白酒是我国的传统蒸馏酒，是世界上六大蒸馏酒之一[1‐2]。我国白酒生产以边糖化边发酵的固态酿造工艺为主，主要以高粱、玉米、小麦等为原料[3]。白酒的主要成分是乙醇和水（占总量的98%～99%），而溶于其中的酸、酯、醇、醛等众多种类的微量有机化合物（占总量的1%～2%）所占比重虽小，但是作为白酒的呈香呈味物质，对白酒的风格和品质起着决定性作用[4]。酒曲是白酒酿造过程中曲霉、根霉及酿酒酵母等多种功能微生物的结合体，对白酒品质和产量都有很大的影响[3‐5]。酒曲中丰富的微生物类群，可以使谷物原料中的淀粉、蛋白质和脂肪等充分分解，转化生成有机酸、高级醇及酯类等物质，酿造出风味和品质优良的白酒[6‐7]。
高粱是固态发酵生产白酒的优质原料，籽粒中含有大量淀粉、适宜的蛋白质、少量脂肪和单宁，体积小、皮壳薄，利于蒸煮、糊化和曲霉菌等微生物的糖化[8]。但高粱产量低，种植面积小，一定程度上限制了白酒产能的进一步提升。玉米是重要的酿酒原料，在我国播种面积和总产量均居于粮食生产首位，对于提高白酒产能具有重要意义。玉米籽粒主要由淀粉、蛋白质和脂肪等成分组成，其中淀粉占主要部分，蛋白质和脂肪构成角质层[9‐11]。玉米中淀粉是产生乙醇的主要来源，而蛋白质和脂肪经微生物分解后会产生较多的高级醇及其他高分子有机物，进而影响玉米酒的品质。因此选育淀粉含量高、蛋白质和脂肪含量低的酿酒专用玉米品种，是发展和壮大优质白酒生产的重要途径[12‐13]。
本文以淀粉含量高、蛋白质和脂肪含量较低的玉米品种华试919 为原料，通过正交试验，筛选酿酒酵母的最佳组合，以期为进一步建立标准化的酿酒专用玉米品种酿酒适宜性鉴定规程提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乙酸正丁酯标准品（0.419 1 g/L）、白酒混合标准品（25 组分）：郑州谱析科技有限公司；白酒曲、根酶酒曲（小粬）、复合功能菌（金香霸）：安琪酵母股份有限公司；华试919 玉米：四川华丰种业有限责任公司。华试919 玉米籽粒性状测定结果见表1。
表1 华试919 玉米籽粒性状测定结果
Table1 Determination results of grain traits in corn Huashi 919
颜色黄色粒型马齿型百粒重/g 34.5容重/（g/L）735.2粗蛋白含量/%8.22粗脂肪含量/%3.85粗淀粉含量/%75.07
1.2 仪器与设备
DK‐S26 电热恒温水浴锅：上海精其仪器有限公司；MC‐E33CA11 电磁炉：美的集团股份有限公司；LRH‐150 生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；7890B‐5977A 气相色谱‐质谱联用仪：美国安捷伦公司；CJ‐JJ1 酒精计：衡水创纪仪器仪表有限公司。
1.3 方法
在前期单因素试验结果的基础上，以根酶酒曲、复合功能菌、白酒曲3 种酒曲的用量为试验因素，以白酒风味物质的隶属函数值为评价指标，三因素三水平正交试验设计见表2。
表2 酒曲组合正交试验设计
Table2 Orthogonal test design of distiller's yeast composition
处理T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9根酶酒曲用量/%1.2 1.2 1.2 1.5 1.5 1.5 1.8 1.8 1.8复合功能菌用量/%0.15 0.30 0.45 0.15 0.30 0.45 0.15 0.30 0.45白酒曲用量/%0.9 1.5 1.2 1.2 0.9 1.5 1.5 1.2 0.9
1.4 玉米半固态发酵工艺流程
玉米半固态发酵工艺流程见图1。
图1 玉米半固态发酵工艺流程
Fig.1 Semi solid fermentation process of corn
1.4.1 原粮处理
原粮处理的目的是使玉米中的淀粉充分吸收水分，以润透、煮熟、蒸开花为最好。取玉米籽粒1 000 g在清水下冲洗干净，每个处理重复3 次。在50 ℃恒温水浴锅中浸泡24 h，煮沸50 min，关火焖水1 h，取出沥水，复蒸50 min。蒸煮结束后摊开冷却到30 ℃左右。
1.4.2 做箱糖化
摊凉后按照表2添加根酶酒曲和复合功能菌并翻拌混匀，使酒曲均匀附着在玉米籽粒表面，再放入24 ℃生化培养箱中糖化24 h。
1.4.3 半固态发酵
糖化结束后，按表2添加白酒曲并翻拌混匀，转入塑料桶中，加入原粮质量分数为125%的蒸馏水，密封发酵15 d，并记录每天的温度。
1.4.4 蒸馏出酒
取酒时先去掉头酒20 mL，出酒过程分5 段，每段各接酒100 mL。每段酒分别测量酒精度与温度。
1.5 指标测定方法
1.5.1 酒精度测定
取酒100 mL 后将酒精计和温度计一起放入量筒中，测定酒精度（m，% vol）与温度（T，℃），按下列公式计算校正酒精度（m´，%vol）、出酒率（M，%）。
式中：m´1、m´2、m´3、m´4、m´5 分别为5 段酒的校正酒精度，% vol；500 为5 段酒的总体积，mL；0.35 为温度校正系数；20 为酒精度校正的基准温度（实测酒体温度每高于基准温度1 ℃，酒精度应降低0.35）。
1.5.2 挥发性风味物质测定
玉米酒挥发性风味物质使用气相色谱‐质谱联用仪进行检测。将3 次重复试验所取第1 段酒混合，取混合酒样5 mL，加入乙酸丁酯内标液100µL，摇匀，取1 mL 加标酒样，采用自动进样法进行测定。
气相色谱（gas chromatography，GC）条件：安捷伦HP ‐ INNOWAX 石 英 毛 细 管 柱（30 m×0.25 mm，0.25µm），进样口温度240 ℃；色谱柱采用程序升温，初始温度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min 速度，升温至100 ℃，再以4 ℃/min 升至230 ℃保持3 min；进样量0.5µL；不分流；载气为高纯氦气，采用恒流模式，流速1 mL/min；接口温度260 ℃。
质谱（mass spectrometry，MS）条件：离子源温度230 ℃，电离方式为电子电离（electron ionization，EI），电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 为10～200。
定性方法：通过对GC‐MS 总离子流色谱图与美国国家标准技术研究所（NationaL Institute of Standards and Technology，NIST）11 质谱库中的化合物进行比对。
定量方法：将乙酸正丁酯作为内标物，采用内标法进行定量。风味物质含量计算公式如下。
式中：H 为风味物质含量，mg/L；A 为风味物质出峰面积；A'为标准物出峰面积；H'为标准物含量，mg/L。
1.5.3 玉米酿酒特性综合评价
利用模糊数学中求隶属函数的方法，计算各指标的隶属函数进行综合评价，某指标的隶属函数计算公式如下。
式中：Zy 表示某一处理j 指标的隶属函数；zy 为某一处理j 指标的测定值；Zjmax 和Zjmin 表示j 指标的最大和最小测定值。将每一个处理的每一个指标的隶属函数相加，其值越高，表示其所酿玉米酒品质越好。
1.6 数据统计分析
使用Excel 和SPSS 对试验结果进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 各处理产酒率分析
不同出酒阶段的酒精度和折合出酒率见表3。
表3 不同出酒阶段的酒精度和出酒率
Table3 Alcohol content and alcohol yield at different stages of alcohol production
注：同列不同小写字母代表不同处理间差异显著，P<0.05。
处理T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9酒精度/%vol第1 段44.56±0.73cd 43.13±0.25de 45.63±0.53bcd 47.30±0.71b 43.84±1.08de 46.74±0.71bc 49.45±1.20a 44.52±0.49de 42.73±0.25e第2 段31.45±1.17cd 31.14±1.41c 37.74±0.74b 36.60±0.73b 33.28±0.95c 36.15±1.20b 41.78±0.95a 33.73±0.25c 30.75±0.21d第3 段21.06±1.41de 20.11±1.13e 28.75±1.20b 25.98±0.37c 23.35±0.49de 26.27±0.71c 32.42±0.71a 23.75±0.71d 22.35±1.20de第4 段14.59±1.01de 15.72±0.74cd 20.68±0.25b 16.88±0.95c 14.53±0.25de 17.13±0.95c 23.65±0.71a 14.62±1.20de 13.91±0.09e第5 段7.64±0.69c 7.65±0.71c 12.30±1.27b 13.12±0.71b 8.33±0.46c 11.46±0.49b 15.51±1.41a 11.41±0.62b 8.32±0.53c出酒率/%23.86±0.65e 23.45±0.74e 29.02±0.85b 27.98±0.66c 24.67±0.84de 27.55±0.74c 32.56±1.24a 25.61±1.01d 23.61±0.66e
由表3可知，正交试验9 个处理都是第1 段酒的酒精度最高，且不同处理之间差异明显。其中，第1 段酒的酒精度最高的依次为T7、T4 和T6，分别为49.45%vol、47.30%vol 和46.74%vol。9 个处理的第5段酒的酒精度均低于20%vol，且不同处理之间差异明显，前3 依次为T7、T4 和T3，酒精度分别为15.51%vol、13.12%vol 和12.30%vol。T7 的出酒率最高，达到32.56%；其次是T3，为29.02%；第三是T4，为27.98%，T2 最低，仅23.45%。
2.2 混合标准品测试结果
混合标准品GC‐MS 分析结果见表4。
表4 混合标准品GC‐MS 分析结果
Table4 Mixed standard GC‐MS analysis results
编号1 2 3 4成分乙醛丁酸乙酯甲醇乙酸丁酯标准++++测定++++编号14 15 16 17成分丁酸异丁醇已酸乙酯乙缩醛标准++++测定++++
续表4 混合标准品GC‐MS 分析结果
Continue Table4 Mixed standard GC‐MS analysis results
注：+表示检测出含有该种物质；-表示未检测出该种物质。
编号5 6 7 8 9 10 11 12 13成分丙酸正丙醇乳酸乙酯乙酸乙酯戊酸乙酯双乙酰糠醛仲丁醇β‐苯乙醇标准+++++++++测定-++++++-+编号18 19 20 21 22 23 24 25成分正戊酸丙酸乙酯2‐乙基丁酸正丁醇庚酸乙酯乙酸仲丁醇异戊醇标准++++++++测定++-+++++
由表4可知，经气相色谱‐质谱联用仪分析，25 组分混合标准品中，共检测到22 种物质，仅丙酸、仲丁醇和2‐乙基丁酸未被检测到，表明仪器调试准确，参数设置合理，后续试验数据有较高可靠性。
2.3 各处理酒体主要风味物质比较
对9 个处理所得的原酒（第1 段酒）风味物质进行气相色谱质谱分析，结果见表5。
表5 不同处理玉米酒风味物质含量
Table5 Content of main flavor components in corn wine samples by different treatments
mg/L
注：同行不同小写字母代表不同处理间差异显著，P<0.05。
化合物种类酯类酯类总含量醇类醇类总含量酸类酸类总含量其他类风味物质总含量序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13化合物名称乙酸乙酯乳酸乙酯丁酸乙酯乙酸异戊酯丙醇异丁醇苯乙醇2，3‐丁二醇乙酸正戊酸己酸丙酸甲氧基苯肟处理T1 206.8±9.2e 206.8 31.2±1.7e 208.3±6.7f 12.3±1.3d 251.8 105.0±5.7e 105.0 15.8±1.3d 579.4 T2 380.7±11.1b 380.7 36.3±1.3e 387.8±10.1b 31.6±2.6b 455.7 158.5±11.3b 158.5 32.8±0.9b 1 027.7 T3 240.3±9.6d 13.5±1.9b 627.5±26.1c 881.3 71.6±2.6cd 212.1±7.0f 30.1±3.8b 313.8 148.5±2.6c 148.5 30.5±1.2b 1 374.1 T4 232.6±10.1d 690.6±12.1b 923.2 77.4±4.2c 222.4±8.1f 23.5±3.2c 323.3 99.5±1.8ef 99.5 17.2±0.6d 1 363.2 T5 186.3±10.1f 453.3±15.1d 639.6 116.4±12.7a 323.1±9.1c 22.4±4.4c 461.9 132.7±5.3d 10.0±2.2b 8.0±0.4b 150.7 1 252.2 T6 418.5±6.3a 269.6±16.8a 640.2±8.4c 1 328.3 117.6±8.7a 437.9±9.2a 34.7±2.1b 590.2 171.8±3.6a 23.6±3.1a 32.0±2.1a 20.9±1.4a 248.3 68.1±2.6a 2 234.9 T7 261.5±6.9c 1 130.4±8.0a 10.2±1.6a 1 402.1 106.2±8.1ab 259.5±10.1e 50.8±2.6a 416.5 91.7±4.4f 91.7 1 910.3 T8 263.0±8.5c 9.9±2.1b 272.9 64.1±5.0d 247.0±5.1e 21.2±1.3c 332.3 90.4±2.1fg 90.4 20.1±1.4c 715.7 T9 235.7±6.5d 459.4±12.9d 695.1 96.9±5.1b 275.6±11.4d 31.3±2.5b 16.2±1.8a 420.0 81.6±2.2g 81.6 22.0±1.9c 1 218.7
由表5可知，9 个处理的玉米酒风味物质总含量分 别 为 579.4、1 027.7、1 374.1、1 363.2、1 252.2、2 234.9、1 910.3、715.7、1 218.7 mg/L。从风味物质种类来看，T6 风味物质种类最丰富，共有11 种；T3、T5、T9检测到8 种；T4、T7、T8 检测到7 种；T1、T2 检测到6 种，但9 个处理玉米酒检测到风味物质总含量和种类数都低于工厂大规模发酵原酒中近百种的检出数，这可能是由于实验室发酵规模较小。9 个处理玉米酒中酯类物质总含量分别为206.8、380.7、881.3、923.2、639.6、1 328.3、1 402.1、272.9、695.1 mg/L，酯类物质以乙酸乙酯和丁酸乙酯为主，9 个处理玉米酒均检测到乙酸乙酯，含量为186.3～418.5 mg/L，不同处理间差异明显；在6 个处理玉米酒中检测到丁酸乙酯，其含量均远高于乙酸乙酯，含量为453.3～1 130.4 mg/L，不同处理间差异明显。T6 乙酸乙酯含量最高，为418.5 mg/L，显著高于其他处理；T7 丁酸乙酯含量最高，为1 130.4 mg/L，显著高于其他处理。在3 个处理玉米酒中检测到乳酸乙酯，其中T6 含量最高，为269.6 mg/L，显著高于其他处理。仅在T7 中检测到乙酸异戊酯，但含量较低，仅10.2 mg/L。9 个处理玉米酒中醇类物质总含量分别为251.8、455.7、313.8、323.3、461.9、590.2、416.5、332.3、420.0 mg/L。9 个处理玉米酒均检测到丙醇、异丁醇和苯乙醇，其中以异丁醇为主，其含量在醇类物质总含量中占比均达到50% 以上。丙醇含量为31.2～117.6 mg/L，不同处理间差异明显；异丁醇含量为208.3～437.9 mg/L，不同处理间差异明显；苯乙醇含量为12.3～50.8 mg/L，不同处理间差异明显。T6 丙醇含量最高，但与T5、T7 差异不显著；T6 异丁醇含量最高，显著高于其他处理；T7 苯乙醇含量最高，显著高于其他处理。仅在T9 中检测到2，3‐丁二醇，但含量较低，仅16.2 mg/L。9 个处理玉米酒中酸类物质总含量分别为105.0、158.5、148.5、99.5、150.7、248.3、91.7、90.4、81.6 mg/L。9 个处理玉米酒均检测到乙酸，含量为81.6～171.8 mg/L，其中T6 最高，显著高于其余处理。在T5 和T6 中均检测到己酸和丙酸，在T6 中还检测到正戊酸，但含量均低于乙酸。除了T5 和T7，7 个处理玉米酒中均检测到甲氧基苯肟，其含量为15.8～68.1 mg/L，其中T6 最高，并显著高于其余处理。
2.4 处理效应的综合评价
以第一段酒酒精度、出酒率、酯类物质总含量、醇类物质总含量和酸类物质总含量5 个指标为参考，计算出9 个处理的综合隶属函数值，结果见表6。
表6 不同处理综合隶属函数值
Table6 Comprehensive membership function values of different treatments
参考指标第一段酒酒精度出酒率酯类物质总含量醇类物质总含量酸类物质总含量合计T1 0.27 0.05 0.00 0.00 0.14 0.46 T2 0.27 0.00 0.15 0.60 0.46 1.48 T3 0.60 0.61 0.56 0.18 0.40 2.35 T4 0.68 0.50 0.60 0.21 0.11 2.10 T5 0.06 0.13 0.36 0.62 0.41 1.58 T6 0.00 0.45 0.94 1.00 1.00 3.39 T7 1.00 1.00 1.00 0.49 0.06 3.55 T8 0.17 0.24 0.06 0.24 0.05 0.76 T9 0.43 0.02 0.41 0.50 0.00 1.36
由表6可知，T7 综合隶属函数值最高，达到3.55；其次为T6，达到3.39；T1 最低，仅0.46。T7 和T6 综合隶属函数值明显高于其余处理，说明这两个处理的出酒产量和品质均优于其余处理，具有较高的实际应用价值。
2.5 处理效应正交分析
以各处理综合隶属函数值为指标，对处理效应进行正交分析，结果见表7。
表7 处理效应正交分析
Table7 Orthogonal analysis of treatment effects
处理T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 K1 K2 K3 R根酶酒曲用量/%1.2 1.2 1.2 1.5 1.5 1.5 1.8 1.8 1.8 1.43 2.36 1.88 0.93复合功能菌用量/%0.15 0.30 0.45 0.15 0.30 0.45 0.15 0.30 0.45 2.03 1.27 2.37 1.10白酒曲用量/%0.9 1.5 1.2 1.2 0.9 1.5 1.5 1.2 0.9 1.13 1.73 2.80 1.67隶属函数值0.46 1.48 2.36 2.10 1.59 3.39 3.55 0.75 1.35
由表7可知，3 种酒曲对玉米单粮半固态发酵特性的影响程度依次为白酒曲用量>复合功能菌用量>根酶酒曲用量。3 种酒曲的最佳用量分别为白酒曲1.5%、复合功能菌0.45%、根酶酒曲1.5%，对应T6，隶属函数总值为3.39。
3 讨论与结论
酿酒专用粮品种选育及相关研究是作物育种研究的重要方面。DB 5115/T 27—2020《宜宾酿酒专用粮玉米采购和检验技术规程》规定了酿酒专用玉米、水稻、糯稻、小麦、高粱的质量指标，为酿酒专用粮品种选育提供了理论依据和实践要求。黄宁等[14]、苟才明等[15]、张倩等[16]从栽培技术和品质形成过程对酿酒专用玉米进行了相关研究。王俊等[17]建立了高光谱图像的酿酒高粱品种识别方法，胡连清等[18]对酿酒专用糯红高粱内生细菌多样性及功能菌株进行了研究，王红梅等[19]对川南白酒产区主要酿酒高粱理化性质与代谢组学进行了分析，赖上坤等[20]、张燕等[21]根据品质指标对酿酒专用高粱品种进行了筛选与评价。王海容等[22‐23]、郑建敏等[24]、吴丽娟等[25]针对籽粒品质特性对酿酒专用小麦品种进行了相关研究。上述研究多关注于栽培技术、产量和品质等方面，对品种的酿酒适宜性的评价及相关报道很少。为了深入评价酿酒专用玉米品种的酿造适宜性，本研究开展了不同酒曲组配的优化试验，为建立高通量、标准化检验评价工艺流程提供理论支持。
白酒中具有十分丰富的挥发性风味物质。白酒中挥发性风味物质是发酵物料中微生物群体对原料成分的分解、转化，及其产物之间相互产生的物理和化学作用形成的混合物质，其产生与物料、微生物、环境温度、发酵时间等诸多因素有关。孙宝国等[26]统计了文献发表的白酒中所有挥发性风味化合物，共有1 000 多种挥发性成分，其中酯类物质最多，有500 余种，其次为醇类、芳香族、酮类、杂环类、酸类等。本试验利用气相色谱‐质谱联用仪分析原酒中风味物质种类，检测到以酯类、醇类、酸类为主的13 种物质，成分相对单一。本研究的目的是建立一种在实验室对大量玉米品种进行酿酒适宜性检验标准化工艺流程，进而对玉米品种进行鉴定、评价，所得白酒仅是评价依据之一，而非最终目的。因此，为了提高检验的可操作性，每个处理选用1 000 g 玉米，发酵15 d，与工厂化生产相比，无论是物料的数量和发酵时间都大大减少，这可能是造成风味物质种类较少的主要原因。
目前研究主要针对对酿酒工艺优化及不同原料的酿酒特性，评价指标多以出酒率、酒精度、色谱分析和感官评价等为主。刘晓等[27]以己酸乙酯含量为指标，对玉米半固态法酿造浓香型白酒工艺进行优化研究；马茹菲等[28]以乙酸乙酯的含量为主要指标，对玉米液态酿造清香型白酒的主要工艺进行了优化研究；胡萍等[29]以酒精度和出酒率为指标，对高粱和玉米生料酿酒工艺进行了优化研究；李永博等[30]以出酒率为指标，对玉米与大米生料酿酒特性进行了研究。本文以出酒率、酒精度和酯类、醇类、酸类物质浓度为指标，计算出隶属函数综合值，对不同酒曲组合对玉米半固态发酵的处理效应进行综合评价，既考虑了酿造过程的产量，也考虑了产品的品质，为进一步建立标准化评价、检验玉米品种酿造适宜性的工艺流程提供了较为可靠的理论支持。
综上所述，本文以玉米华试919 为原料，优化了玉米半固态发酵的酒曲用量及组合，白酒曲、复合功能菌、根酶酒曲的用量分别为1.5%、0.45%、1.5% 时，酿制的玉米酒的出酒率、酒精度和酯类、醇类、酸类物质含量的综合评价最佳。
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