乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类可利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌[1-2]。目前，乳酸菌作为发酵剂在发酵蔬菜中得到广泛的应用，加速了传统自然发酵模式向工业化直投式发酵模式的转变[3-4]。乳酸菌在蔬菜发酵过程中可以利用原料中的蛋白质、碳水化合物、脂肪等产生丰富的代谢产物，这些代谢产物赋予了发酵蔬菜独特的口感、品质和发酵风味[5-6]。其中乳酸菌产生的有机酸，如乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等不仅可以使发酵蔬菜产生特有的鲜、酸味，还能起到抑菌防腐、延长保质期的作用[7-8]。因此，筛选具有强产酸能力的乳酸菌对于制备优良蔬菜发酵剂是非常必要的。
此外，很多乳酸菌都具有益生特性，它作为一种益生菌在食品加工、医疗、医药等领域具有重要应用价值[9-10]。研究发现，乳酸菌的抗衰老、抗癌、降胆固醇、调节肠道菌群、增加免疫力等功效与乳酸菌的抗氧化特性息息相关[11-13]。因此，乳酸菌的抗氧化特性是评价乳酸菌益生特性的重要指标[14-15]。目前的研究主要集中在乳酸菌活菌的抗氧化活性，然而大多数乳酸菌在存放过程中活菌数会大幅度降低，导致活性乳酸菌的益生功能大幅度下降。后生元是指一类由灭活微生物、微生物裂解物、菌体成分和代谢产物组成的复杂混合物，是对宿主健康有益的无生命微生物制剂[16-17]。它除了具有抗逆性强、稳定性高、方便易用等优点，还具备改善便秘、预防结肠炎、缓解肥胖、改善皮肤屏障等功能[18-19]。但是相较于活性乳酸菌，后生元的开发和研究目前较少。不过随着研究的深入，后生元将成为研究的热点和重点。
本研究以传统发酵蔬菜食品中筛选得到的60 株菌株为研究对象，对其产酸能力、菌落形态、革兰氏染色进行测定，优选出产酸能力强的菌株，对其耐胃酸、耐胆盐和亚硝酸盐降解能力进行评估，并利用16S rDNA 测序对菌株进行种属鉴定，同时对菌株的活菌和后生元（死菌片段、胞内提取物、发酵上清液）的抗氧化能力进行对比，探讨其抗氧化作用机制，以期为开发新的抗氧化活性物质提供参考。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂
以传统发酵蔬菜中筛选分离得到的60 株菌为试验对象，菌株均使用甘油保存于-80 ℃。MRS 肉汤培养基：青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色液试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；甘油、氢氧化钠、磷酸、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、无水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、过硫酸钾、亚油酸、吐温、硫酸亚铁、双氧水、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、丁基化羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁醇（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
YXQ-LB 立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1FD 洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DHG-9070A 电热恒温培养箱、HWS-26 电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；FE28-Standard 超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；Velocity 18R Pro 高速离心机：英国Dynamica 公司；HJ-6A 磁力搅拌器：金坛区西城新瑞仪器厂；TD10001B 电子天平：余姚市金诺天平仪器有限公司；Spectra 190 全波长酶标仪：美谷分子仪器(上海)有限公司；ECLIPSE 50i 光学显微镜：日本尼康公司；FiveEasy Plus pH 计：梅特勒托利多国际有限公司；DW-86L290 低温保存箱：澳柯玛股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乳酸菌菌落形态、革兰氏染色及产酸测定
取出种子接种于MRS 培养基，37 ℃下培养24 h进行菌株活化。
菌落形态：将活化好的菌液进行稀释，取100 µL稀释液涂布于固体MRS 培养基上，37 ℃下培养48 h后观察菌落形态。
革兰氏染色：菌株活化好后用接种环蘸取少量菌液均匀涂抹在载玻片上，用酒精灯的外焰烘干固定后进行革兰氏染色试验，100 倍油镜观察细菌形态。
产酸检测：将活化好的菌株混匀，8 000 r/min 离心5 min。保留上清发酵液，用pH 计测量发酵液的pH 值。
1.3.2 乳酸菌分子生物学鉴定
采用细菌DNA 提取试剂盒对菌株的DNA 进行提取，使用27F/1492R 引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩展。扩展片段送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果在国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上进行BLAST 比对，使用MEGA11软件构建系统发育树。
1.3.3 乳酸菌耐酸、耐胆盐、亚硝酸盐降解能力及生长曲线测定
乳酸菌耐酸、耐胆盐试验参照忻晓庭等[20]的方法。将活化的菌液在8 000 r/min 下离心5 min，无菌水洗涤两遍后获得菌泥。向菌泥中加入900 µL 人工胃液，于37 ℃下孵育3 h 后在8 000 r/min 下离心5 min 弃上清液，菌体沉淀用无菌水洗涤两遍后加入MRS 液体培养基，于37 ℃下培养24 h，每隔0.5 h 取样用酶标仪在波长600 nm 处测定吸光值，绘制耐胃酸生长曲线。向另一菌泥中加入900 µL 人工小肠液，于37 ℃下孵育3 h 后在8 000 r/min 下离心5 min 弃上清液，菌体沉淀用无菌水洗涤两遍后加入含0.3% 牛胆盐的MRS 液体培养基中，于37 ℃下培养24 h，每隔0.5 h 取样用酶标仪在波长600 nm 处测定吸光值，绘制耐胆盐生长曲线。
亚硝酸盐降解能力测定：活化的菌株（2%）接种于MRS 培养基中（含250 mg/mL NaNO2），在37 ℃下培养16 h。采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定发酵前后培养基中亚硝酸钠的含量。亚硝酸盐降解率（A，%）计算公式如下。
式中：m0 为发酵前亚硝酸盐含量，mg；m 为发酵后亚硝酸盐含量，mg。
生长曲线：将活化的菌株以2%接种于MRS 肉汤培养基中，在37 ℃下培养24 h，期间每隔0.5 h 用酶标仪在600 nm 下测定吸光值并绘制生长曲线。
1.3.4 非靶标代谢组学检测
检测流程：活化的乳酸菌在8 000 r/min 下离心5 min 后取上清，每个样本取400 µL。分别加入1.2 mL提取液（甲醇∶乙腈=1∶1，体积比），涡旋30 s 混匀。40 kHz冰上超声1 h，-20 ℃冷冻沉淀2 h。12 000 r/min、4 ℃离心15 min 后，吸取上清液浓缩旋干。加入300 µL 70% 甲醇复溶，超声5 min 后，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，吸取200 µL 至进样瓶，用于超高效液相色谱质谱联用（ultra performance liquid chromatography/mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析。样本上清液各取50 µL混合至质量控制标准溶液进样瓶中待上机，用于质量控制分析。
色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 µm，2.1 mm×100 mm）；流动相A 为98% H2O、2% 乙腈、0.1% 甲酸；流动相B 为98% 乙腈、2% H2O、0.1% 甲酸。流速0.4 mL/min，柱温40 ℃。平衡时间1.5 min，梯度洗脱时间20 min。
质谱条件：采集分析模式Sensitivity；毛细管电压ESI+为3 kV、ESI-为2 kV；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度500 ℃；脱溶剂气流速800 L/h；反向锥孔气流50 L/h。数据采集采用数据非依赖性采集MSE 模式，采集质量范围m/z 50～1 000，每个循环采集时间为0.3 s，碎裂能10～45 eV，正负离子模式分别采集。采集过程同时注入亮氨酸-脑啡肽（正离子模式下m/z 556.276 6；负离子模式下m/z 554.262 0）作为在线质量校准物以保持质量准确度。
采用Waters Progenesis QI（v 3.0.3.0）对原始数据进行解卷积。选取质量控制文件作为参考进行峰提取、对齐和面积归一化处理。
1.3.5 活菌体及后生元制备
活菌体和发酵上清液：活化的菌株在8 000 r/min、4 ℃下离心5 min，上清液即为发酵上清液，无菌水洗涤沉淀两遍后即为活菌体。
胞内提取物和死菌片段：活化的菌株在8 000 r/min、4 ℃下离心5 min，弃上清液，无菌水洗涤沉淀两遍后，用蒸汽灭菌锅灭菌（121℃、15 min），随后用超声波细胞粉碎机冰浴超声粉碎（15 min，功率400 W，隔5 s 超声1 次），将超声好的样品在8 000 r/min 下离心5 min，保留上清液为胞内提取物，沉淀为死菌片段。
1.3.6 总抗氧化能力测定[铁离子还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法]
FRAP 工作液[Fe3+三吡啶-三嗪（ferric-tri-pyridinyltriazine，Fe3+-TPTZ）溶液]制备：20 mmol/L FeCl3∙6H2O溶液、10 mmol/L TPTZ 盐酸溶液和300 mmol/L 醋酸盐缓冲液（pH3.6）按1∶1∶10（体积比）配制。
在96 孔板中，依次加入5 µL 待测样品溶液、195 µL 新鲜Fe3+-TPTZ 溶液，37 ℃下孵育10 min 后，用酶标仪在593 nm 波长下测定吸光值。PBS 作为空白对照。用0.05～0.5 mg/mL 水溶性维生素E（Trolox）溶液制作标准曲线（Y=0.584 2X+0.000 4，R2=0.997 0）。
1.3.7 DPPH 自由基清除率的测定
配制0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，冷藏放置，使用时用乙醇稀释。分别取100 µL 样品溶液（溶解于PBS中）和100 µL PBS 与等体积的DPPH 溶液充分混合，30 ℃下反应30 min，测定反应液在517 nm 处的吸光值，记为Ai和Ao，平行测定3 次。相同条件下，用100 µL乙醇代替DPPH 溶液，分别与100 µL 的样品溶液和100 µL PBS 混合反应，作为背景值，在517 nm 处的吸光值记为Aj 和A1。DPPH 自由基清除率（X，%）的计算公式如下。
1.3.8 ABTS+自由基清除率的测定
将7 mmol/L ABTS 储备液和2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液等比例混合。在室温、避光条件下静置16 h，形成ABTS+自由基储备液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734 nm 处的吸光值为0.70±0.02。取10 µL 的待测样品（溶解于PBS 中）和10 µL 的空白溶液（PBS）与190 µL 的ABTS+自由基工作液混合振荡30 s 后静置6 min，测定溶液在734 nm 处的吸光值，分别记为Ai和Ao，平行测定3 次。相同条件下，将190 µL乙醇代替ABTS+自由基工作液，分别与10 µL 的样品溶液和10 µL PBS 混合反应，作为背景值，在734 nm处的吸光值记为Aj 和A1。ABTS+自由基清除率（Y，%）的计算公式如下。
1.3.9 抑制亚油酸过氧化率测定
取0.5 mL PBS（pH7.4）与1 mL 亚油酸的乳化液混合，加入0.2 mL FeSO4 溶液（0.65 mmol/L）、0.2 mL 双氧水（0.56 mmol/L）、0.8 mL 待测样品混匀后置于37 ℃水浴反应12 h。向混合液中加入0.2 mL TCA 溶液（4%）、2 mL TBA 溶液（0.8%）、0.2 mL BHT 溶液（0.4%），混匀后在100 ℃水浴反应30 min，取出后迅速冷却，用2 mL 丁醇提取，在532 nm 处测定上清液的吸光值（Ai）。使用PBS 代替样品，在同样条件下测定吸光值（Ao）。抑制亚油酸过氧化率（Z，%）的计算公式如下。
1.4 数据统计
所有数据均重复测定3 次，应用软件SPSS 10.0 进行分析，数据经统计学处理后用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 产酸乳酸菌筛选及鉴定
高产酸乳酸菌测定结果见图1 和表1。
表1 乳酸菌的产酸、耐酸、耐胆盐和亚硝酸盐降解能力
Table 1 Acid production， acid resistance， bile salt tolerance，and nitrite reduction ability of four lactic acid bacteria
注：+++表示生长良好；++表示生长一般；-表示不生长。
菌株编号耐胃酸耐胆盐分离来源东北酸菜杭州发酵菜梗陕西酸菜河南辣椒酱JLSC2-6 CXG-9 SXSCCH-1 HNLJJ-2产酸（pH 值）3.62 3.62 3.75 3.70+++++++++++++- - ++亚硝酸盐降解率/%99.35±0.19 68.39±0.48 98.52±0.30 98.20±0.15
图1 菌株JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 的革兰氏染色、16S rDNA 系统发育树和生长曲线
Fig.1 Gram staining， 16S rDNA phylogenetic tree， and growth curve of strains JLSC2-6， CXG-9， SXSCCH-1， and HNLJJ-2
A.革兰氏染色；B.16S rDNA 系统发育树；C.生长曲线。
对不同来源发酵蔬菜中分离得到的60 株菌株的产酸能力、菌落形态、革兰氏染色进行检测，结果发现所有菌株发酵后的pH 值均为3.60～4.79，其中37 株菌株的pH 值小于4。革兰氏染色均呈阳性，菌落形态均为乳白色（白色）、隆起、表面光滑、形状规则，绝大部分细菌形态呈短杆状或长杆状，说明60 株菌均可能为乳酸菌。由表1 和图1 可知，菌株JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 发酵后pH 值较其它菌株低，均小于3.80。产酸能力是评价乳酸菌的指标之一，目前的研究表明乳酸菌产酸后的pH 值一般在3.7～5.0[21]。因此，说明这4 株乳酸菌具有较强的产酸能力。利用16S rDNA 技术对4 株菌株进行菌种鉴定，结果发现4 株菌均为植物乳植杆菌。结合菌落形态和革兰氏染色结果，将4 株菌命名为植物乳植杆菌JLSC2-6、植物乳植杆菌CXG-9、植物乳植杆菌SXSCCH-1 和植物乳植杆菌HNLJJ-2（图1B）。对4 株植物乳植杆菌的生长性能进行检测，发现其生长良好，在2.5 h 后进入对数增长期直至11 h，之后进入生长稳定期。植物乳植杆菌JLSC2-6 和植物乳植杆菌HNLJJ-2 生长最快且菌密度最高。植物乳植杆菌SXSCCH-1 生长较菌株JLSC2-6和HNLJJ-2 慢，但菌密度无明显差异，植物乳植杆菌CXG-9 菌密度相对最低。4 株菌的生长趋势与已有研究结果一致。此外，对4 株菌的耐酸、耐胆盐和亚硝酸盐降解能力进行评估，发现4 株菌均具有良好的耐胃酸特性，并且植物乳植杆菌JLSC2-6 和植物乳植杆菌HNLJJ-2 具有很好的耐胆盐特性。而植物乳植杆菌JLSC2-6、植物乳植杆菌SXSCCH-1 和植物乳植杆菌HNLJJ-2 具有很强的亚硝酸盐降解能力，降解率均大于98%，这与肖秋颖等[22]的研究结果相似。
2.2 植物乳植杆菌JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 代谢产物分析
菌株JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 代谢的主成分分析（principal components analysis， PCA）和火山图见图2。
图2 菌株JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 的代谢PCA和火山图
Fig.2 PCA and volcano plots of metabolites from strains JLSC2-6， CXG-9， SXSCCH-1， and HNLJJ-2
A. PCA 图；B.火山图。
采用UPLC-MS/MS 对菌株JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 发酵上清液的代谢物进行检测，在正离子模式下共采集10 452 个离子可与数据库匹配，经手动筛选，共获得567 个可靠定量信息的化合物（Level 2）。其中包括199 个甘油磷脂类化合物、129 个羧酸及其衍生物、82 个脂肪酰基类化合物、22 个有机氮化合物、13 个甘油糖脂类化合物、13 个吲哚及其衍生物、10 个异戊二烯脂类化合物、10 个类固醇及其衍生物、9 个糖脂类化合物、2 个黄酮类化合物和78 个其它化合物。由图2A 可知，植物乳植杆菌JLSC2-6、植物乳植杆菌HNLJJ-2 和植物乳植杆菌CXG-9 的发酵代谢物差异较小，植物乳植杆菌SXSCCH-1 的发酵代谢物与其他3 株菌的发酵代谢物差异较大。因此，利用火山图对植物乳植杆菌SXSCCH-1 的代谢产物和植物乳植杆菌JLSC2-6、植物乳植杆菌HNLJJ-2、植物乳植杆菌CXG-9 的代谢产物进行分析，结果发现有31 个化合物存在差异，15 个化合物在植物乳植杆菌SXSCCH-1 发酵液中上调，16 个化合物在植物乳植杆菌SXSCCH-1发酵液中下调（图2B）。这些差异化合物主要是羧酸及其衍生物、脂肪酰基类化合物和甘油磷脂类化合物。此结果与覃超[23]的研究结果类似。乳酸菌代谢产物作为后生元的一种，是乳酸菌进行发酵及发挥益生功能重要的活性物质。但是不同种属的乳酸菌其代谢产物具有差异性，这也是筛选优良菌株的关键指标之一。
2.3 植物乳植杆菌JLSC2-6、CXG-9、SXSCCH-1 和HNLJJ-2 及其后生元抗氧化能力
乳酸菌抗氧化特性是发挥抗癌、抗衰老等益生功能的主要途径，目前大部分的研究针对活菌[24-26]。但是乳酸菌后生元也具有与活菌相似的益生功能。因此，为进一步比较4 株植物乳植杆菌的活菌及其后生元（死菌片段、发酵上清液和胞内提取物）的抗氧化能力，对总抗氧化能力（FRAP）、DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及抑制亚油酸过氧化能力进行了检测和分析。
2.3.1 FRAP 总抗氧化能力比较
FRAP 法测定总抗氧化能力的机理是在酸性条件下，样品中的抗氧化物可以将黄棕色的Fe3+-TPTZ 还原成蓝紫色的Fe2+-TPTZ，并可在593 nm 处测得其吸光值计算出样品的总抗氧化值。乳酸菌各个菌体片段FRAP 总抗氧化能力结果见表2。
表2 乳酸菌各个菌体片段FRAP 总抗氧化能力
Table 2 FRAP total antioxidant capacity of each fragment from lactic acid bacteria
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
FRAP 值/（µg Trolox/mL）编号后生元发酵上清液79.13±1.78a 76.43±1.75b 78.19±2.11a 72.23±1.26b JLSC2-6 CXG-9 SXSCCH-1 HNLJJ-2活菌92.16±5.18a 32.04±2.65c 39.64±2.13b 38.00±2.29bc胞内提取物45.62±3.22a 38.14±11.37a 15.68±11.27b 18.42±3.32b死菌片段5.57±1.22a 5.95±1.39a 6.59±1.90a 7.18±1.67a
由表2 可知，4 株植物乳植杆菌活菌的总抗氧化活性最好的是菌株JLSC2-6，其活菌的总抗氧化值高达（92.16±5.18）µg Trolox/mL，其它3 株菌的活菌总抗氧化能力均显著低于JLSC2-6。此外，JLSC2-6 的发酵上清液和胞内提取物的总抗氧化值在4 株菌株中也最高，分别高达（79.13±1.78）、（45.62±3.22） µg Trolox/mL。但是4 株菌株中死菌片段的FRAP 值均较低，且无显著差异（p>0.05），可能的原因是高温处理灭活了大部分菌体成分的抗氧化活性。植物乳植杆菌JLSC2-6 不管是活菌体还是其后生元都具有最好的总抗氧化活性。而这4 株菌的后生元中，发酵上清液的总抗氧化活性最强，可能是菌体的胞外代谢物导致，与刘洋等[27]的结论相似。
2.3.2 DPPH 自由基清除能力比较
DPPH 自由基清除试验原理是当样品具有自由基清除能力时，可以将深紫色的DPPH 自由基还原成无色或浅黄色的非自由基，可以通过测量吸光值的变化，计算样品的自由基清除率。乳酸菌各个菌体片段对DPPH 自由基的清除作用见表3。
表3 乳酸菌各个菌体片段对DPPH 自由基的清除作用
Table 3 DPPH free radical scavenging activity of each fragment from lactic acid bacteria
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
DPPH 自由基清除率/%编号活菌后生元发酵上清液91.55±1.98a 91.35±0.38a 91.93±0.67a 91.48±0.53a JLSC2-6 CXG-9 SXSCCH-1 HNLJJ-2 85.11±0.50a 75.99±2.30ab 79.33±0.44ab 63.88±13.49c胞内提取物64.64±14.94a 45.63±4.54b 42.89±4.53b 41.75±3.07b死菌片段48.69±2.32a 40.03±4.25b 25.23±4.22c 36.12±3.30b
由表3 可知，4 株菌的活菌对DPPH 自由基清除率最高的是JLSC2-6，其次是SXSCCH-1、CXG-9 和HNLJJ-2。对于后生元而言，胞内提取物对DPPH 自由基清除率最高的是JLSC2-6，达（64.64±14.94）%，显著高于其它3 株菌。死菌对DPPH 自由基清除率最高的是JLSC2-6，其次是CXG-9、HNLJJ-2 和SXSCCH-1。而发酵上清液对DPPH 自由基清除率最高的是SXSCCH-1，之后依次是JLSC2-6、HNLJJ-2 和CXG-9，但是相互之间无显著差异。研究表明，菌体的DPPH自由基清能力与菌体所产的多糖有关。植物乳植杆菌JLSC2-6 无论是活菌体还是后生元，DPPH 自由基清除率均好于其它3 株菌，说明植物乳植杆菌JLSC2-6 具有较好的多糖合成能力。此外，发酵上清液的DPPH自由基清除率明显高于活菌、胞内提取物和死菌体，可能是清除DPPH 自由基的活性物质主要是代谢产物而非胞内物质，这与相关文献结果一致[24，28]。
2.3.3 ABTS+自由基清除能力比较
ABTS 测定抗氧化能力的机理是ABTS 与过硫酸钾反应会生成稳定的蓝绿色阳离子，样品中的抗氧化物质能将ABTS+还原，导致体系绿色减退，在734 nm处吸收波长最大，通过测定反应后样品的吸光值可以反映出其抗氧化能力。乳酸菌各个菌体片段对ABTS+自由基清除率见表4。
表4 乳酸菌各个菌体片段ABTS+自由基清除率
Table 4 ABTS+ free radical scavenging activity of each fragment from lactic acid bacteria
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
ABTS+自由基清除率/%编号后生元JLSC2-6 CXG-9 SXSCCH-1 HNLJJ-2活菌35.05±4.74b 45.89±3.36a 38.45±3.14b 49.88±1.84a胞内提取物17.26±4.94a 11.20±0.48b 12.99±0.63ab 14.03±1.39ab死菌片段76.90±0.61c 82.23±1.40b 85.45±2.30a 80.35±0.22b发酵上清液27.79±4.99a 21.05±1.32b 21.50±0.37b 18.72±0.68b
由表4 可知，活菌对ABTS+自由基清除率最高的是菌株HNLJJ-2，清除率为（49.88±1.84）%，其次为CXG-9、SXSCCH-1 和JLSC2-6。而死菌对ABTS+自由基清除率最高的是菌株SXSCCH-1，为（85.45±2.30）%，其次为CXG-9、HNLJJ-2 和JLSC2-6。而JLSC2-6 胞内提取物对ABTS+自由基清除率略高于其他3 株菌，与CXG-9 差异显著（p<0.05），与另外两株差异不显著（p>0.05）。JLSC2-6 发酵上清液对ABTS+自由基清除率同样最好，显著高于其它3 株菌。此外，在后生元中死菌的ABTS+自由基清除率高于其它两个后生元，说明清除ABTS+自由基的活性物质可能是细胞成分，如细胞表面蛋白、细胞壁多糖、肽聚糖等。赵智等[29]发现菌株ET-22 热灭活菌体的羟自由基清除率显著高于活菌和代谢产物，但具体原因仍需要深入研究。
2.3.4 抑制亚油酸过氧化率比较
抗脂质过氧化试验是检测抗氧化活性的另一种常用方法，其原理为不饱和体系氧化产物同硫代巴比妥酸（TBA）反应物为红色，并在532 nm 有强吸收，吸收的程度可以反映样品的抗氧化活性。乳酸菌各个菌体片段的抑制亚油酸过氧化率见表5。
表5 乳酸菌各个菌体片段的抑制亚油酸过氧化率
Table 5 Linoleic acid peroxidation inhibition rate of each fragment from lactic acid bacteria
注：N 表示未检出；同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
抑制亚油酸过氧化率/%编号后生元发酵上清液JLSC2-6 CXG-9 SXSCCH-1 HNLJJ-2活菌18.63±4.08b 25.71±3.56b 51.80±5.93a 24.10±3.61b胞内提取物29.06±1.69a 14.49±9.86b 9.22±0.28b 16.00±3.43b死菌片段49.58±1.00b 46.77±1.43c 61.12±0.63a 49.11±1.79bc N N N N
由表5 可知，由于发酵上清液在523 nm 处吸光值大于PBS 对照组吸光值，所以发酵上清液不能抑制亚油酸的过氧化，这可能与发酵上清液本身含有颜色及包含的代谢物有关，具体原因需进一步研究。4 株菌的活菌体抑制亚油酸过氧化率最好的是SXSCCH-1，显著高于其他3 株菌株（p<0.05）。胞内提取物的抑制亚油酸过氧化率最好的是JLSC2-6，为（29.06±1.69）%，显著高于其他3 株菌株（p<0.05）。菌株SXSCCH-1 的死菌体抑制亚油酸过氧化率最好，最差的是菌株CXG-9。且死菌体的抑制亚油酸过氧化率均高于胞内提取物，这一结果与ABTS+自由基清除率的结果一致，说明抑制亚油酸过氧化率高的活性物质可能是细胞成分，具体原因有待深入发掘。
3 结论
本试验从60 株菌株中筛选得到4 株具有高产酸能力的菌株，通过菌落形态、革兰氏染色结合16S rDNA 测序技术鉴定其为植物乳植杆菌，命名为植物乳植杆菌JLSC2-6、植物乳植杆菌CXG-9、植物乳植杆菌SXSCCH-1 和植物乳植杆菌HNLJJ-2。对4 株植物乳植杆菌的耐酸、耐胆盐和亚硝酸盐降解能力进行检测，发现其均具有良好的耐酸特性，并且植物乳植杆菌JLSC2-6 和植物乳植杆菌HNLJJ-2 具有良好的耐胆盐特性。而植物乳植杆菌JLSC2-6、植物乳植杆菌SXSCCH-1 和植物乳植杆菌HNLJJ-2 具有很强的亚硝酸盐降解能力，降解率均大于98%。非靶代谢组学分析发现植物乳植杆菌SXSCCH-1 的代谢产物与其它3 株具有差异性，这些差异化合物主要是羧酸及其衍生物、脂肪酰基类化合物和甘油磷脂类化合物。抗氧化试验发现，植物乳植杆菌JLSC2-6 无论是活菌还是其后生元均具有最好的总抗氧化能力和DPPH 自由基清除能力。植物乳植杆菌HNLJJ-2 活菌对ABTS+自由基清除率最高，植物乳植杆菌SXSCCH-1 死菌对ABTS+自由基清除率最高，植物乳植杆菌JLSC2-6 的胞内提取物和发酵上清液对ABTS+自由基清除率最高。此外，植物乳植杆菌SXSCCH-1 活菌体的抑制亚油酸过氧化率最高，植物乳植杆菌JLSC2-6 胞内提取物的抑制亚油酸过氧化率最高，而植物乳植杆菌SXSCCH-1的死菌体抑制亚油酸过氧化率最高。综上，同一菌株的各部分以及不同菌株之间的抗氧化能力差异较大，说明抗氧化活性的有效成分位于不同的部位且具有菌株差异性，这为今后深入探究乳酸菌及其后生元的抗氧化机制及应用提供了理论参考。
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