柠檬酸是目前全球生产量和消费量最大的有机酸品种，中国作为柠檬酸的生产大国，2022 年全国产量达到 178 万t，占世界总产量的70%。柠檬酸来源于黑曲霉液体深层发酵，因此对于柠檬酸工业生产菌株黑曲霉的遗传改造受到诸多研究者的广泛关注。近几年随着测序手段的升级与创新，多种组学（如基因组学、代谢组学、转录组学[1]、蛋白质组学等）研究大量出现在科学研究中，人们从更深层次挖掘黑曲霉积累柠檬酸的机制[2]，黑曲霉工业生产菌株的改造达到了新高度[3]。
丙酮酸脱氢酶广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中，是线粒体中的多酶复合体[4]。丙酮酸脱氢酶复合体是由丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，E1）、二氢硫辛酸乙酰转移酶（dihydrolipoyl transacetylase，E2）和二氢硫辛酸脱氢酶（dihydrolipoic acid dehydrogenase，E3）及硫胺素焦磷酸、硫辛酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸、乙酰辅酶 A和 Mg2+ 6 种辅助因子组装而成[5]。E1、E2 和 E3 以首尾相接的形式发挥催化作用。丙酮酸脱氢酶是由α亚基和β 亚基各2 个单位形成的四聚体，α、β 亚基的分子量分别为41 kDa 和36 kDa。丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸生成乙酰辅酶A，进而进入到三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环[6]，与草酰乙酸共同参与生成柠檬酸。它所催化的反应不仅是柠檬酸合成积累途径的关键步骤，也是 TCA 循环[7]中的限速反应环节，可以作为活性调控的一个靶位点[8]。丙酮酸脱氢酶复合体在细胞代谢中处于重要枢纽位置，它使得糖代谢产生的中间产物能够顺利进入三羧酸循环，进而为柠檬酸的合成及整个三羧酸循环的运转提供了前提条件。
本文以黑曲霉CGMCC 10142 为出发菌株，利用基因工程[9]手段构建有葡聚糖苷酶 GAS 启动子和三磷酸甘油醛脱氢酶 GAP 启动子过表达丙酮酸脱氢酶基因质粒 p14、p16，并获得具有稳定遗传特性的高拷贝数丙酮酸脱氢酶菌株 p14-45 和 p16-5 菌株[10-13]。通过对突变菌株进行摇瓶发酵和放大试验验证，探究过表达丙酮酸脱氢酶菌株两个启动子的表达强度以及对柠檬酸产量的影响[14-15]，以期为后续柠檬酸生产菌的代谢工程改造提供重要依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑曲霉菌株（Aspergillus niger CGMCC 10142）、大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌 AGL 1：天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究室保藏；无水葡萄糖（分析纯）、酵母粉（生化试剂）、胰蛋白胨（生化试剂）、氯化钠（分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂；乙酰丁香酮、潮霉素 B 、氨苄青霉素、头孢噻污纳、卡那霉素：北京市索来宝科技有限公司；rTaq 酶（5 U/µL）、PrimeSTAR 高保真酶（2.5 U/µL）、限制性内切酶 EcoR I（15 U/µL）、Bgl II（10 U/µL）、BamH I（15 U/µL）、 Hind III（15 U/µL）、10 000 bp DNA Marker、4 500 bp DNA Marker Ⅲ、T4 DNA 连接酶（350 U/µL）：日本TaKaRa Bio 株式会社；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；玉米液化液：日照金禾博源生化有限公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱（LRH-250A）：韶关市泰宏医疗器械有限公司；电子天平（WXL-A30002）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；全自动凝胶成像仪（ChampGel 5000）：北京赛智创业科技有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：上海恒久医疗器械有限公司；光学显微镜（CX23）：奥林巴斯中国有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50FB）：上海申安医疗器械厂；水浴锅（TDA-8002）：天津市中环实验电炉有限公司；摇床（ZWYR-D2403）：北京海天友诚科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基配制方法
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[16]：20%去皮马铃薯加水煮沸30 min， 6 层纱布过滤除去固形物，加入葡萄糖2%、琼脂粉2%，115 ℃高温灭菌20 min。
LB 培养基：氯化钠1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、琼脂粉2%，121 ℃高温灭菌20 min。
初筛培养基：PDA 培养基中加入100 µg/mL 氨苄霉素、250 µg/mL 头孢噻肟钠、150 µg/mL 潮霉素B。
复筛培养基：PDA 培养基中加入200 µg/mL 潮霉素B。
诱导培养基（induction medium，IM）：过膜除菌后的相关母液，琼脂粉 2%，121 ℃ 高温灭菌20 min。
发酵培养基：玉米液化液[17]（初始总糖浓度为19%）加蒸馏水调至糖浓度为16%，115 ℃高温灭菌20 min。
1.3.2 过表达丙酮酸脱氢酶质粒的构建
以黑曲霉 CGMCC 10142 基因组为模板分别扩增葡聚糖苷酶GAS 启动子、三磷酸甘油醛脱氢酶 GAP启动子、α-葡萄糖苷酶左臂、α-葡萄糖苷酶右臂、pd 基因和pd 终止子。pd 终止子与α-葡萄糖苷酶右臂进行融合PCR 后获得融合片段，质粒p40 和片段ɑgdA-L利用EcoR I 和Sac I 双酶切连接得到质粒p40-ɑgdA-L，然后p40-ɑgdA-L 和融合片段利用 Hind Ⅲ 单酶切连接得到质粒 pLF，再将 pLF 和 pd 通过 BamH I 单酶切连接得到质粒 pLFP，将 pLFP 分别与 pGAS-T 和 pGAP-T通过 Bgl II 单酶切连接得到质粒 p14 和 p16 ，最后以大肠杆菌菌液为模板验证 p14 和 p16 质粒敲除框全长并进行测序[18]。
根据引物设计原则和要求设计试验所需的引物见表1。
表1 本试验中所用引物
Table 1 Primers used in experiment
名称Hyg-F Hyg-R ɑgdA-L-F ɑgdA-L-R引物作用扩增 Hyg 抗性基因引物序列（5′→3′）GTCGACGTTAACTGATAT TCCGAGGGCAAAGGAATAG CGGAATTCATGGTGAAGTTGACGCATCTC CCGAGCTCGCGGCCGCCTCACTGGTCAATAGGT扩增 α-葡萄糖苷酶左臂1F GTTCCAT CCCAAGCTTAGATTCTCCTAGTATGTCTCTACTC 扩增 pd终止子1R 2F 扩增α-葡萄糖苷酶右臂2R pd-F pd-R pGAS-F pGAS-R pGAP-F pGAP-R ATAATAAAG GGCCAGGTCAAACAACGTACGAGAGACAGAGA AAGGGTTCT AGAACCCTTTCTCTGTCTCTCGTACGTTGTTTGA CCTGGCC CCCAAGCTTACTACCATTCCAATACCCAGTTTTC CGGGATCCAGATCTCCTTCCTCTCCTCCAGCTC 扩增丙酮酸脱氢酶基因CGGGATCCTGAAACTTCAAGATGAGGTTTGG GGAAGATCTCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCT 扩增 GAS 基因启动子GGAAGATCTGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAG CGATAGATCTGGATCCGACACCGAGCACATGA CGATAGATCTGGATCCGACACCGAGCACATGA扩增 GAP 基因启动子
1.3.3 根癌农杆菌AGL I 介导转化黑曲霉 CGMCC 10142
将质粒p14 和p16 分别电转至农杆菌AGL 1 感受态细胞中，根据文献[19]中的方法孵育农杆菌。将农杆菌菌液与黑曲霉CGMCC 10142 的新鲜孢子混合置于IM 固体培养基的硝酸纤维膜上，25 ℃ 避光共培养48 h[20]。
1.3.4 黑曲霉阳性转化子的筛选
将附着共培养菌体的硝酸纤维膜转移到无菌平板中，加入1 mL 生理盐水，用灭菌涂布器刮下膜上的菌体，均匀涂布于初筛培养基[13]。经过初筛培养基和复筛培养基的筛选，将产孢较快的转化子接到含有 0.2%碳酸钙的PDA 培养基上[21]，35 ℃培养72 h 后观察黑曲霉转化子的菌落透明圈直径与菌落直径。
1.3.5 黑曲霉转化子PCR 验证
挑选上述圈径比值较大的菌株进行PCR 验证，并将验证正确的转化子在含有250 µg/mL 潮霉素的PDA平板上传代培养，待生长到第15 代后验证转化子的遗传稳定性。
1.3.6 黑曲霉转化子摇瓶发酵及产酸测定
将出发菌株和突变菌株在PDA 斜面培养基中活化，在500 mL 三角瓶中加入50 mL 玉米发酵液[17]，高温灭菌处理后，接种黑曲霉孢子，使得每个500 mL 三角瓶中的孢子数量为1×105 个/mL，每个菌进行3 个平行，35 ℃、300 r/min 摇瓶培养72 h 后进行产酸测定[22]。
1.3.7 黑曲霉转化子30 L 发酵罐放大试验
将孢子悬液进行种子罐发酵25 h 后再转接到发酵罐中进行发酵试验。在种子罐中的控制条件为温度 37 ℃，通风率 0.15 vvm，搅拌转速 350 r/min；在发酵罐中的控制条件为温度 37 ℃，通风率 0.18 vvm，搅拌转速 450 r/min。 取种子培养液 2 L 倒入发酵罐中，控制发酵， 当残总糖浓度低于 1% 时发酵结束。 每隔8 h取样，观察菌球形态，测柠檬酸产量、残总糖、残还原糖等[22]。
1.4 数据处理
本文采用 Excel 软件对数据进行整理统计，采用GraphPad Prism 8 软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 过表达丙酮酸脱氢酶菌株的构建
过表达丙酮酸脱氢酶质粒 p14 和 p16 的模式图如图 1A 所示。以构建的转化子大肠杆菌菌液为模板，ɑgdA-L-F 和ɑgdA-R-R 上下游引物进行过表达框全长PCR 验证，结果如图 1B 所示。
由图1 可知，p14 质粒过表达元件全长为 6 575 bp，与图中1 号泳道片段大小一致；p16 质粒过表达元件全长为 6 343 bp，与图中2 号泳道片段大小一致，这两个片段测序结果也与原序列一致，说明过表达丙酮酸脱氢酶 p14、p16 质粒构建成功。
图1 过表达丙酮酸脱氢酶的质粒图谱及构建结果
Fig.1 Plasmid mapping and construction results of overexpressed pyruvate dehydrogenase
A. OE pd 的质粒示意图；B. OE pd 质粒的 PCR 验证图。M1. DL 10 000 marker；1. p14 质粒；M2. DL 10 000 marker；2. p16 质粒。
2.2 转化子透明圈筛选
经复筛之后，将筛选出来的转化子孢子点中在含有碳酸钙的PDA 培养基上进行透明圈筛选，记录所筛选转化子 72 h 的菌落直径、透明圈直径及两者比值，结果见表2。
表2 转化子酸圈筛选结果
Table 2 Acid ring screening results of transformants
菌株号CGMCC 10142 p14-1 p14-3 p14-7 p14-8 p14-11 p14-12 p14-15 p14-25 p14-28 p14-30 p14-31 p14-32 p14-34 p14-37 p14-39 p14-43 p14-44 p14-45 p14-60 p14-67 p14-79 p14-80 p14-85 p14-92 p14-96 p14-102 p14-129 p14-137菌落直径 /cm 0.90 0.52 0.60 0.71 0.82 0.89 0.93 0.72 0.71 1.02 0.81 0.98 1.11 0.97 0.8 0.75 0.73 0.85 0.85 0.83 0.97 0.94 0.85 0.63 0.95 0.96 0.73 0.89 0.63酸圈直径/cm 2.73 1.74 1.20 3.28 3.43 2.72 2.46 2.94 2.53 3.19 2.58 2.32 3.27 2.81 2.69 2.52 1.69 2.76 3.92 2.75 2.63 2.72 2.65 1.64 2.98 3.09 2.98 2.62 2.71圈径比3.03 3.35 2.00 4.62 4.18 3.06 2.65 4.08 3.56 3.13 3.19 2.37 2.95 2.90 3.36 3.36 2.32 3.25 4.61 3.31 2.71 2.89 3.12 2.60 3.14 3.22 4.08 2.94 4.30菌株号p16-2 p16-4 p16-5 p16-27 p16-29 p16-32 p16-38 p16-53 p16-54 p16-57 p16-59 p16-68 p16-73 p16-76 p16-79 p16-80 p16-81 p16-82 p16-83 p16-84 p16-86 p16-89 p16-90 p16-92 p16-94 p16-104 p16-115 p16-127 p16-129菌落直径/cm 0.86 0.75 0.70 0.83 0.81 0.76 0.83 0.84 0.75 0.93 0.85 0.82 0.72 0.81 0.78 0.83 0.79 0.90 0.82 0.79 0.85 0.89 0.95 0.84 0.72 1.01 0.94 0.86 0.79酸圈直径/cm 2.71 2.14 2.73 2.55 2.89 2.48 2.62 2.35 1.98 2.74 3.24 2.37 2.35 3.05 2.65 2.39 2.41 2.73 2.17 2.95 2.65 2.68 3.56 2.28 1.96 2.78 2.82 2.34 2.52圈径比3.15 2.85 3.90 3.07 3.57 3.26 3.16 2.80 2.64 2.95 3.81 2.89 3.26 3.77 3.40 2.88 3.05 3.03 2.65 3.73 3.12 3.01 3.75 2.71 2.72 2.75 3.00 2.72 3.19
根据表2 数据可以初步排除掉一些透明圈较小的转化子，有效地提高阳性转化子的筛选效率。圈径比较高的转化子有可能是产酸较高的转化子，因此根据圈径比值大小我们从表格中挑选出 14 株转化子（p14-7、p14-8、p14-15、p14-25、p14-45、p14-102、p14-137；p16-5、p16-29、p16-32、p16-59、p16-76、p16-79、p16-90）来进行下一步的试验验证。
2.3 黑曲霉转化子验证及遗传稳定性试验分析
将上述筛选出来的14 株转化子进行过表达框全长 PCR 验证，结果如图2 A 所示。将转化子传代培养15 代后提基因组进行 pGAS-pd、pGAP-pd 片段的 PCR验证，结果如图2 B 所示。
图2 OE pd 的转化子验证及遗传稳定性验证结果
Fig.2 Results of OE pd transformants verification and genetic stability verification
A. 转化子 ɑgdA 左臂-ɑgdA 右臂全长的 PCR 验证图；B. 转化子 pGAS+pd 片段、pGAP+pd 片段的 PCR 验证图。A：M1、M2 为DNA marker III；-为阴性对照（3 125 bp）；+为阳性对照（6 575 bp）；1～14 分别为 p14-7、p14-8、p14-15、p14-45、p14-25、p14-102、p14-137、p16-29、p16-32、p16-59、p16-5、p16-76、p16-79、p16-90 黑曲霉转化子全长 PCR 验证结果；B：M1、M2 为DNA marker III；-为阴性对照（无）；+为阳性对照（3 349 bp）；1～14 分别为传代培养后 p14-45、p14-7、p14-8、p14-15、p14-25、p14-102、p14-137、p16-5、p16-32、p16-59、p16-29、p16-76、p16-79、p16-90 黑曲霉转化子 pGAS+pd 片段、pGAP+pd 片段 PCR 验证结果。
由图2A 可知，p14-45、p16-5 这两个转化子的全长验证结果与阳性对照一致，没有阴性对照条带存在，说明为原位插入，其余则为随机插入。由于 p14-45、p16-5 为原位过表达转化子，所以这两者的插入位点一致，故选择这两株转化子用于做后续 pGAS、pGAP 启动效率的比较。
由图2B 可知，有6 株转化子中的启动子与丙酮酸脱氢酶插入片段丢失，说明这些突变株在传代过程中，遗传性能不稳定，不能作为后续的研究使用。而剩下的8 株突变株（p14-45、p14-7、p14-8、p14-102；p16-5、p16-59、p16-29、 p16-79）在传代15 代后，遗传性能稳定，仍有 pGAS+pd、pGAP+pd 片段成功插入，因此对这8 株菌进行下一步的发酵摇瓶试验。
2.4 黑曲霉转化子摇瓶发酵结果分析
将上述筛选出来的8 株黑曲霉转化子菌株进行发酵摇瓶试验，结果见图3。
图3 黑曲霉转化子 72 h 摇床产酸验证
Fig.3 Verification of acid production from Aspergillus niger transformant by 72 h shaking
从图3 可知，黑曲霉突变菌株 p14-102、p16-59 的产酸量较出发菌株CGMCC 10142 有小幅度下降，原因可能是其过表达框的随机插入破坏了黑曲霉生成柠檬酸合成途径的一些关键酶，从而导致产酸量有所下降。而其余6 株突变株较出发菌株产酸量均有不同程度提高，说明丙酮酸脱氢酶基因的过表达对黑曲霉柠檬酸代谢途径有促进作用。原位过表达突变菌株 p16-5 相较于出发菌株产酸量有小幅度上升，但产量提高不明显；而突变菌株 p14-45 相较于出发菌株产酸量有很明显提高。这两株突变株产酸量相较于出发菌株分别提高了1.22%和 3.35%。由此可见，pGAS 与 pGAP 相比较来说，pGAS 的启动强度要优于 pGAP。
2.5 黑曲霉转化子30 L 发酵罐放大试验结果分析
2.5.1 发酵过程黑曲霉菌球形态观察和发酵液总酸
在发酵过程中每隔8 h 取样进行检测。对出发菌株 CGMCC 10142 和过表达突变株 p14-45、p16-5 的菌丝球直径进行测量，并同时观察菌丝球形态，结果见图 4。
由图4A 可知，两株过表达丙酮酸脱氢酶菌株每个取样时间点的菌球形态均表现正常，在发酵0～32 h期间，菌球直径持续增加，而32 h 过后菌球直径增加不明显，菌丝球大小也基本维持稳定，菌球周围开始生长出细小菌丝，说明发酵已经开始进入产酸高峰期。另外从产酸高峰期直至发酵结束，菌球直径增加较少。
图4 不同发酵时间菌株的菌球形态观察与总酸含量
Fig.4 Observation of microsphere morphology and total acid content of strains with different fermentation time
A.发酵不同时间点菌落形态观察结果；B.发酵各周期菌球直径；C.发酵液总酸含量。
由图4B 可知，过表达菌株与出发菌株在柠檬酸发酵周期菌球生长趋势基本一致，在发酵 8～24 h 期间，菌落直径增长较快，说明菌体呈快速生长趋势。另外在发酵48 h 后会出现一定的菌落生长趋势，说明这两株菌株在发酵后期会消耗一定的能源进行菌体生长，从而导致菌落直径增大。
由图4C 可知，在发酵过程中，突变菌株较出发菌株产酸量优势明显。相对于出发菌株，p14-45、p16-5的产酸量分别提高了5.17% 和 4.01%；另外，在发酵过程中，p14-45、p16-5 两株突变菌株的产酸量均有不同程度的提高，说明过表达丙酮酸脱氢酶会使黑曲霉的三羧酸循环中丙酮酸代谢流更加顺畅，能降低因丙酮酸未被及时降解而导致对丙酮酸激酶的反馈抑制，进一步提高丙酮酸的产量，从而提高柠檬酸的产量。从两株原位过表达丙酮酸脱氢酶基因的突变株p14-45、p16-5 在30 L 发酵罐发酵试验产酸结果来看，产酸趋势和产酸量与摇瓶发酵产酸结果水平一致，进一步印证了pGAS 优于pGAP 的表达能力。
2.5.2 发酵液残总糖及残还原糖
在上述 30 L 发酵过程中，每隔 8 h 对黑曲霉CGMCC 10142、p14-45、p16-5 的发酵液残总糖和残还原糖含量进行测定，结果见图 5。
由图5A 可以看出，两株黑曲霉突变菌株残总糖含量差异不大。在发酵结束时，相较于出发菌株CGMCC 10142，过表达丙酮酸脱氢酶菌株p14-45 和p16-5 的残总糖含量分别降低了13.4%和10.7%。
图5 发酵时残总糖含量和残还原糖含量的测定结果
Fig.5 Determination of residual total sugar and residual reducing sugar during fermentation
A.残总糖含量；B.残还原糖含量。
由图 5 B 可以看出，在 0～16 h 时，发酵液中残还原糖一直在增加，后期随着产酸量的增加，残还原糖的含量在逐渐减少。原因是在发酵时间 8～24 h 期间，糖化酶活力较高，具有较强的糖化作用，产生的还原糖也较多。当发酵24 h 后，大量的还原糖被利用合成柠檬酸，从而导致残还原糖迅速降低。相较于出发菌株CGMCC 10142，过表达丙酮酸脱氢酶菌株 p14-45、p16-5 的残还原糖含量分别降低了14.4%和12.8%。
2.5.3 突变株糖酸转化率的验证
通过比较发酵时的总糖以及发酵结束后的产酸数据，进而分析得出在不同时间点的不同突变株的糖酸转化效率，结果见图6。
图6 黑曲霉 CGMCC 10142、p14-45、p16-5 的糖酸转化率
Fig.6 Sugar-acid conversion of Aspergillus niger CGMCC 10142，p14-45， and p16-5
由图6 可知，在发酵后期，丙酮酸脱氢酶过表达菌株 p14-45、 p16-5 较出发菌株糖酸转化效率均有升高，在发酵结束时，突变菌株p14-45 的糖酸转化效率为100.66%，突变菌株 p16-5 的糖酸转化效率为 100.04%。过表达丙酮酸脱氢酶的两株过表达菌株之间，p14-45菌株的糖酸转化效率更高。根据发酵结果以及糖酸转化率可以看出，p14-45 为优势菌株，产酸性能最好，所以可将其作为大规模工业发酵生产柠檬酸的生产菌株。
3 结论
构建葡聚糖苷酶 GAS 启动子和三磷酸甘油醛GAP 启动子过表达丙酮酸脱氢酶基因质粒p14、p16，并成功转化到农杆菌AGL 1 中。通过根癌农杆菌介导黑曲霉CGMCC 10142 菌株，获得4 株pGAS、4 株pGAP 丙酮酸脱氢酶基因的过表达菌株，分别为p14-45、p14-7、p14-8、p14-102 和p16-5、p16-59、p16-29、p16-79。通过对其传代培养，验证8 株突变株遗传稳定性较好。其中p14-45 和p16-5 为原位过表达菌株，通过摇瓶发酵试验，绝大部分突变菌株产酸性能优于原始菌株。
通过30 L 发酵罐发酵结果表明，丙酮酸脱氢酶基因过表达菌株发酵产酸均比出发菌株较高。因p14-45 和p16-5 为原位过表达菌株，进而比较两株突变株不同启动子的表达强度，在产酸测定中，过表达菌株p14-45 产酸量高于过表达菌株p16-5，说明GAS 启动子启动强度优于GAP 启动子。丙酮酸脱氢酶过表达菌株p14-45 和p16-5 的残总糖含量较出发菌株 CGMCC 10142 分别降低了13.4%和10.7%，产酸量分别提高了5.17%、4.01%，糖酸转化率分别为100.66%、100.04%。
本文只对黑曲霉 GAS 启动子和GAP 启动子从宏观层面进行研究，可以进一步通过荧光定量 PCR 研究这两个启动子对丙酮酸脱氢酶基因表达量的影响，更加直观地得到二者的启动能力强弱的结果。
[1] XIE H, MA Q Y, WEI D Z, et al. Transcriptomic analysis of Aspergillus niger strains reveals the mechanism underlying high citric acid productivity[J]. Bioresources and Bioprocessing, 2018, 5(1):21.
[2] TONG Z Y, ZHENG X M, TONG Y, et al. Systems metabolic engineering for citric acid production by Aspergillus niger in the postgenomic era[J]. Microbial Cell Factories, 2019, 18(1): 28.
[3] BEHERA B C. Citric acid from Aspergillus niger: A comprehensive overview[J]. Critical Reviews in Microbiology, 2020, 46(6): 727-749.
[4] 李凤艳, 刘晓晴. 哺乳动物中丙酮酸脱氢酶复合体的活性调节[J]. 生物技术通报, 2006(1): 9-12.LI Fengyan, LIU Xiaoqing. Regulation of the activity of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex[J]. Biotechnology Bulletin, 2006(1): 9-12.
[5] 杨迪, 李艳, 张喜红, 等. 重组苏云金芽孢杆菌丙酮酸脱氢酶克隆及表达条件的优化[J]. 化学与生物工程, 2009, 26(4): 39-42.YANG Di, LI Yan, ZHANG Xihong, et al. The cloning and expression optimization of recombined Bɑcillus thuringiensis pyruvate dehydrogenase[J]. Chemistry & Bioengineering, 2009, 26(4): 39-42.
[6] CAIRNS T C, BARTHEL L, MEYER V. Something old, something new: Challenges and developments in Aspergillus niger biotechnology[J]. Essays in Biochemistry, 2021, 65(2): 213-224.
[7] YIN X, LI J H, SHIN H D, et al. Metabolic engineering in the biotechnological production of organic acids in the tricarboxylic acid cycle of microorganisms: Advances and prospects[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(6 Pt 1): 830-841.
[8] 谢慧, 王风清, 魏东芝. 蛋白组学差异揭示黑曲霉(Aspergillus niger)高产柠檬酸的分子机制[J]. 中国酿造, 2018, 37(7): 138-144.XIE Hui, WANG Fengqing, WEI Dongzhi. Molecular mechanism revealed by proteomic differences of Aspergillus niger with high yield citric acid[J]. China Brewing, 2018, 37(7): 138-144.
[9] YANG L, LÜBECK M, LÜBECK P S. Aspergillus as a versatile cell factory for organic acid production[J]. Fungal Biology Reviews,2017, 31(1): 33-49.
[10] LV S Y, CHEN X, MOU C Y, et al. Agrobɑcterium-mediated transformation of the ascomycete mushroom Morchellɑ importunɑ using polyubiquitin and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter-based binary vectors[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2018, 34(10): 148.
[11] 钱凯, 张晶晶, 吴素平, 等. 利用GAP 启动子在毕赤酵母中表达与纯化GLP-1 类似物[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(5): 66-73.QIAN Kai, ZHANG Jingjing, WU Suping, et al. Constituted expression and purification of glucagon-like peptide-1 analogue in Pichiɑ pɑstoris using GAP promoter[J]. China Biotechnology, 2015, 35(5):66-73.
[12] 姜宁,李正鹏,周峰,等. 抗生素对刺芹侧耳菌丝生长的影响[J].上海农业科技, 2021(2): 1-3.JIANG Ning, LI Zhengpeng, ZHOU Feng, et al. Effects of antibiotics on mycelia growth of Pleuropleurɑ spiculɑtɑ[J]. Shanghai Agricultural Science and Technology, 2021(2): 1-3.
[13] 胡江峰. 黑曲霉pyrG 遗传转化系统的构建及应用[D]. 天津: 天津科技大学, 2021.HU Jiangfeng. Construction and application of pyrG genetic transformation system in Aspergillus niger[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2021.
[14] 高紫君. 米曲霉高产曲酸的诱变筛选及提取工艺研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2021.GAO Zijun. Study on mutation screening and extraction technology of Aspergillus oryzɑe with high kojic acid yield[D].Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2021.
[15] 李虎强, 史博颖. 柠檬酸钙的合成研究进展[J]. 广州化工, 2020,48(12): 12-14.LI Huqiang, SHI Boying. Progress in preparation of calcium citrate[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2020, 48(12): 12-14.
[16] 蒋晶晶, 杜蕙, 陈爱昌, 等. 甘肃省党参菌核病病原菌鉴定及其生物学特性研究[J]. 草业学报, 2022, 31(12): 181-190.JIANG Jingjing, DU Hui, CHEN Aichang, et al. Identification and biological characterization of the pathogens responsible for sclerotinia rot in Codonopsis pilosulɑ[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2022,31(12): 181-190.
[17] HU W, LIU J, CHEN J H, et al. A mutation of Aspergillus niger for hyper-production of citric acid from corn meal hydrolysate in a bioreactor[J]. Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 2014, 15(11): 1006-1010.
[18] 马梅. 黑曲霉α-葡萄糖苷酶的克隆及其酶学性质研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2021.MA Mei. Cloning and characterization of α-glucosidase from Aspergillus niger[D]. Tianjin: Tianjin University of Science & Technology, 2021.
[19] 曹张磊, 王德培, 张岚. 提高根癌农杆菌介导黑曲霉转化效率的研究[J]. 天津科技大学学报, 2016, 31(2): 20-25.CAO Zhanglei, WANG Depei, ZHANG Lan. Improvement of transformation efficiency of Aspergillus niger mediated by Agrobɑcterium tumefɑciens[J]. Journal of Tianjin University of Science and Technology, 2016, 31(2): 20-25.
[20] 史亚楠, 王德培, 王一川, 等. 敲除msn2 对米曲霉生长和发酵产曲酸的影响[J]. 生物技术通报, 2022, 38(8): 188-197.SHI Yanan, WANG Depei, WANG Yichuan, et al. Effects of msn2 knock-out on the growth and kojic acid production of Aspergillus oryzɑe[J]. Biotechnology Bulletin, 2022, 38(8): 188-197.
[21] 刘博雅. 产柠檬酸黑曲霉耐热菌株的构建及其发酵研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2021.LIU Boya. Construction and fermentation of heat-resistant strains of Aspergillus niger[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2021.
[22] 张鸿飞, 秦郦, 蒋水星, 等. 玉米液化清液发酵生产柠檬酸工艺研究[J]. 食品研究与开发, 2019, 40(2): 155-161, 202.ZHANG Hongfei, QIN Li, JIANG Shuixing, et al. Study on the technology of producing citric acid by corn liquefaction liquor fermentation[J]. Food Research and Development, 2019, 40(2): 155-161, 202.