上皮间质转化（epithelial‐mesenchymal transition，EMT）是指具有上皮细胞生物学特点的细胞在各类因素刺激下转化为间质细胞，失去原有上皮细胞功能的过程。EMT 在特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的发生发展过程中起着关键作用[1]。IPF是由多因素导致的进行性加重性肺间质疾病，也是众多肺部疾病的终末表现结果；主要特征为肺上皮细胞严重受损，肌成纤维化细胞和胶原的异常增殖与沉积致使损伤后过度修复[2]。而驱动IPF 发生的核心因素主要包括肺泡上皮细胞的持续性损伤、过度凋亡以及伴随发生的异常修复[3]。在EMT 过程中，肺泡上皮细胞失去正常的胞间黏附性，细胞间隙增大；细胞形态从原本的卵圆状或多边状向长梭状改变，并获取一些间质特性，如侵袭、迁移并产生细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。在上皮表型丢失和间充质表型获得的过程中会产生相关蛋白生物标志物，是否发生EMT 可以通过检测这些生物标志物来进行判断。即细胞黏附分子细胞上皮钙黏蛋白（E‐cadherin，E‐cad）表达降低，细胞骨架蛋白中波形蛋白（vimentin，Vim）、α‐平滑肌肌动蛋白（α‐smooth muscle actin，α‐SMA）表达升高[4‐5]。此外，α‐SMA 还可参与形成Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，Col Ⅰ），Col Ⅰ在正常人总间质胶原的占比为50% 以上，对于肺部拉伸和扩张性的维持有重要意义[6]。胶原的合成与降解在机体内处于动态平衡状态，在EMT 发生过程中，该平衡遭到破坏，Col Ⅰ表达增加致使ECM 沉积。HYP 作为Col Ⅰ中含量最高的氨基酸，不仅是衡量机体胶原组织代谢的重要指标，也可用作Col Ⅰ的检测指标，其与Col Ⅰ的含量呈正相关性[7]，故此本试验通过测定HYP 含量来反映细胞胶原组织代谢平衡变化情况。纤维化因子是EMT 发生的关键介质，二者之间存在正相关关联。其中，TGF‐β被认为是最重要的致纤维化因子。当TGF‐β 被激活，通过调节相关基因转录，促使上皮间质转化发生，在持续性损伤及纤维化因子作用下，EMT 将继续存在并引起成纤维细胞的聚集[5，8]。因肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AECs）是促成肺纤维化的主要细胞，且EMT 是肺纤维化进程中的早期现象；故此恢复AECs功能或是治疗肺纤维化的重要环节[9]。
IPF 患者的中位生存期为2～3 年，5 年生存率小于30%[10]。吡 非 尼 酮（pirfenidone）和 尼 达 尼 布（nint‐edanib）作为特异性治疗IPF 的药物亦存在诸多不良反应[11]，而天然产物不仅含有诸多抗炎、抗氧化活性成分，且具有多靶点、多器官整体性调节、不良反应较小等特点，被视为抗肺纤维化药物的潜在来源[12]。目前，从天然产物中分离出的多糖聚合物近乎数千种，多糖已然成为生物生命活动中不可或缺的大分子[13]。随着对天然多糖研究的不断深入，越来越多研究表明植物多糖具有良好的抗肺纤维化特性[14]，而现有报道的研究大多聚焦于黄芪、猪苓、当归等中草药多糖[15‐17]，天然食物来源性植物多糖的潜力则有待发掘。刺梨与黑皮鸡枞菌皆因其良好的抗氧化能力而备受关注，有人将其称为“水果维C 王”及“菌中之侯”[18‐19]。刺梨（Rosa roxburghii Tratt，RRT）不仅是西南地区经济作物之一，且其富含诸多具有抗炎、抗氧化、提升免疫力等功能的生物活性成分[20‐23]；黑皮鸡枞菌（Oudemansiella raphanipies，OR）作为菌菇类的新起之秀，对其生物活性成分及其功效作用的研究鲜见。前期研究发现刺梨汁可缓解TGF‐β 诱导的小鼠肺纤维化[24]，但欠缺对其中的生物活性成分作进一步研究；赵化杰[23]发现黑皮鸡枞菌菌丝体多糖可缓解CCl4 诱导的小鼠肝纤维化。故此本研究选用刺梨及黑皮鸡枞菌通过超声辅助水提法进行多糖提取，并对刺梨多糖、黑皮鸡枞菌多糖抑制人肺上皮细胞间质转化的作用及对IPF 可能的药效作用进行初步探索，以期为特发性肺纤维化的临床治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
刺梨（“贵农5 号”）：贵州省盘州市胜境街道刺梨基地；黑皮鸡枞菌：盛宝阁食品有限公司；人肺泡上皮细胞A549（A549 细胞）：四川大学生物治疗国家重点实验室提供；高糖培养基（Dulbecco´s modified eagle me‐dium，DMEM）：美国Hyclone 公司；0.25% 胰蛋白酶消化液、青链酶素：美国Gibco 公司；胎牛血清：香港塞尔博克斯生物制品贸易有限公司；二喹啉甲酸（bicincho‐ninic acid assay，BCA）法蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（ripa lysis buffer，RIPA）、活性氧检测试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate‐polyacrylamide gel electrophoresis，SDS‐PAGE）上样缓冲液：上海碧云天生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）：北京兰杰柯科技有限公司；TGF‐β1：上海近岸蛋白质科技有限公司；羟脯氨酸测定试剂盒（消化法）：南京建成生物工程研究所；磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂：美国Selleck 公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒、标记性蛋白：上海雅酶生物医药科技有限公司；山羊抗兔/鼠IgG/HRP、β‐肌动蛋白抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司；E‐cad 抗体、Vim抗体、α‐SMA 抗体：英国Abcam 公司；乙酸乙酯、丙酮（均为分析纯）：四川大学华西公共卫生学院实验中心。
1.1.2 仪器与设备
冷冻干燥机（LGJ‐50A）：上海争巧科学仪器有限公司；细胞恒温敷箱（HCP‐168）：青岛海尔特种设备有限公司；离心机（L530）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；全自动细胞计数仪（IE 1000）：上海睿钰生物科技有限公司；酶标仪（IVD‐1410101）：美国Thermo Fisher Scientific 公司；流式细胞仪（NovoCyteTM5201002216）：美国ACEA Biosciences 公司；倒置显微镜（CKX41）：日本OLYMPUS 公司；超声破碎仪（VC750/VCX500）：美国SONICS 公司；SDS‐PAGE 电泳仪（Cavoy Mini P‐4）：北京凯元信瑞仪器有限公司；磁力搅拌器（MS5）：群安科学仪器（浙江）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 刺梨、黑皮鸡枞菌多糖提取
刺梨鲜果切片，40 ℃烘干48 h，随后粉碎得刺梨干粉。按料液比1∶1.8（g/mL）加入乙酸乙酯浸泡过夜以除去小分子物质，次日更换乙酸乙酯继续浸泡过夜；弃去原有乙酸乙酯，按料液比1∶1.8（g/mL）加入丙酮浸泡过夜进行脱脂，次日更换丙酮继续浸泡过夜。弃去丙酮废液，按料液比1∶30（g/mL）加入生理盐水在常温下超声4 h，回收上清液，得刺梨多糖提取液，共提取2 次。刺梨多糖提取液置于磁力搅拌器上，按1∶1.5（体积比）用30% 过氧化氢溶液滴注脱色；脱色完成后，按正丁醇与氯仿体积比1∶2 配制Savage 试剂，加入提取液1/4 体积的Savage 试剂搅拌振荡40 min，收集刺梨多糖上清液。将刺梨多糖上清液转移至透析袋中，于室温下浸泡在超纯水中进行透析处理，每隔2 h进行一次换水，待透析袋中有絮状物析出即可结束透析。收集透析好的刺梨多糖溶液，置于冷冻干燥机中冷冻干燥72 h，最后得白色固体为刺梨多糖。黑皮鸡枞菌多糖提取方式同上。
1.2.2 刺梨多糖含量测定
采用苯酚‐硫酸比色法[25]测定两种多糖溶液的吸光度，以葡萄糖溶液的质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），620 nm 波长下的吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，根据标准曲线计算得到刺梨、黑皮鸡枞菌多糖含量。
1.2.3 细胞培养
A549 细胞生长于DMEM 培养基（10% 胎牛血清、1% 青霉素‐链霉素）中，置于37 ℃、5% CO2 的细胞恒温敷箱中培养。当细胞密度达到80%～90% 时，吸弃旧培养基，用3 mL 无菌PBS 清洗细胞后，加入2 mL 胰蛋白酶消化液（0.25%）消化细胞并吹打均匀。细胞消化后，根据培养皿底面积按照1∶2～1∶3（体积比）的比例进行传代。取对数生长期的细胞用于后续试验。
1.2.4 MTT 法检测细胞增殖能力
取对数生长期的A549 细胞，收集细胞悬液，在1 000 r/min 条件下离心3 min，加入3 mL 培养基重悬后取20µL 细胞悬液计数。根据细胞生长特征，按1.5×103 个/孔的细胞密度，将A549 细胞接种至96 孔板中，边孔加入200µL 无菌PBS，放入37 ℃、5% CO2的孵箱中孵育至细胞贴壁。待细胞贴壁后，按照每孔0、50、100、150、200、250、300、400、500µg/mL 的浓度加样，每组设置3 个复孔，样品干预24 h 后，避光，每孔加入20µL MTT 溶液，随后放入37 ℃、5% CO2 的培养箱中孵育3 h，孵育后，设置酶标仪波长为492 nm 用于测定其吸光度。
1.2.5 细胞分组
将细胞分为空白对照组、模型组（10 ng/mL TGF‐β1）和干预组分别为黑皮鸡枞菌多糖低、中、高剂量组（50、100、150µg/mL）及刺梨多糖低、中、高剂量组（120、150、180µg/mL）。
1.2.6 细胞形态学观察
选取对数生长期的A549 细胞，按2×105 个/孔的细胞密度，将A549 细胞接种至6 孔板中，待细胞贴壁后，按上述分组处理细胞。干预24 h 后，将6 孔板取出于倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。
1.2.7 蛋白免疫印迹法（western blot，WB）检测EMT相关蛋白
取对数生长期的A549 细胞，按2×105 个/孔的细胞密度将A549 细胞接种至6 孔板中，待细胞贴壁后，按不同干预组浓度处理细胞24 h 后，收集细胞，加入含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液200µL，随后进行涡旋、超声处理，在12 000 r/min 条件下离心10 min，弃去沉淀，取上清液，即得到蛋白。
采用BCA 法测定蛋白浓度，蛋白浓度定量后加入上清液体积1/4 的SDS 混匀，在100 ℃、8 min 条件下使蛋白变性。取变性后的蛋白样品进行上样、电泳、转膜、封闭，Tris 缓冲溶液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜3 次；加入E‐cad（稀释体积比1∶1 000）、Vim（稀释体积比1∶1 000）、α‐SMA（稀释体积比1∶1 000）和β‐肌动蛋白（稀释体积比1∶1 000）蛋白的一抗，将其放入4 ℃封闭过夜，而后TBST 洗膜3 次；室温孵育二抗（1∶3 000），置于摇床上孵育1 h，TBST 洗膜3 次，避光，加入增强化学发光液（enhanced chemilumi‐nescence，ECL）避光显影，使用Image J 软件分析各蛋白条带灰度值。
1.2.8 消化法检测羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量
将培养24 h 的细胞进行消化并在1 000 r/min 条件下离心3 min 以收集细胞，用PBS 洗涤两次，同样条件下离心再次收集细胞。随后用1 mL PBS 重悬细胞，并在35% 功率下超声3 次，每次3 s，以充分裂解细胞。3 000 r/min 离心5 min，取上清液用于后续检测。按HYP 检测试剂盒操作如下：按说明配制消化液及试剂一、试剂二、试剂三溶液，分别取800µL 裂解液上清液和梯度稀释的标准品加入含80µL 消化液的EP 管中，混匀，37 ℃水浴3 h；各管加入800µL 试剂一溶液，混匀，室温静置10 min；随后各管加入800µL 试剂二溶液，混匀，室温静置5 min；最后各管加入1.6 mL 试剂三溶液，混匀，60 ℃水浴15 min；待流水冷却后，3 500 r/min 离心10 min，取上清液在550 nm 处以双蒸水调零，测定各管吸光度A，绘制标准曲线。以PBS 和5µg/mL 的HYP 标准液分别作为空白管和标准管，操作同上。根据公式（1）计算裂解液上清液的HYP 浓度（H，µg/mL）。
式中：C 标准为标准液浓度，5µg/mL；N 为样本测试前稀释倍数；A 测定为实验管吸光度；A 空白为空白管吸光度；A 标准为标准管吸光度。
1.2.9 细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定
根据活性氧检测试剂盒说明书测定ROS 水平，在避光条件下，按体积比1∶1 000 用无血清培养基稀释2，7‐二氯荧光素二乙酸酯（2，7‐dichlorofluorescin diac‐etate，DCFH‐DA）；各组细胞培养24 h 后，吸弃原有培养基，使用PBS 洗涤两次，每孔加入1 mL 稀释好的DCFH‐DA，于37 ℃细胞培养箱孵育30 min，孵育结束后用无血清培养基洗涤3 次，随后收集细胞，并用500µL PBS 重悬细胞，用流式细胞仪异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）通道测定细胞ROS水平。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。结果以平均值±标准差表示。当数据符合正态分布且方差齐性时，采用单因素方差分析检验；当方差不齐时，采用近似t 检验。以P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两种提取物多糖含量结果
由葡萄糖标准曲线得回归方程：Y=0.244 6X-0.002 2（R2=0.999 7），计算得刺梨多糖含量为84.3%，黑皮鸡枞菌多糖含量为87.6%。
2.2 两种多糖对A549 细胞增殖能力的影响
用不同浓度刺梨多糖（Rosa roxburghii Tratt poly‐saccharide，RRTP）、黑皮鸡枞菌多糖（Oudemansiella raphanipes polysaccharide，ORP）干预A549 细胞24 h后，对A549 细胞增殖能力的影响见图1。
图1 两种多糖对A549 细胞增殖能力的影响
Fig.1 Effects of two kinds of polysaccharides on proliferation of A549 cells
与空白对照组（0µg/mL）相比，*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；***表示差异高度显著（P<0.001）。
由图1可知，与空白对照组（0µg/mL）相比，各干预组细胞存活率均有所下降，且具有统计学意义。结果表明，RRTP、ORP 均能够抑制A549 细胞的增殖，且呈一定的剂量依赖性。当两种多糖溶液浓度低于200µg/mL 时，细胞存活率高于90%，因此，选取黑皮鸡枞菌多糖浓度50、100、150µg/mL，刺梨多糖浓度120、150、180µg/mL 为后续试验的给药剂量范围。
2.3 两种多糖对细胞形态的影响
两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞形态变化的影响如图2所示。
图2 两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞形态变化的影响
Fig.2 Effects of two kinds of polysaccharides on TGF‐β1‐induced morphological changes of A549 cells
由图2可知，空白对照组A549 细胞为梭形或不规则多边形，细胞排列规则，呈上皮细胞样形态；与空白对照组相比，模型组细胞间距增大，形态狭长化，趋向于成纤维细胞。同模型组相比，随着干预剂量的增大，ORP、RRTP 干预组细胞间隙及形态变化程度逐步减轻，说明两种多糖皆可抑制部分细胞上皮间质转化，有利于维持上皮细胞样形态。
2.4 两种多糖对A549 细胞HYP 含量的影响
两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞HYP 含量的影响如图3所示。
图3 两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞HYP 含量的影响
Fig.3 Effects of two kinds of polysaccharides on HYP content in A549 cells exposed to TGF‐β1
与空白对照组相比，###表示差异高度显著（P<0.001）；与模型组相比，*表示差异显著（P<0.05），***表示差异高度显著（P<0.001）。
由图3可知，与空白对照组相比，模型组HYP 含量高度显著升高（P<0.001）。与模型组相比，ORP 各剂量干预组HYP 含量均高度显著下降（P<0.001）；RRTP各剂量干预组HYP 含量均显著下降（P<0.05、P<0.001、P<0.001），说明两种多糖均能以剂量依赖式减少肺纤维化进程中的胶原合成。
2.5 两种多糖对A549 细胞ROS 含量的影响
两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞ROS 含量的影响如图4所示。
图4 两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞ROS 含量的影响
Fig.4 Effects of two kinds of polysaccharides on ROS content in A549 cells exposed to TGF‐β1
A.流式细胞仪ROS 测定图；B.细胞内ROS 定量图。FITC‐H 为异硫氰酸荧光素荧光信号脉冲高度；M2 为阴性细胞群，即未发生ROS 响应的细胞群。与空白对照组相比，###表示差异高度显著（P<0.001）；与模型组相比，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01），***表示差异高度显著（P<0.001）。
由图4可知，与空白对照组相比，模型组ROS 含量显著升高（P<0.001）。与模型组相比，高剂量ORP干预组ROS 含量有所下降（P<0.01），中、高剂量RRTP干预组ROS 含量显著下降（P<0.05、P<0.001），且呈一定的剂量依赖性。
2.6 两种多糖对A549 细胞EMT 相关蛋白表达的影响
两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞E‐cad、Vim、α‐SMA 表达的影响如图5所示。
图5 两种多糖对TGF‐β1 诱导A549 细胞E‐cad、Vim、α‐SMA 表达的影响
Fig.5 Effects of two kinds of polysaccharides on expression of E‐cadherin，vimentin，and α‐SMA in A549 cells exposed to TGF‐β1
A.EMT 标志性生物蛋白；B.E‐cad 表达情况；C.α‐SMA 表达情况；D.Vim 表达情况。与空白对照组相比，##表示差异极显著（P<0.01）；###表示差异高度显著（P<0.001）；与模型组相比，***表示差异高度显著（P<0.001）。
由图5可知，与空白对照组相比，模型组E‐cad 蛋白表达水平极显著降低（P<0.01），α‐SMA、Vim 蛋白表达水平高度显著增高（P<0.001）。与模型组相比，中、高剂量ORP 干预组及RRTP 干预组E‐cad 蛋白表达水平高度显著增高（P<0.001）；ORP、RRTP 各剂量干预组α‐SMA 蛋白表达水平均有高度显著降低（P<0.001）；ORP 中、高剂量干预组Vim 蛋白表达水平高度显著降低（P<0.001），RRTP 各剂量干预组Vim 蛋白表达水平均高度显著降低（P<0.001），差异具有统计学意义。
3 结论
本研究参照朱嘉玺等[26]的多糖提取方法并加以调整，所得刺梨多糖及黑皮鸡枞菌多糖含量较高，可用于后续试验研究。在前期预试验中，通过检测两种多糖对细胞内ROS 含量的降低程度，筛选出不同的作用剂量，发现两种多糖的有效剂量范围存在一定差异，但均低于200µg/mL，这与朱庆均等[27]的研究一致。本研究结果显示，完成EMT 诱导建模后，两种多糖中、高剂量干预组可以明显改善A549 形态，促使其从长梭形向卵圆形及多边形转化，减小细胞间距，减少间质细胞占比，且两种多糖中、高剂量干预组皆可以显著下调Vim、α‐SMA 的表达，上调E‐cad 的表达，减少HYP 的含量，减缓EMT 程度；当干预剂量均为150µg/mL 时，观察到黑皮鸡枞菌多糖抑制EMT 的效果略优于刺梨多糖。陈丽娟等[28]和Jing 等[29]研究发现，TGF‐β 诱导上皮间质转化的过程中常伴随着ROS 的升高，且随着时间的延长，ROS 含量不断增高，加快细胞凋亡、加重EMT 程度。本研究发现经过TGF‐β1 诱导建模后，模型组ROS 含量显著增高；两种多糖高剂量干预组均可明显降低ROS 含量，减轻细胞损伤，其中刺梨多糖的效果优于黑皮鸡枞菌多糖。综上所述，刺梨多糖与黑皮鸡枞菌多糖对TGF‐β1 诱导的A549 细胞上皮间质转化皆有一定抑制作用，且均具有一定的剂量依赖性，黑皮鸡枞菌多糖或许能在相对较小剂量内发挥抑制EMT 的作用；但从两种多糖降低细胞ROS 含量效果来看，刺梨多糖或许具有更优越的抗氧化活性。关于二者缓解肺纤维化的具体效果及活性有待进一步的体内实验验证。
随着刺梨产业的欣欣向荣，刺梨食品开发与刺梨生物活性成分药理作用研究也在同步并行，刺梨发酵食品不仅能提升抗氧化能力，还能节约成本[30‐31]；刺梨多糖提取物协同药物治疗可显著提升小鼠胰腺癌的治疗效果[32]。黑皮鸡枞菌因具有良好的口感、营养价值和潜在的医学价值现已实现人工培育[33]，但其中的生物活性成分及其药理作用还有待进一步研究。本研究表明，刺梨多糖与黑皮鸡枞菌多糖能一定程度抑制TGF‐β 诱导的肺泡上皮细胞的EMT 进程，从而减缓肺纤维化程度，有利于IPF 治疗新药的后续研发，也有助于推动刺梨与黑皮鸡枞菌功能性产品开发的进一步发展。
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