织胺释放、解毒保肝等作用[2‐5]。
灵芝质地坚硬，不便于直接食用，多用于提取其中的活性成分加工成保健品及药品。人工栽培灵芝周期长，易受季节、场地及水分等自然条件的影响，导致灵芝子实体中活性成分含量参差不齐，造成了人工栽培灵芝规模大，但产量不能满足当前市场需求的现象[6]。因此，能够工厂化生产且周期短、产量大的培养技术尤为重要。近年来随着发酵技术的发展，利用发酵技术直接生产灵芝菌丝获取活性成分，在不受自然环境影响下，可以缩短培养时间，实现规模化生产，提高产量[7]。有研究表明，从野生赤芝中分离并人工培养的菌丝中测得多糖含量比子实体中多糖含量高，经液态发酵后，菌丝体干粉中的多糖含量仍比子实体高，由此可见发酵对灵芝活性成分的合成有促进效果[8]。
目前灵芝发酵方法有固态发酵和液态发酵。液态发酵因原料来源广、培养周期短、产量大、易操作、可控性高、发酵产物收获提取简单等优点，受到了研究人员的广泛关注[9‐11]。传统液态发酵多采用补料‐分批发酵或调整发酵参数（如溶氧量和pH 值）等方法来提高活性成分含量[12]。也有研究使用4 种中药材代替传统发酵基质或者向传统发酵液中添加红茶进行发酵，结果发现与传统葡萄糖和麦麸作为液态发酵基质相比，改变基质材料后灵芝多糖与三萜含量有显著提升[13‐15]，证明改变发酵基质材料来提升灵芝活性成分含量，是一个可行且有效的手段。
铁核桃壳与三七须根分别是农产品与中药材副产物。目前对铁核桃壳的利用主要是作为燃料或者填充材料等初级运用，而铁核桃壳高值化利用率普遍偏低。而铁核桃壳中含有的木质素、纤维素与半纤维素等是灵芝生长所需主要物质[16]；三七须根中含有多种皂苷成分和营养成分，但其在采收过程中因掺杂大量杂质而被遗留在土地，这不仅会污染土地，加大连作障碍，还会使功能成分和营养物质得不到充分利用[17‐18]。基于此，本试验以铁核桃壳与三七须根提取液作为液态发酵基质，研究铁核桃壳与三七须根不同的配比对赤芝和紫芝发酵液活性成分的影响及灵芝菌丝对三七须根中皂苷成分富集能力的影响，以期为灵芝液态发酵技术提供新的研究思路，同时也为云南产业的提质增效提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株与材料
赤芝、紫芝菌株：云南省食用菌研究所；木屑、棉籽壳：市售；铁核桃壳：迪庆香格里拉舒达有机食品有限公司；三七须根：昆明市官渡区黄娇中药材经营部。
1.2 试剂
硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、葡萄糖、维生素B1：福晨（天津）化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母浸出膏（均为生物试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；浓硫酸、三氯甲烷、甲醇、苯酚、溴甲酚绿、甲基红、无水乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、氢氧化钠、氢氧化钠、浓硝酸、过氧化氢、正丁醇、香草醛：国药集团化学试剂有限公司；齐墩果酸标准品（CAS 号508‐02‐1，纯度≥99%）：广东光华科技股份有限公司；人参皂苷Rg1标准品（≥99.78%）、人参皂苷Re 标准品（≥99.90%）、人参皂苷Rb1 标准品（≥98.87%）、人参皂苷Rd 标准品（≥99.12%）：成都麦德生科技有限公司；三七皂苷R1标准品（≥98%）、腺嘌呤对照品（≥98.0%）、鸟苷对照品（HPLC≥99.0%）、尿苷对照品（≥99.0%）：伊势久生物科技有限责任公司；17 种氨基酸混标对照品：坛墨质检标准物质中心。以上试剂除特殊标注外均为分析纯。
1.3 仪器与设备
AS120.X2 PLUS 分析天平：广东誉尚成仪器有限公司；UV‐2600 紫外‐可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；HH‐S 水浴锅：上海捷呈实验仪器有限公司；SB‐400DTY 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；GJ‐100‐6D 样品粉碎机：济南海博实验室仪器有限公司；SH220N 石墨消解仪：海能未来技术集团股份有限公司；101‐4A 电热鼓风干燥箱：绍兴市易诚仪器制造有限公司；DZK‐K20B 真空抽滤装置：瑞德仪器设备有限公司；DB‐3 电热板：上海尚仪仪器设备有限公司；iCAPTM RQ 电感耦合等离子体质谱仪、Multiskan GO 全波长酶标仪、iCAP7400 电感耦合等离子体发射光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司；U3000 高效液相色谱仪、AcclaimTM 120 C18 色谱柱：美国安捷伦公司；HY‐5型回旋式振荡器：金坛市西城新瑞仪器厂；MD‐550A台式大容量低速离心机：南京卓恒科学仪器有限公司；KDN‐04 消化炉：上海昕瑞仪器有限公司；DHP‐9012台式电热细菌培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；K1270 全自动凯氏定氮仪：济南海能仪器股份有限公司。
1.4 方法
1.4.1 菌种的扩繁与保存
菌种扩繁使用PDA 培养基，取一小块赤芝与紫芝原种，接种于PDA 斜面培养基，28 ℃暗培养至菌丝长满斜面后冷藏保存，使用前将栽培菌种放入培养箱，活化12 h。
1.4.2 发酵液配方及制备
1.4.2.1 发酵液配方
试验组发酵液配方设置如表1所示。
表1 试验组发酵液配方
Table1 Formulation of fermentation broth in experimental group
组别a b c d e f g铁核桃壳/%65 55 45 35 25 15 80三七须根/%15 25 35 45 55 65硫酸镁/g 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5磷酸二氢钾/g 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46磷酸氢二钾/g 1 1 1 1 1 1 1蛋白胨/g 2 2 2 2 2 2 2葡萄糖/g 20 20 20 20 20 20 20维生素B1/g 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05酵母浸出膏/g 15 15 15 15 15 15 15水/L 1 1 1 1 1 1 1
对照组发酵液配方设置如表2所示。
表2 对照组发酵液配方
Table2 Formulation of fermentation broth in control group
组别CK CK1棉籽壳/%74木屑/%74硫酸镁/g 0.5 0.5磷酸二氢钾/g 0.46 0.46磷酸氢二钾/g 1 1蛋白胨/g 2 2葡萄糖/g 20 20维生素B1/g 0.05 0.05酵母浸出膏/g 15 15水/L 1 1
1.4.2.2 发酵液制备
液态培养基制备：按照试验设计，以50 g 干料为准按比例称取铁核桃壳、三七须根、木屑与棉籽壳粉碎后加入1 L 水充分浸泡2 h 后熬煮浓缩，冷却后将浓缩液过滤装瓶灭菌。
将活化后的3～4 块1 cm3 大小的赤芝或紫芝菌株块接种于上述培养基，150 r/min、28 ℃条件下培养7 d，培养箱28 ℃暗培养10 d，收集培养液中浓稠的絮状物备用待测。
1.5 活性成分的测定
1.5.1 多糖含量的测定
吸取1 mL 待测液，加入5% 苯酚溶液1 mL，摇匀，再准确加入5 mL 浓硫酸，摇匀，静置10 min，摇匀，30 ℃水浴20 min，冷却至室温，490 nm 处测定吸光度，根据NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》计算多糖含量。
1.5.2 三萜含量的测定
吸取待测液1 mL，挥干溶剂，加入0.2 mL 5% 香草醛‐冰乙酸溶液、0.8 mL 高氯酸，混匀，置于70 ℃水浴加热15 min，冷却至室温，加5 mL 冰乙酸，摇匀，550 nm 处测定吸光度，根据GB/T 8303—2013《茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定》计算三萜含量。
1.5.3 总皂苷含量的测定
吸取待测液1 mL 于50 mL 离心管中，水浴挥干溶剂，加0.2 mL 5% 香草醛‐冰乙酸溶液溶解残渣，加0.8 mL 高氯酸，混匀于70 ℃水浴15 min，立即冰水浴5 min，加5 mL 冰乙酸，混匀后于550 nm 测定吸光度，根据DB13/T 2818—2018《芦笋汁（粉）中芦笋皂苷检测方法分光光度法》计算总皂苷含量。
1.5.4 微量元素测定
吸取9.8 mL 待测液，加入0.2 mL 浓硝酸进行酸化，然后采用电感耦合等离子体发射光谱仪进样，在根据样品信号计数，从GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》标准曲线回归方程中查得样品中各元素浓度。
1.5.5 粗蛋白含量的测定
吸取待测液10～25 g（相当于30～40 mg 氮），精确至0.001 g，放至消化管中，再加入0.4 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL 硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420 ℃，继续消化1 h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50 mL 水，采用全自动凯氏定氮仪，参照GB 5009—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定粗蛋白含量。
1.5.6 氨基酸含量的测定
吸取1 mL 待测液，加入10 mL 50% 乙醇超声30 min，在80 ℃下旋干，最后用蒸馏水定容至2 mL。衍生试剂A 为1∶4（体积比）的三乙胺‐乙腈溶液，衍生试剂B 为1∶80（体积比）的异硫氰酸苯酯（phenyl iso‐thiocyanate，PITC）‐乙腈溶液，均为4 ℃保存。吸取200µL 样品溶液置于2 mL 离心管中，加入衍生试剂（A、B 各100µL），摇匀，室温静置1 h，加入正己烷400µL，充分振摇后静置10 min 使其分层。取下层溶液，用0.22µm 滤膜过滤，稀释10 倍后采用高效液相色谱仪进行测定。
1.5.7 核苷含量的检测
吸取1 mL 待测液，加入20 mL 50% 甲醇溶液，混匀后超声30 min，以12 000 r/min 离心10 min，上清液转移至25 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，过0.22µm 滤膜，采用高效液相色谱仪测定核苷含量。
1.5.8 皂苷成分检测
吸取1 mL 待测液，加入25 mL 80% 乙醇溶液，充分混匀后超声60 min，过滤后将滤液在80 ℃下旋转蒸干，甲醇复溶后定容至5 mL，最后过0.22µm 滤膜后采用高效液相色谱仪测定皂苷。
1.6 数据处理与分析
采用Microsoft Excel 2010 整理数据，采用SPSS 25.0 软件统计分析，显著性检验采用邓肯式多重比较法（P=0.05），采用Origin 2018 软件画图。
2 结果与分析
2.1 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液中多糖含量分析
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中多糖含量见图1。
图1 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中多糖含量
Fig.1 Polysaccharide content in liquid fermentation broth of Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中多糖含量见图2。
图2 铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中多糖含量
Fig.2 Polysaccharide content in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
液态发酵过程中温度、pH 值、转速等发酵条件都会对发酵液中多糖含量产生影响，但发酵基质材料是影响灵芝多糖合成的主要因素之一[19]。由图1可知，赤芝发酵液中多糖含量在d 组含量最高，为59.68 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），分别增加37.25、25.55 g/L，但与c 组相比差异不显著（P>0.05），与b 组与g 组相比显著增加（P<0.05），分别增加7.19、23.44 g/L。由图2可知，紫芝发酵液中多糖含量在c组含量最高，为55.16 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），分别增加32.11、30.63 g/L，与f 组差异不显著（P>0.05），与a 组、b 组及g 组相比显著增加（P<0.05），分别增加49.77、26.74 g/L 及19.85 g/L。表明使用铁核桃与三七须根提取液发酵赤芝与紫芝对多糖的合成有促进作用，并且赤芝最适的发酵配方为d 组，紫芝的最适发酵配方为c 组。
2.2 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液中三萜含量分析
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中三萜含量见图3。
图3 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中三萜含量
Fig.3 Triterpene content in liquid fermentation broth of Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中三萜含量见图4。
图4 铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中三萜含量
Fig.4 Triterpene content in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
灵芝三萜存在于灵芝子实体、孢子粉、发酵液及菌丝体中[20]，并且灵芝三萜的合成主要与培养基材料与发酵条件有关，通过改变基质材料提升灵芝三萜产量，是一种很好的调控手段[21‐23]。由图3可知，赤芝发酵液中三萜含量在d 组最高为5.21 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），且分别增加了1.49、3.52 g/L，与a、b、c、e 组相比差异不显著（P>0.05），与f组和g 组相比显著增加（P<0.05），分别增加了0.97、1.83 g/L。由图4可知，紫芝发酵液总三萜含量在f 组含量最高，为4.78 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），分别增加了3.04、3.01 g/L，与c 组差异不显著（P>0.05），与a、d 及g 组相比显著增加（P<0.05），分别增加3.11、1.85、1.31 g/L。证明使用铁核桃壳与三七须根提取液发酵赤芝与紫芝对三萜的合成有促进作用，并且赤芝的最适发酵配方为d 组，紫芝最适发酵配方为f 组。
2.3 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液中总皂苷含量分析
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中总皂苷含量见图5。
图5 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中总皂苷含量
Fig.5 Total saponin content in liquid fermentation broth of
Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中总皂苷含量见图6。
图6 铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中总皂苷含量
Fig.6 Total saponin content in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
由图5可知，赤芝发酵液中总皂苷含量在d 组含量最高，为8.15 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），且分别增加4.13、2.71 g/L，与c 组和e 组相比差异不显著（P>0.05），与a、b 及g 组相比显著增加（P<0.05），分别增加2.34、1.89 、4.09 g/L。由图6可知，紫芝发酵液中总皂苷含量在e 组最高，为7.00 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），分别增加3.87、4.51 g/L，与c 组相比差异不显著（P>0.05），与a、b及g 组相比显著增加（P<0.05），分别增加4.44、3.35、2.83 g/L。综上，赤芝中总皂苷的含量要优于紫芝，且赤芝的最适发酵配方为d 组，紫芝的最适发酵配方为e 组。
2.4 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液中微量元素含量分析
灵芝可以通过生物转化作用将无机的微量元素转化成具有生物活性的微量元素，从而提升微量元素含量[24]。铁核桃壳与三七须根中含有多种微量元素[25‐26]。本试验通过改变基质材料及其比例来探究灵芝微量元素含量的变化情况，结果见表3和表4。
表3 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液微量元素含量
Table3 Trace element content in liquid fermantation broth of Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
mg/L
组别a b c d e f g CK CK1 K 226.22±3.87 249.16±2.43 349.70±4.06 326.16±4.11 278.41±2.14 238.93±1.85 220.72±3.96 433.95±4.03 248.12±11.64 Ca 16.82±1.38 13.67±1.95 19.30±1.22 15.94±0.88 16.27±1.38 5.47±0.95 11.17±0.79 312.37±2.14 16.12±0.92 Na 63.45±2.18 56.74±1.76 127.59±2.86 66.57±2.25 58.95±2.02 56.54±2.02 63.79±2.26 789.26±7.83 67.44±4.09 Mg 22.15±2.16 20.18±1.04 34.02±2.12 29.30±1.99 23.47±1.20 19.12±1.35 24.00±1.16 123.25±2.54 23.92±2.20 Fe 2.51±0.45 4.25±0.67 2.62±0.62 3.37±0.51 2.77±0.43 3.45±0.57 1.89±0.42 191.15±3.03 2.27±0.62 Cu 0.08±0.02 0.17±0.02 0.17±0.02 0.09±0.57 0.05±0.05 0.23±0.08 0.19±0.04 3.67±0.41 0.08±0.05 Zn 0.17±0.03 0.47±0.25 0.29±0.11 0.17±0.08 0.20±0.06 0.03±0.03 0.01±0.01 1.55±0.60 0.18±0.13 Mn 0.49±0.24 0.31±0.19 0.87±0.42 0.48±0.39 0.51±0.16 0.18±0.11 0.10±0.03 1.07±0.68 0.53±0.14
表4 铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液微量元素含量
Table4 Trace element contents in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
mg/L
组别a b c d e f g CK CK1 K 209.01±4.03 217.67±4.16 325.71±4.33 320.46±3.99 336.73±3.89 283.90±2.14 245.77±4.19 445.48±3.93 397.33±4.19 Ca 14.27±0.97 5.06±0.50 19.18±2.20 17.50±1.44 16.07±1.19 8.38±1.60 10.29±0.95 343.50±3.39 337.56±4.35 Na 57.61±1.18 57.11±1.46 124.88±1.49 66.21±2.46 68.85±2.89 64.48±1.53 68.28±1.83 311.73±8.16 854.75±4.36 Mg 19.73±1.97 15.24±0.66 31.59±1.48 27.41±2.05 28.49±0.91 22.94±1.13 24.72±1.36 94.38±4.11 126.86±2.83 Fe 1.43±0.29 1.68±0.16 2.98±0.19 2.98±0.50 2.83±0.27 2.23±0.25 1.83±0.39 113.82±4.37 195.96±4.27 Cu 0.13±0.04 0.16±0.03 0.11±0.02 0.11±0.03 0.10±0.04 0.15±0.05 0.23±0.02 3.31±0.90 3.52±0.58 Zn 0.19±0.12 0.06±0.04 0.24±0.13 0.04±0.02 0.18±0.13 0.38±0.11 0.06±0.03 0.71±0.15 1.45±0.47 Mn 0.17±0.12 0.08±0.04 0.93±0.38 0.36±0.18 0.61±0.39 0.35±0.23 0.05±0.04 0.82±0.42 1.18±0.58
由表3可知，赤芝发酵液中微量元素含量由高到低排序为K>Na>Mg>Ca>Fe>Mn>Zn>Cu，可以看出赤芝发酵液中K 在c 组含量最高，为349.70 mg/L，比对照组CK 少84.25 mg/L，但比CK1 高101.58 mg/L，其次Ca、Na、Mg 在c 组的含量最高分别为19.30、127.59、34.02 mg/L，均低于对照组CK，但高于对照组CK1；由表4可知，紫芝发酵液中微量元素含量由高到底排序为K>Na>Mg>Ca>Fe>Mn>Zn>Cu，可以看出紫芝发酵液中K 在e 组含量高为336.73 mg/L，比对照组CK、CK1 分别低108.75、42.6 mg/L，其次Ca、Na、Mg 在c 组含量最高为19.18、124.88、31.59 mg/L，低于对照组CK、CK1。综上可知赤芝与紫芝发酵液含有的微量元素中K 的含量最高，其次为Ca、Na、Mg，但是赤芝与紫芝对比，赤芝中的微量元素含量高于紫芝，证明铁核桃壳与三七须根提取液更适合发酵赤芝，并且赤芝与紫芝的最适发酵配方均为c 组。
2.5 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液粗蛋白含量分析
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中粗蛋白含量见图7。
图7 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中粗蛋白含量
Fig.7 Crude protein content in liquid fermentation broth of Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中粗蛋白含量见图8。
图8 铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液粗蛋白含量
Fig.8 Crude protein content in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
不同大写字母表示差异显著，P<0.05。
由图7可知，赤芝发酵液中粗蛋白含量在c 组最高，为34.27 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），分别增加15.04、13.24 g/L，与b 组与d 组相比同样显著增加（P<0.05），分别增加15.04 g/L 与11.30 g/L；由图8可知，紫芝发酵液中粗蛋白含量在c 组最高，为36.33 g/L，与对照组CK、CK1 相比显著增加（P<0.05），分别增加20.40、6.30 g/L，与a 组与f 组相比同样显著增加（P<0.05），分别增多19.33、13.53 g/L。综上所述，赤芝发酵液中粗蛋白含量与紫芝发酵液中粗蛋白含量差异不大，且均在c 组含量最高，证明铁核桃壳与三七须根提取液液态发酵对赤芝与紫芝中粗蛋白的合成有益，且在赤芝与紫芝发酵液中的差异不明显，最适发酵配方均为c 组。
2.6 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液氨基酸含量分析
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中氨基酸含量见表5。
表5 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液氨基酸含量
Table5 Amino acid content in liquid fermentation broth of Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
mg/L
组别a b c d e f g CK CK1天冬氨酸59.12±0.50 33.09±2.17 69.93±4.40 59.68±3.09 34.71±1.71 17.54±1.17 19.12±1.38 139.08±3.93 121.09±3.76谷氨酸59.75±1.87 53.05±1.43 106.10±1.78 94.55±2.52 64.65±3.15 99.10±4.12 79.60±1.80 186.69±4.96 161.88±3.92丝氨酸38.89±1.71 31.79±1.28 74.38±3.11 53.65±2.82 39.65±1.85 42.46±2.38 20.44±1.53 71.24±3.45 41.92±2.69甘氨酸66.64±2.62 59.64±1.96 187.97±3.66 101.49±3.36 73.66±2.74 77.50±1.61 59.31±1.88 66.48±1.19 125.00±3.44组氨酸11.24±1.90 8.76±0.87 17.89±2.44 14.95±1.21 20.14±2.22 9.40±0.86 6.10±1.05 44.60±3.05 56.68±1.58精氨酸73.51±3.22 81.23±2.70 287.52±6.97 150.57±2.93 96.90±1.66 124.72±2.95 97.00±2.09 136.03±3.95 114.12±3.94苏氨酸45.03±1.68 35.63±2.09 107.05±2.17 88.41±2.80 49.32±3.48 50.89±2.45 34.10±1.19 92.15±2.58 72.97±2.05丙氨酸158.99±5.13 143.16±3.33 346.20±4.26 213.27±2.99 164.03±4.86 159.08±4.35 111.48±4.81 140.66±3.23 131.85±4.81脯氨酸78.05±1.74 70.69±2.64 140.85±2.43 86.08±2.37 81.65±2.97 110.24±4.11 232.93±3.23 148.09±2.20 116.90±4.33亮氨酸42.80±3.81 34.80±3.48 96.94±3.23 75.57±3.05 42.92±2.95 49.08±4.45 58.23±1.86 411.71±9.49 346.69±4.12苯丙氨酸62.12±3.38 51.90±3.21 140.30±3.72 105.37±1.51 60.26±4.75 46.71±2.85 49.26±3.29 57.71±1.87 55.53±2.77
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中氨基酸的含量见表6。
表6 铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液氨基酸含量
Table6 Amino acid content in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
mg/L
组别a b c d e f g CK CK1天冬氨酸41.35±2.58 75.87±2.29 84.08±2.80 109.14±1.79 109.51±5.84 103.20±1.51 112.58±5.00 172.41±3.08 99.00±3.27谷氨酸215.60±6.29 141.90±4.45 161.40±6.52 191.65±4.91 176.65±5.41 166.25±4.25 245.45±4.08 266.27±5.08 142.58±2.35丝氨酸3.67±0.77 62.18±2.82 101.48±1.90 83.92±2.00 88.40±4.49 79.65±3.55 105.72±4.19 127.61±4.07 113.13±2.98甘氨酸152.21±3.56 100.79±2.05 300.59±5.73 204.28±4.13 218.85±6.26 147.08±4.69 166.11±4.44 193.70±2.94 88.51±3.20组氨酸25.09±1.87 10.96±1.80 37.89±2.52 26.56±1.59 25.14±1.72 22.80±2.19 9.36±1.84 34.00±1.68 95.08±2.27精氨酸143.24±3.12 151.55±3.44 429.48±13.05 233.76±10.32 233.66±3.23 166.93±9.59 197.40±2.94 155.19±8.57 113.71±4.42苏氨酸144.21±6.05 86.23±2.55 184.54±2.44 187.84±4.69 182.76±3.66 122.47±2.66 142.97±3.24 138.07±1.39 97.06±2.05丙氨酸214.69±6.46 179.28±5.88 424.03±9.14 377.06±8.20 408.52±5.23 272.47±5.32 285.89±8.53 218.67±5.33 113.94±2.80脯氨酸81.09±3.33 102.56±2.91 147.52±3.63 173.09±2.94 179.95±3.56 203.04±2.36 397.17±4.11 208.98±3.01 98.10±2.07亮氨酸71.66±2.289 67.93±2.59 182.18±5.23 80.63±3.18 94.98±3.68 126.68±4.99 133.99±3.27 460.02±6.17 351.08±4.12苯丙氨酸114.16±2.92 74.07±1.29 272.64±3.75 123.55±2.80 141.56±3.62 111.26±1.62 89.18±3.27 93.90±1.63 94.11±2.64
灵芝中氨基酸含量与基质材料有关，有研究通过不同材料栽培灵芝，结果表明不同材料栽培的灵芝子实体中氨基酸含量存在很大差异[27]。由表5、表6可知，赤芝与紫芝发酵液对丙氨酸的合成效果最好，其次是精氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸，并且含量均在c 组最高。由此推出赤芝与紫芝的最适发酵配方均为c 组。赤芝与紫芝发酵液中均含有组氨酸、精氨酸2 种人体半必需氨基酸和苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸3 种人体必需氨基酸。通过表5可知赤芝在最适发酵配方c 组中这5 种氨基酸的总含量是649.70 mg/L，对照组中的5 种氨基酸总含量分别为428.14、335.99 mg/L，比CK 组增加21.56 mg/L，比CK1 组增加313.71 mg/L。通过表6可知，紫芝在最适发酵配方在c 组中5 种氨基酸总含量为1 106.73 mg/L，对照组中5 种氨基酸总含量分别为881.18、751.04 mg/L，比对照组CK 增加225.55 mg/L，比对照组CK1 增加355.69 mg/L。在最适配方c 组，紫芝中5 种氨基酸的含量高于赤芝，因此铁核桃壳与三七须根提取液更适合液态发酵紫芝。
2.7 不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝发酵液核苷含量分析
灵芝富含多种核苷类活性成分[28‐29]，现阶段关于灵芝核苷的研究已经证实灵芝中含有尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺嘌呤等多种核苷[30]，但对核苷含量提升研究鲜有报道。本研究通过使用铁核桃壳与三七须根提取液对赤芝和紫芝进行液态发酵处理，采用高效液相色谱法检测不同灵芝样品中核苷类成分的含量。
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝发酵液中核苷含量见表7。
表7 铁核桃壳与三七须根固态发酵赤芝发酵液核苷含量
Table7 Nucleoside content in liquid fermentation broth of Ganoderma lucidum using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
mg/L
组别a b c d e f g CK CK1尿苷156.21±8.55 128.96±2.65 273.63±1.59 175.83±4.11 102.40±2.23 132.95±6.67 0.57±25.65 7.93±0.65 3.64±0.61鸟苷87.42±1.85 53.62±0.93 146.50±2.60 97.70±1.78 36.30±2.43 46.49±1.59 1.31±0.20 5.94±0.24 1.52±0.27腺嘌呤5.80±0.40 17.80±1.57 41.64±1.62 19.15±1.00 33.75±2.03 12.45±2.08 0.49±0.21 6.25±0.90 1.99±0.20
不同比例铁核桃壳与三七须根液态发酵紫芝发酵液中核苷含量见表8。
表8 铁核桃壳与三七须根固态发酵紫芝发酵液核苷含量
Table8 Nucleoside content in liquid fermentation broth of Ganoderma sinense using Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots
mg/L
组别a b c d e f g CK CK1尿苷1.08±0.04 43.68±1.99 237.48±5.76 208.43±4.03 241.83±5.44 120.83±4.04 49.44±2.10 2.37±0.65 1.95±0.22鸟苷2.50±0.21 33.56±2.05 120.48±1.84 161.03±2.10 176.88±2.76 73.74±1.59 41.72±2.21 2.84±0.25 1.03±0.09腺嘌呤2.52±0.25 4.72±0.50 56.02±2.55 1.59±0.33 6.58±0.42 16.58±1.14 2.31±0.34 21.20±1.07 2.45±0.24
由表7、表8可知，赤芝与紫芝发酵液中的尿苷、鸟苷和腺嘌呤含量均为试验组整体高于对照组，并且尿苷的含量最高。赤芝的最适发酵配方为c 组，在c组中尿苷、鸟苷、腺嘌呤含量均最高，分别为273.63、146.50、41.64 mg/L，紫芝最适发酵配方为c 组，在c 组中尿苷、鸟苷、腺嘌呤含量分别为237.48、120.48、56.02 mg/L，并且核苷总含量优于紫芝，证明不同品种的灵芝中核苷成分确实存在差异。
综上所述，赤芝与紫芝液态发酵后其最适发酵配发主要集中在c 组和d 组，通过比较c 组中紫芝的多糖和三萜含量，赤芝与紫芝的核苷、氨基酸、粗蛋白、微量元素含量均最多，d 组中只有赤芝的多糖、三萜及总皂苷含量最多，因此综合所有活性成分得出赤芝与紫芝菌株的最适发酵配发均为c 组（铁核桃壳∶三七须根质量比45∶35），在该配方下赤芝与紫芝中的大多数活性成分含量都能得到提升。
2.8 铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝菌丝皂苷种类分析
铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝菌丝、紫芝菌丝中皂苷种类的分析见图9、图10。
图9 铁核桃壳与三七须根质量比为35∶45 时液态发酵赤芝菌丝的皂苷种类
Fig.9 Saponin species in Ganoderma lucidum mycelia from liquid fermentation with Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots at a mass ratio of 35∶45
图10 铁核桃壳与三七须根质量比为25∶55 时液态发酵紫芝菌丝的皂苷种类
Fig.10 Saponin species in Ganoderma sinense mycelia from liquid fermentation with Juglans sigillata shells and Panax notoginseng roots at a mass ratio of 25∶55
铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝菌丝皂苷种类与含量分析见表9。
表9 液态发酵赤芝与紫芝中皂苷种类及含量
Table9 Saponin species content in Ganoderma lucidum and Ganoderma sinense after liquid fermentationµg/g
组别赤芝铁核桃壳∶三七须根质量比35∶45紫芝铁核桃壳∶三七须根质量比25∶55三七皂苷R1 85.01 69.02人参皂苷Rg1 745.19 465.63人参皂苷Re 42.34 143.73人参皂苷Rb1 69.18 216.28人参皂苷Rd 1 288.75 417.81
灵芝中含有多种皂苷包括人参皂苷F1、F3、Rf等[31]，通过图9、图10可以看出，赤芝与紫芝菌丝中含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 几种皂苷成分，并且赤芝菌丝对人参皂苷Rd 的富集效果最好，达1 288.75µg/g，其次是人参皂苷Rg1 达到745.19µg/g；紫芝菌丝对人参皂苷Rg1 的富集效果最好达465.63µg/g，其次是人参皂苷Rd 达到417.81µg/g。
综上所述，使用铁核桃壳与三七须根提取液发酵赤芝与紫芝，对赤芝与紫芝活性成分合成有促进作用，都显著高于使用木屑与棉籽壳提取液发酵的传统基质。并且通过液相色谱分析，灵芝菌丝对三七须根中的皂苷成分有富集效果。因此使用铁核桃壳与三七须根提取液可作为灵芝新的液态发酵基质。
3 结论
本试验采用铁核桃壳与三七须根为发酵基质，通过液态发酵探究两者不同配比对灵芝发酵液中多糖、三萜、总皂苷、微量元素、粗蛋白、氨基酸以及核苷含量的影响。结果表明，使用铁核桃壳与三七须根液态发酵赤芝与紫芝，对赤芝与紫芝活性成分含量均有很好的提升效果，且大部分的活性成分在铁核桃与三七须根质量比为45∶35 时含量最高，为灵芝液态发酵最适配方，在该配方下，灵芝中的各个活性成分都能达到最佳平衡，可以提高灵芝中活性成分的产量。
高效液相色谱分析显示，发酵菌丝中含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 等，这些皂苷种类与灵芝本身含有皂苷种类不同，证明了灵芝菌丝对三七须根中皂苷成分具有富集效果。综上所述，本试验为铁核桃壳与三七须根的资源利用及灵芝发酵工业化生产提供了理论依据和试验指导。
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