玉米须与食用菌醇提物的协同抗氧化作用

氧化是食品质量和人体健康的主要威胁之一，甚至被认为是衰老的元凶，因此寻求更优良的抗氧化剂及其组合，是当前研究的热点。玉米须为禾本科植物玉蜀黍（Zea mays L.）的花柱和柱头，又名玉米花丝，最早药用记载见于1476 年《滇南草本》，后被1977 年《中国药典》收录。研究表明玉米须主要含多糖类、黄酮类、多酚类、有机酸、苷类、矿物质等多种营养物质和功能成分[1‐2]，因此玉米须醇提物具有丰富的生物活性，其中抗氧化活性就是其最重要的功能之一，被广泛报道[3‐5]。食用菌作为餐桌上的美食，品种繁多，营养成分和功效成分含量丰富，被大众所熟知。限于其复杂的生长方式，以野生为主，目前仅少量品种可以人工栽培，因此食用菌产品价格往往相对较高。食用菌醇提物富含以多酚、黄酮等为主的多种抗氧化成分，因此表现出良好的自由基清除活性，是良好的天然抗氧化剂[6‐8]，极具开发潜力。协同增效是一种有效的方法，被广泛应用于许多领域，如功效成分提取[9]、活性成分增效作用[10‐12]、药物研究[13]等，也是目前商品中抗氧化剂联合使用的主要原因。研究显示，多种抗氧化成分间具有协同增效作用[14‐19]，如黄酮类、多酚类、花青素等，因此成为抗氧化研究的热门方向。玉米须和食用菌醇提物各自都具有良好的抗氧化活性，前者活性高，后者提取率高，如二者联合就可以开发出高产、高活性的天然复合抗氧化剂，更好地满足不同需求。但二者联合使用是否具有增效作用，研究鲜见，因此本研究着重分析二者不同比例配伍后的自由基清除能力，以期揭示二者的抗氧化协同效果，为二者联合抗氧化剂开发提供理论支持，促进相关产品的研发，也为协同增效研究提供更多支持。

1 材料和方法

1.1 材料

香菇、杏鲍菇、平菇、蟹味菇、白玉菇、玉米须：市售。

2，2´‐联氮‐双（‐3‐乙基苯并噻唑啉）‐6‐磺酸二胺盐[2，2´‐azino‐bis（‐3‐ethylbenzthiazoline）‐6‐sulphonate，ABTS]：山东西亚化学有限公司；1，1‐二苯基‐2‐苦基肼（1，1‐diphenyl‐2‐picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma 公司；无水乙醇、过氧化氢、水杨酸：天津市凯通化学试剂有限公司；福林酚：天津市光复科技有限公司；没食子酸、芦丁、石油醚、硫酸亚铁：天津市天力化学试剂有限公司；以上所用试剂均为分析纯。

S‐20 中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；101‐2B 电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗仪器厂；RE‐52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ‐D（Ⅲ）循环水式真空泵、HH‐S 恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司；TDL‐5A 离心机、TGL‐10B 离心机：上海安亭科学仪器厂；722N 可见分光光度计：上海箐华科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米须乙醇提取物制备

玉米须经清洗、烘干、粉碎过0.25 mm 筛即得玉米须粉，备用。取一定量玉米须粉，按料液比1∶20（g/mL）加入80%乙醇溶液，60 ℃水浴浸提1 h，减压过滤分离滤液与滤渣，滤液经过旋转蒸发，烘干至恒重，干燥器保存，即为玉米须醇提物。

1.2.2 食用菌预处理

将食用菌（香菇、平菇、杏鲍菇、蟹味菇、白玉菇）干燥粉碎，过0.25 mm 筛。取一定量食用菌粉，按料液比1∶10（g/mL）加入石油醚，85 ℃水浴回流2 h，减压过滤分离滤液与滤渣，滤液旋转蒸发浓缩后烘干，滤渣自然干燥后，即为脱脂食用菌粉，干燥保存。

1.2.3 食用菌乙醇提取物制备

取脱脂后食用菌粉，按料液比1∶20（g/mL）加入80%乙醇溶液，60 ℃水浴浸提1 h，减压过滤分离滤液与滤渣，滤液经过旋转蒸发，烘干至恒重，干燥器保存，即为食用菌醇提物。

1.2.4 主要活性成分测定

1.2.4.1 黄酮含量测定

准确吸取0.2 mg/mL（70% 乙醇溶解）芦丁标准品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 测试管中，加入0.3 mL 5% NaNO2 晃动均匀，静置6 min，加入0.3 mL 10% AlCl3 静置6 min，再加入4.0 mL 10% NaOH，用蒸馏水定容至10 mL，静置15 min，于510 nm 波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品溶液中芦丁的质量为横坐标制作标准曲线。样品的测定：配制浓度为2 mg/mL（80% 乙醇溶解）醇提物检测液，吸取2 mL 检测液同法测定吸光度，并代入标准曲线计算检测液中黄酮质量（以芦丁计）。黄酮含量按下列公式计算。

式中：X 为试样的黄酮含量，mg/g；m 为检测液中黄酮质量，mg；V 为测定用检测液体积，mL；C 为测定用检测液浓度，mg/mL。

1.2.4.2 总酚含量测定

准确吸取200 mg/L（蒸馏水水溶解）没食子酸标准液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL 分别置于10 mL 容量瓶中，用60% 乙醇定容至刻度，得到没食子酸工作液。然后分别吸取1 mL 工作液至测试管，加入2.5 mL 0.5 mol/L 福林酚，摇匀，加入2.5 mL 7.5% Na2CO3 溶液，4 mL 蒸馏水，晃匀，40 ℃水浴60 min，冷却后静置10 min。于778 nm 波长下测吸光度，以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。用80%乙醇溶液配制浓度为0.2 mg/mL 醇提物检测液。取1 mL 检测液同法测定吸光度值，并代入标准曲线计算检测液中总酚浓度（以没食子酸计）。总酚含量按下列公式计算。

式中：X 为试样中总酚含量，mg/g；C1 为检测液的总酚浓度，mg/L；C2 为样液浓度，mg/mL。

1.2.5 抗氧化能力测定

1.2.5.1 羟基自由基清除能力测定

参考颜军等[20]的方法，略做改动。依次加入3 mL水，1 mL 6 mmol/L 硫酸亚铁溶液，1 mL 6 mmol/L 水杨酸‐乙醇溶液于试管中，再加入2 mL 样品液（80%乙醇溶解），摇匀静置10 min，最后加入1 mL 6 mmol/L 过氧化氢溶液，37 ℃水浴加热30 min，3 000 r/min 离心10 min，在波长510 nm 处测定吸光度，记为A；以蒸馏水代替样品液，测定其吸光度，记为A0；以蒸馏水代替过氧化氢溶液，测定其吸光度，记为A1，每组平行3 次。以VC 为阳性对照。按下列公式计算羟基自由基清除率（O，%）。

1.2.5.2 DPPH 自由基清除能力测定

参照吴青等[21]的方法，并稍作修改。配制0.1 mmol/L DPPH‐无水乙醇溶液，量取2 mL 于试管中，加入2 mL 样品液（80%乙醇溶解），摇匀，置于室温避光处30 min，在517 nm 处测定吸光度A；以80%乙醇代替样品液，测定其吸光度记为A0；以80%乙醇代替DPPH溶液，测定其吸光度记为A1，每组平行3 次，以VC 为阳性对照。按下列公式计算DPPH 自由基清除率（D，%）。

1.2.5.3 ABTS+自由基清除能力测定

参照杨小倩等[22]的方法，并稍作修改。配制7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L 过硫酸钾的1∶1（体积比）混合液，置于室温避光处12～16 h，将此混合液用无水乙醇稀释配制734 nm 处吸光度（0.700±0.002）的ABTS 工作液。反应体系为2 mL 样品待测液（80%乙醇溶解）加入2 mL ABTS 工作液，充分混合均匀后置于室温避光反应6 min，测定其在734 nm 处的吸光度A；以80% 乙醇代替样品液，测定其吸光度记为A0；以80%乙醇代替ABTS 工作液，其吸光度记为A1，每组平行3 次，以VC 为阳性对照。按下列公式计算ABTS+自由基清除率（A，%）。

1.2.6 协同作用分析方法

1.2.6.1 联合指数法

1）联合指数[23]（combination index，CI）

若CI<1，两药为协同作用，值越小协同作用越强；CI=1 为相加作用；CI>1，为拮抗作用且数值越大拮抗作用越强。联合指数（C）的计算公式如下。

式中：（D）1、（D）2 为联合使用时产生X 效应时两种试剂各自所需剂量；（Dx）1、（Dx）2 为两种试剂单用产生X 效应时各自剂量。

2）剂量减少指数[23]

剂量减少指数（dose‐reduction index，DRI）用来衡量相同作用水平下，协同使用时相比单独使用每种试剂剂量降低的倍数[23]，用于评价试剂联合使用前后的剂量变化幅度。比值越大，表明要达到单一试剂相同的疗效，联合使用时该试剂的剂量降低愈显著。

式中：（D）1、（D）2 为联合使用时产生X 效应时两种试剂各自所需剂量；（Dx）1、（Dx）2 为两种试剂单用产生X 效应时各自剂量；Y1，Y2 为（D）1、（D）2 对应的剂量减少指数。

1.2.6.2 等辐射分析法

比较复配物的理论IC50add 值（I）与实际试验后所得IC50mix 值的大小，若实际值小于理论值说明复配后有增效作用[24]。IC50add 值计算公式如下。

式中：A 为A 单独作用时半数抑制率；R=IC50A/IC50B，即A、B 单独作用时半数抑制率的比值；K1 与K2 分别为A、B 两种样品在复配物中的比例，K1+K2=1。

1.3 数据处理

数据采用Excel 软件处理，SPSS 软件进行统计分析（P<0.05），试验中数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 5 种食用菌醇提物清除自由基能力

杏鲍菇、平菇、蟹味菇、白玉菇和香菇醇提物对羟基自由基、DPPH 自由基和ABTS+自由基清除的IC50值见表1。

由表1可知，5 种食用菌醇提物的清除羟基自由基能力由强到弱排序为蟹味菇>平菇>香菇>白玉菇>杏鲍菇，其中蟹味菇、平菇和香菇的IC50 值在3.38～3.87 g/mL，显著低于另外两个品种（P<0.05），并且三者间相差较小，表明蟹味菇、平菇和香菇清除羟基自由基能力较接近，但明显高于白玉菇和杏鲍菇；在5 种食用菌醇提物的DPPH 自由基清除能力中，香菇清除能力最强，其IC50 值为658.40µg/mL，远低于其他4 个品种，其次是蟹味菇，IC50 值为1 109.87µg/mL，而另外3 种食用菌醇提物的清除能力大幅下降；5 种食用菌醇提物对ABTS+自由基的清除作用有差异，香菇和蟹味菇的清除能力明显高于其他3 种食用菌，且两者比较接近，IC50 值分别为298.02µg/mL 和224.55µg/mL。

比较3 种自由基清除效果发现不同品种食用菌提取的醇提物中，蟹味菇和香菇的羟基自由基清除活性非常高；香菇的DPPH 自由基清除活性明显优于其他4 种食用菌；香菇和蟹味菇对ABTS+自由基清除活性较优。综合试验结果，香菇的整体抗氧化活性表现都比较优秀，因此后续选择使用香菇醇提物与玉米须醇提物进行协同抗氧化研究。

5 种食用菌乙醇提取物黄酮和总酚含量见表2。

由表2可知，香菇醇提物的黄酮和总酚含量分别为（15.64±0.24）mg/g 和（38.63±1.36）mg/g，均不是5 种食用菌中最高的，表明其醇提物中除黄酮和总酚类抗氧化物质外，可能含有其他高效抗氧化活性成分。

2.2 玉米须与香菇醇提物协同清除羟基自由基活性

2.2.1 玉米须和香菇醇提物单独和复配使用对羟基自由基清除作用

玉米须和香菇醇提物单独和按不同质量比复配时对羟基自由基清除的IC50 值见表3。

由表3可知，玉米须醇提物和香菇醇提物抗氧化活性差别比较大，前者清除羟基自由基能力明显高于后者，并且不同质量比复配醇提物的清除效果也都显著优于香菇醇提物；当复配质量比小于1∶1 时，随着玉米须醇提物添加比例增大IC50 值呈下降趋势，而随着香菇醇提物添加比例增大IC50 值呈上升趋势。

2.2.2 玉米须与香菇复配醇提物清除羟基自由基协同作用分析

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除羟基自由基协同分析见表4。

由表4可知，除玉米须与香菇醇提物质量比为2∶1 和3∶1 组外，其他3 组的IC50mix 值均小于IC50add 值，且CI 值也小于1，表现为协同作用，但CI 值均在0.9以上，说明协同效果不是很强。根据CI 值协同作用排序为玉米须与香菇醇提物质量比1∶1>玉米须与香菇醇提物质量比1∶2>玉米须与香菇醇提物质量比1∶3，可见当复配物中香菇醇提物占比大于50%时，随着玉米须醇提物占比的增加，协同效果增强，而当香菇醇提物比例小于50% 时，二者没有协同作用，说明二者的协同作用主要贡献者是玉米须醇提物。

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除羟基自由基的DRI 值见表5。

DRI 值大于1 不能代表二者一定具有协同作用，而CI 值小于1 则表示二者具有协同作用，DRI 值越大，表明要达到单一样品相同的疗效，复配使用时此样品的使用剂量降低得越明显[23]。由表5可知，所有试验组玉米须醇提物与香菇醇提物的DRI 值均大于1，说明二者联合使用时，能起到降低各自使用剂量的作用。相同复配质量比条件下，两种物质相比，香菇醇提物的DRI 值更大，表明复配使用时香菇醇提物的剂量降低作用比玉米须醇提物显著。随着复配使用中香菇醇提物占比的逐步减少，香菇醇提物的DRI 值由1.68一直增加到6.46，降低剂量作用逐步增强，说明复配使用时玉米须醇提物可能在协同中起到主要作用。该结论和CI 值分析结果一致。

2.3 玉米须与香菇醇提物协同清除DPPH 自由基活性

2.3.1 玉米须和香菇醇提物单独和复配使用对DPPH自由基清除作用

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除DPPH 自由基的IC50 值见表6。

由表6可知，玉米须醇提物与香菇醇提物清除DPPH 自由基的能力差异较大，前者比后者高2.27 倍；与羟自由基清除能力相似，当复配质量比小于1∶1 时，不同质量比复配醇提物IC50 值随玉米须添加量的增加逐渐减小，随着香菇醇提物比例的增加逐渐增大；复配质量比为1∶1 和3∶1 的IC50 值小于玉米须和香菇醇提物单独使用IC50 值，表明在这两种配比下二者可能具有协同作用；复配后，所有比例的IC50 值均低于香菇醇提物，表明复配物的清除能力均高于香菇醇提物。

2.3.2 玉米须与香菇复配醇提物清除DPPH 自由基协同作用分析

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除DPPH 自由基协同分析见表7。

由表7可知，所有比例复配物的IC50mix 值均小于IC50add 值，且CI 值均小于1，表现为协同作用；由CI 值可知，不同复配质量比对协同效果有影响，复配质量比1∶1 时CI 值（0.505）小于其他质量比，可见复配质量比1∶1 时协同效果明显优于其他质量比，表现出极强的协同抗氧化作用，其他4 个质量比的CI 值相差较小，表明其协同效果差异较小。

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除DPPH 自由基的DRI 值见表8。

由表8可知，玉米须醇提物与香菇醇提物DRI 值均大于1，说明联合使用能有效减少玉米须和香菇使用剂量；复配质量比为1∶3 时，玉米须醇提物DRI值最大，为2.96，表明减小剂量最明显；复配质量比为3∶1 时，香菇醇提物DRI 值最大，为9.77，表明减小剂量最显著。同清除羟自由基分析结果相似，两种物质相比，香菇醇提物的DRI 值在多数配伍比例下大于玉米须醇提物，且DRI 值更大（如DRI 香菇最大值为9.77，而DRI 玉米须最大值仅有2.96），表明联合使用时香菇醇提物的减小剂量效果比玉米须醇提物更好。

2.4 玉米须与香菇醇提物协同清除ABTS+自由基活性

2.4.1 玉米须和香菇的醇提物单独和复配使用对ABTS+自由基清除作用

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除ABTS+自由基的IC50 值见表9。

由表9可知，通过对比IC50 值，发现玉米须醇提物清除ABTS+自由基的能力明显优于香菇醇提物，也明显优于不同比例的复配物；所有比例复配物都优于香菇醇提物单独使用，至少提高3 倍；IC50 值随玉米须醇提物在复配物中占比的增加而降低，随香菇醇提物占比增加而升高，3∶1 时复配物对ABTS+自由基的清除效果最佳。

2.4.2 玉米须与香菇复配醇提物清除ABTS+自由基协同作用分析

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除ABTS+自由基协同作用分析见表10。

由表10可知，除复配质量比为3∶1 外，其他4 组复配物IC50mix 值均小于IC50add 值，CI 值均小于1，表现为协同作用。依据CI 值，协同能力排序为复配质量比1∶3>复配质量比1∶2>复配质量比1∶1>2∶1，其中前3 个质量比协同效果相差不大（CI 值均在0.8 上下），而复配质量比2∶1 的CI 值接近1，仅表现出微弱的协同作用。

不同质量比玉米须与香菇醇提物清除ABTS+自由基的DRI 值见表11。

由表11可知，玉米须和香菇醇提物按不同质量比使用时，玉米须醇提物的DRI 值，除比例为3∶1，其他4 组复配物DRI 值均大于1，香菇醇提物5 组复配物DRI 值均大于1，表明复配使用能有效减少玉米须醇提物与香菇醇提物的使用剂量以及会产生协同作用。同时发现，玉米须醇提物的DRI 值虽大于1，但最大未超过2，而香菇的DRI 值都比较大，最小4.31，表明复配使用时香菇醇提物的减小剂量效果比玉米须醇提物更好。

3 讨论与结论

盛雪飞[25]的研究显示黄酮类化合物间具有良好的协同抗氧化效果。研究表明α‐生育酚和γ‐谷维素、虾青素和β‐胡萝卜素、原花青素和原儿茶酸、黄酮类化合物与类胡萝卜素协同抗氧化[15‐17，26]。玉米须和香菇醇提物中都含有丰富的以黄酮、多酚、花青素等为代表的抗氧化成分，但由于原料的不同，其各自所含的抗氧化成分种类和数量存在较大差异，二者复配时，这些抗氧化成分间发挥协同作用，可能是两种醇提物复配发挥协同作用的主要机制。本研究通过评价玉米须醇提物、香菇醇提物的抗氧化作用，并进行不同比例的复配，研究二者清除羟自由基、DPPH 自由基和ABTS+自由基时的协同表现。采用联合指数法和等辐射分析法分析协同效果，两种评价方法均证实，经复配后，当清除率为50% 时，对3 种自由基的清除，二者都有协同作用，不同复配比例对协同效果有影响，整体而言，1∶1复配比例协同效果最佳；清除3 种自由基协同研究中均发现，复配物中玉米须醇提物占比小于50% 时，协同作用优于占比大于50%的情况，说明二者的协同作用主要贡献者是玉米须醇提物；且复配使用时都具有减小各自剂量的作用（DRI 玉米须和DRI 香菇均大于1），其中香菇的DRI 值较大，表明复配使用时香菇醇提物的减小剂量作用比玉米须醇提物更好；由CI 值的大小可知，清除DPPH 自由基时的协同作用最佳，其次是清除ABTS+自由基，而清除羟自由基最差。

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