酱香型白酒因其香气突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长的风格而广受欢迎。独特的香气和口感源于复杂的酿造工艺，即一年为一次的生产周期，经贮存勾调而成，复杂的酿造工艺与微生物生长代谢、风味物质的形成及基酒产量、质量的稳定密切相关[1-3]。
堆积发酵是酱香型白酒生产的一个特殊工序环节，通过堆积发酵实现网罗和富集各类微生物以及酶类，为入窖发酵创造条件，因此又被称为“二次制曲”[4-6]。酱香型白酒的风味成分主要是在酿造过程中由微生物代谢产生的，不同轮次的发酵酒醅中微生物结构存在显著差异。Zhang 等[7]探讨了第一、二、三轮次酱香型白酒发酵过程中真菌群落结构，发现真菌多样性随着发酵的次数增加而增加。任婷婷[8]等利用高通量测序技术和数理统计分析方法，对龟仙洞洞口酱香酒第一轮次堆积发酵酒醅中的微生物群落结构进行解析，结果表明了一轮次主导细菌门为壁厚菌门（Firmicutes），真菌门为子囊菌门（Ascomycota）占据主导地位，真菌群落结构在前48 h 受淀粉含量影响较大，随着发酵的进行，72～120 h 真菌群落结构受温度、水分、酸度和还原糖的影响。张红霞[9]研究结果表明造沙轮次至三轮次酒醅中细菌和真菌的多样性均随发酵轮次先上升后下降，毕赤酵母属和酿酒酵母属为优势微生物，一轮次发酵酒醅中毕赤酵母的丰度保持在70%以上，且一轮次及造沙轮次的早期群落构建过程中，酵母菌群尤其是毕赤酵母比例对酱香型白酒酿造菌群稳态的构建起到关键的作用。Liang 等[10]研究表明酱香型白酒7 个轮次发酵过程中优势细菌属包括乳杆菌属（Lɑctobɑcillus）、枝芽孢杆菌属（Virgibɑcillus）、陶厄氏菌属（Thɑuerɑ）和克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtiɑ）；优势真菌属包括丝衣霉属（Byssochlɑmys）、丝孢酵母属（Cutɑneotrichosporon）和Apiotrichum，并定性定量了47 种挥发性化合物，解析了微生物群落变化与风味物质的形成的相关性。刘晓光等[11]归纳总结了堆积发酵过程微生物的种类和数量与白酒的产质量有很大关系。一轮次是酱香型白酒7 个产酒轮次中的首次取酒轮次，因此，对堆积发酵过程酒醅中的微生物群落结构及数量的研究有利于进一步认识酱香型白酒一轮次堆积发酵机理及生产特性。
本文以酱香型白酒一轮次堆积发酵过程的酒醅为研究对象，采用高通量测序技术及可培养方法对微生物多样性进行解析，同时采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法及气相色谱（gas chromatography，GC）法对酒醅中的风味物质进行测定，构建优势微生物群落间及其与风味物质间的相互作用关系，以期为进一步解析酱香型白酒一轮次堆积发酵过程相关机制的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
孟加拉红培养基、营养琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；华伦斯坦实验室营养琼脂（Wallerstein Laboratory nutrient agar，WL）培养基：上海博微生物科技有限公司；DNA 提取试剂盒：美国OMEGA BioTek 公司；聚合酶链式反应引物：上海翌圣生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2F 无菌操作台：苏州净化设备有限公司；ZQPW-70 全温振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；SB25-12DT 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；KG-AP32L 自动蒸汽灭菌器：日本ALP 公司；ETC811 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：北京东胜创新生物科技有限公司；DYCZ-21 电泳仪：北京市六一仪器厂；FR-1000 凝胶成像系统：上海复日科技有限公司；GC 8890 气相色谱仪、1260 高效液相色谱仪、CP97723 CP-Wax 57 CB 毛细管柱（50 m×0.25 mm×0.25 µm）：美国Agilent 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品采集
一轮次堆积发酵酒醅样品采集自制酒生产车间。酒醅从完全收堆后开始采集（从发酵第0 天至入窖），当堆积发酵酒醅顶温达到50 ℃左右时即停止采样。样品采集后立即装入无菌自封袋中，置于4 ℃带有冰袋的泡沫盒中，快速运回实验室，从完全收堆至酒醅入窖堆积发酵8 d，共采样8 次，按糖化堆不同位置采集到酒醅小样48 份，混合后得综合样8 份。取样位置如图1 所示。将堆积过程所取样品分成堆积前期、堆积中期及堆积末期，分别记为一轮次堆积前期（1I）、一轮次堆积中期（1M）、一轮次堆积后期（1L）。
图1 堆积发酵取样示意图
Fig.1 Schematic diagram of sampling during stacking fermentation
A.上层中心，距离顶端约30 cm；B.上层表面，与A 在同一水平面，距离表面约20 cm；C.中层中心，在地面和堆顶的中间；D.中层表面，与C 在同一水平面，距离表面约20 cm；E.底层中心，距离地面约30 cm；F.底层表面，与E 在同一水平面，距离表面约20 cm。
1.3.2 可培养微生物的计数
酒醅中可培养微生物的计数方法采用稀释涂布平板法，分别使用WL 培养基计数酒醅中的酵母菌、孟加拉红培养基计数丝状真菌和营养琼脂培养基计数细菌，酵母菌及丝状真菌于28 ℃培养48 h，细菌于37 ℃培养48 h，培养结束后记录菌落总数。
1.3.3 酒醅中乳酸、乙酸的测定
酒醅中乳酸、乙酸的含量采用高效液相色谱法进行测定。酒醅样品前处理（直接进样法）参考赵欣怡等[12]的方法。
1.3.4 酒醅风味物质成分的测定
酒醅样品前处理方法同1.3.3 一致。气相色谱（gas chromatography，GC）标准品及GC 条件均参照王金龙等[13]的方法。
1.3.5 酒醅总DNA 提取及扩增
总DNA 提取：按照DNA 试剂盒E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit 提取试剂盒方法提取DNA。细菌16S V3～V4 区域片段，选择341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）为扩增引物；真菌采用ITS3（GCATCGATGAAGAACGCAGC）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）为扩增引物。
PCR 扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25 次循环；72 ℃终延伸5 min 降至4 ℃。PCR 反应体系为：2×Hieff® Robust PCR Master Mix15 µL，正向及反向引物各1 µL，DNA模板20～30 ng，使用ddH2O 补齐体系至30 µL。
1.3.6 高通量测序
采用Illumina Miseq 测序平台，分别对细菌16S rRNA 基因V3～V4 区、真菌ITS3～ITS4 区进行高通量测序分析。
1.4 数据处理及统计
微生物分类注释基于UNITE 和Silva 数据库，Chao1、Shannon 和Simpson 指数等Alpha 多样性分析利用QIIME 软件进行分析。经EXCEL 统计后，物种丰度柱状图采用Origin2022 绘制；IBM SPSS Statistics23.0 进行显著性分析；将处理好的数据进行斯皮尔曼相关系数分析后，利用Cytoscape 软件绘制相关性网络分析图[14]，韦恩图采用TBtools 软件进行绘制；微生物群落与挥发性化合物的相关性热图采用https：//www.omicshare.com/云平台进行绘制[15]。
2 结果与分析
2.1 可培样微生物变化情况
为探究堆积过程可培养微生物的变化情况，采用稀释涂布平板法对堆积过程的菌落数量进行计数，结果如表1 所示。
表1 堆积过程中可培养微生物菌落总数的变化
Table 1 Changes in cultivable microorganisms during the stacking process
注：同列不同小写字母表示存在显著性差异（p<0.05）；ND 表示未检出。
堆积发酵时间/d 0（完堆）1 2 3 4 5 6 7（下窖）细菌数量/（cfu/g）（5.75±0.6）×105h（6.55±1.39）×105g（7.83±7.16）×105c（8.75±4.17）×105b（1.19±0.59）×106a（7.75±2.08）×105d（6.70±1.79）×105e（6.62±2.91）×105f酵母菌数量/（cfu/g）（1.70±0.75）×103g（5.50±0.44）×103f（2.09±3.24）×104e（2.13±1.17）×104d（2.16±1.09）×104d（3.67±8.21）×105c（1.83±1.26）×106b（2.47±1.70）×106a丝状真菌数量/（cfu/g）（1.97±0.17）×103a（1.74±0.78）×103c（1.63±0.72）×103d（1.83±0.62）×103b（1.41±1.61）×103e ND ND ND
由表1 可知，酱香型白酒一轮次酒醅从完堆到入窖，细菌数量呈先上升后下降的趋势，在堆积第4 天时，数量的上升至1.19×106 cfu/g；酵母菌数量呈上升趋势，在堆积第7 天达2.47×106 cfu/g；丝状真菌数量在堆积前5 d 维持在103 cfu/g 的数量级后逐渐下降至无法检出；表明在一轮次堆积过程中主要以酵母和细菌为主，随堆积发酵时间延长，堆积温度升高，酵母菌和细菌在数量上占有绝对的优势，且优势菌群的生长抑制丝状真菌的生长，这与徐佳等[16]的研究结果一致。
2.2 免培养微生物多样性分析
2.2.1 高通量测序数据质量评价
对酱香型白酒一轮次堆积发酵过程酒醅样品进行高通量测序，操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）韦恩图如图2 所示。
图2 OTU 韦恩图
Fig.2 Venn diagrams of OTUs
A.细菌；B.真菌。
由图2 可知，通过对原始序列的质量控制后共得到377 919 条有效序列，其中细菌122 430 条、真菌255 489 条，长度平均为460 bp 和310 bp。为得到每个OTU 对应的物种信息，按照97% 相似水平下对OTU 进行分类，细菌多样性得到308 个OTU、真菌多样性得到108 个OTU；在不同的堆积发酵阶段共有的细菌OTU 为33 个、真菌为7 个。酒醅中细菌和真菌测序覆盖率均为0.99 以上，表明几乎所有样本均被检出，测序结果可有效地反映其酒醅在堆积过程中细菌和真菌群落多样性组成情况。
2.2.2 Alpha 多样性分析
Alpha 多样性可反映酒醅样品整体微生物丰度和多样性，描述微生物群落特征，结果如表2 所示。
表2 Alpha 多样性指数
Table 2 Alpha diversity index
样本名称1I 1M 1L细菌多样性Shannon指数2.50 2.76 2.56 Chao指数247.00 360.54 302.03 Simpson指数0.16 0.13 0.14真菌多样性Shannon指数1.66 2.03 1.64 Chao指数102.25 101.75 113.14 Simpson指数0.39 0.26 0.30
由表2 可知，在堆积发酵中期（1M）Shannon 指数最大、Simpson 指数最低，由此可见，其堆积发酵中期（1M）微生物群落多样性最为丰富。随发酵的进行，堆积温度升高，促进微生物的生长繁殖，到堆积后期，多数微生物的生长受优势菌群的影响，发酵后期微生物多样性演替为单一优势菌种发酵模式，因此，在堆积发酵中期微生物群落多样性最丰富。
2.2.3 堆积发酵过程中微生物菌种多样性分析
对酱香型白酒一轮次酒醅堆积发酵过程中微生物群落结构进行分析，结果如图3 所示。
图3 酱香型白酒一轮次堆积发酵过程中微生物群落结构的变化
Fig.3 Changes of microbial community structure during the firstround stacking fermentation of Maotai-flavor Baijiu
A、C 分别为门级和属级的细菌组成；B、D 为门级和属级的真菌组成。
由图3A 可知，在门水平上，酱香型白酒一轮次酒醅在堆积过程中共检出16 个细菌门，其中Firmicutes为优势菌门，在堆积过程中分别占比90.43%、76.39%、58.54%；其次是Proteobacteria，在堆积过程中相对丰度呈上升趋势。由图3B 可知，真菌共检出3 个门类，其中，Ascomycota 为绝对优势菌门，分别占比94.83%、95.19%、99.73%，且在堆积发酵过程中相对丰度呈上升趋势；其次是Mucoromycota，在堆积发酵过程中相对丰度呈下降趋势。这与胡小霞等[17]研究酱香型白酒一轮次堆积发酵结束及窖池发酵开始时以Firmicutes 为主导优势菌门、王雪山等[18]报道的白酒发酵过程中微生物菌群的演替规律由多菌种到单一厚壁菌门为主研究相一致。
由图3C、图3D 可知，在属水平上，酒醅堆积发酵过程中检出161 个细菌属、59 个真菌属（均为平均相对丰度至少在一个酒醅样品中大于1%的菌群结构）。对细菌而言，堆积发酵前期Bɑcillus（15.65%）、unclɑssified_Bɑcillɑceɑe_2（26.88%）、unclɑssified_Thermoɑctinomycetɑceɑe_1（25.94%）相对丰度较高，随发酵进行呈逐渐下降趋势；Acetobɑcter 在堆积后期相对丰度最高，为28.80%，表明随着堆积时间的延长，会使酱香型白酒一轮次酒醅的酸度增加，研究表明Acetobɑcter 发酵过程中通过强化细胞能量代谢水平以提升菌株高酸发酵的产酸强度[19]。对真菌而言，堆积发酵前期微生物多样性较为丰富，以Thermomyce（s60.58%）、Aspergillu（s15.50%）为优势菌属，堆积发酵中期及后期呈下降趋势；堆积后期以Pichiɑ（64.48%）、Kɑzɑchstɑniɑ（15.20%）、Issɑtchenkiɑ（11.76）为主，且在堆积发酵过程呈增加的趋势。
2.2.4 堆积发酵过程中优势菌种相关性分析
进一步对堆积发酵过程中的主要微生物之间的互作关系进行研究，结果如图4 所示。
图4 一轮次堆积发酵过程中微生物相互作用的相关网络
Fig.4 Correlation network of microbial interactions during the first-round stacking fermentation
A.核心细菌；B.核心真菌；实线表示正相关，虚线表示负相关。
大部分微生物菌属之间呈显著正相关调节机制。堆积发酵过程的细菌间有33 个正相关关系，真菌间有44 个正相关关系。由图4A 可知，Acetobɑcter（堆积后期相对丰度为27.99%）、unclɑssified_Lɑctobɑcillɑles（堆积后期相对丰度为18.81%）在堆积过程中有5 个负相关 节 点，与Bɑcillus、Kroppenstedtiɑ、Oceɑnobɑcillus、Stɑphylococcus、unclɑssified_Bɑcillɑceɑe_2 呈 负 相 关 关系，unclɑssified_Lɑctobɑcillɑles 与unclɑssified_Thermoɑctinomycetɑceɑe_1 呈正相关关系，表明随着堆积发酵时间的延长，产酸菌属对其它类微生物的生长有一定的抑制作用。相关研究报道Acetobɑcter 在酿酒过程中多存在于堆积发酵阶段和入池发酵的前期[20]，其能将乙醇氧化成乙酸，酸度过高会抑制酿酒酵母的生长，但适量的酸对白酒风味有一定的促进作用[21-22]。Bɑcillus在堆积过程中与Kroppenstedtiɑ、Oceɑnobɑcillus、Stɑphylococcus、unclɑssified_Bɑcillɑceɑe_2、unclɑssified_ Thermoɑctinomycetɑceɑe_1 呈正相关关系，随着堆积发酵的进行，相对丰度降低，说明堆积过程产酸物质的微生物对Bɑcillus 的生长有一定的抑制作用。
由图4B 可知，Aspergillus 在堆积发酵过程中有9 个相关性节点，其中6 个正相关节点、3 个负相关节点，与Byssochlɑmys、Rɑsɑmsoniɑ、Rhizopus、Sɑcchɑromycopsis、Thermomyces 和Zygosɑcchɑromyces 呈正相关关系，与Issɑtchenkiɑ、Kɑzɑchstɑniɑ、Pichiɑ 呈负相关关系，表明了发酵后期，优势酵母菌属在数量上占绝对优势对霉菌的生长具有抑制作用。研究表明Aspergillus 具有高产糖化酶、蛋白酶和多种风味酶类的特征，可促进酵母菌发酵产乙醇和细菌发酵生香[23-24]。Pichiɑ（堆积后期丰度为64.48%）是堆积后期的优势真菌属，与Issɑtchenkiɑ、Kɑzɑchstɑniɑ、Zygosɑcchɑromyces 呈 正 相 关关系，与Byssochlɑmys、Rɑsɑmsoniɑ、Rhizopus、Sɑcchɑromycopsis、Thermomyces 呈负相关关系，表明随堆积发酵的进行，酒醅温度酸度升高，不利于耐受效果较差的菌株生长。研究表明Pichiɑ、Kɑzɑchstɑniɑ 是酱香型白酒中酿造中优势的功能酵母菌之一，在耐酸、耐高温方面具有较好的耐受效果及优良的发酵性能[25-27]。
2.2.5 微生物群落与风味物质的相关性分析
对酱香型白酒一轮次酒醅堆积发酵过程中的31 种风味物质进行定量分析，选择含量较高的21 种风味物质与优势微生物菌群进行相关性分析，分析结果如图5 所示。
图5 堆积发酵过程中微生物群落与风味物质的相关性分析
Fig.5 Correlations between microbial taxa and flavor compounds during stacking fermentation
在酒醅堆积发酵过程中，酯类物质主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯等，其中含量较高的为亚油酸乙酯（27.36 mg/L）和乳酸乙酯（16.70 mg/L）；酸类物质主要包括庚酸、辛酸、丙酸、乙酸、异戊酸和丁酸等，堆积发酵过程中乙酸含量最高为607.18 mg/L，其次是丙酸为27.63 mg/L；醇类物质包括戊醇、1，2-丙二醇和2，3-丁二醇等，其中堆积过程1，2-丙二醇含量最高为137.51 mg/L；醛类物质包括糠醛（33.56 mg/L）、乙醛（9.10 mg/L）和异丁醛（7.66 mg/L）等；此外，醋嗡（38.26 mg/L）、戊酮在堆积过程中含量较高的风味物质。由图5 可知，酒醅中Bɑcillus 与醋嗡呈极性正相关关系，研究表明Bɑcillus 具有产乙偶姻及对乙偶姻有较高耐受浓度[28]；Acetobɑcter 与异戊酸、1-2 丙二醇呈负相关关系，是堆积后期的优势真菌属，相关研究表明Acetobɑcter 能有效利用乙醇和乳酸为碳源，发酵过程中利用高级醇（正丙醇、正丁醇）和D-葡萄糖产酸，但对乳糖和淀粉水解有抑制作用[29]；Stɑphylococcus、Kɑzɑchstɑniɑ 与5 种挥发性物质相关，与油酸乙酯、己酸丁酯、乳酸乙酯呈负相关，与乙酸呈正相关，研究表明Stɑphylococcus 可参与2，3-丁二醇代谢，Kɑzɑchstɑniɑ 作为堆积发酵过程中的标志性酵母之一，具有生成乙酸乙酯能力，对白酒风味有重要影响[30-31]；Pichiɑ 与乳酸乙酯、油酸乙酯呈正相关关系，研究表明Pichiɑ 类酵母在酿造过程中是主要的产酯酵母，在特定条件下可以使酒精发酵过程中的关键酶被激活，而且可以增加葡萄糖的吸收率和乙酸乙酯的代谢物含量[32-34]。酱香型白酒的酿造过程是多种微生物共同发酵的过程，由于微生物组成的差异，在不同的发酵过程中会形成不同的微生态系统。
3 结论
为探究酱香型白酒一轮次堆积过程的酒醅微生物群落随着堆积时间的变化规律以及风味物质的形成规律，本研究采用传统可培养技术、高通量测序技术、高效液相色谱法及气相色谱法对一轮次酒醅进行分析。研究结果表明，其堆积发酵过程中优势细菌属Bɑcillus、unclɑssified_Bɑcillɑceɑe_2、unclɑssified_Thermoɑctinomycetɑceɑe_1 随着堆积时间的延长丰度逐渐下降，但Acetobɑcter 则呈上升趋势；优势真菌属Thermomyces、Aspergillus 随着堆积时间的延长呈下降趋势，同时可培养结果表明，在堆积发酵后期丝状真菌未检出，这一结果与高通量测序结果相吻合；Pichiɑ、Kɑzɑchstɑniɑ、Issɑtchenkiɑ 随着堆积时间的延长呈增加趋势，表明酱香型白酒一轮次酒醅发酵过程中，堆积过程可以实现酿造优势微生物的有效富集，为其入窖发酵创造有利条件。在堆积发酵过程中，其细菌和真菌群落组成在微生物相互作用的驱动下，随发酵时间变化呈规律性变化。同时，对堆积发酵过程酒醅中风味物质进行鉴定并定量31 种风味物质，堆积过程中乙酸含量最高，酯类物质中含量较高的为亚油酸乙酯和乳酸乙酯；堆积过程中优势微生物群落与风味物质间相关性分析结果表明酱香型白酒一轮次酒醅的风味物质存在差异，在一定程度上是由其中微生物群落组成差异所造成的结果。本研究为进一步解析酱香型白酒一轮次堆积发酵过程相关机制的研究奠定基础。
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