紫菜（Porphyrɑ）作为药食两用的海藻，富含多种营养物质，如蛋白质、维生素和矿物质[1-2]，极具开发利用前景。紫菜中蛋白质多在细胞质内和细胞壁上，因此需要对紫菜进行破壁处理，以提高紫菜蛋白得率，使资源得到充分利用[3]。目前，国内外已报道的藻类细胞壁破坏方法主要有反复冻融法[4]、溶胀法[4]、超声破碎法[5]及酶法[6]等。反复冻融法和溶胀法存在耗时长、破壁效果不理想的缺点；超声破碎法除了耗能及对设备要求高外，超声波的能量还会转化为热量，可能会引起蛋白的热变性；酶法破壁的能耗低、操作简便，但是商品酶的成本较高[7]。
酶法破壁的效果与藻类细胞壁组成以及所使用酶制剂的底物专一性有关[8]。紫菜细胞壁的主要成分是琼胶[9]，琼胶酶属于糖苷水解酶，分为α-琼胶酶和β-琼胶酶两类[10]，此酶可专一降解琼胶[11]，因而可有效降解紫菜细胞壁。琼胶酶主要来源于土壤、海水、海洋软体动物和海洋微生物[9]，其中，海洋环境是核心来源[12]。在食品、医药、化工领域，琼胶酶可高效降解琼胶制备琼胶寡糖，具有抗氧化[13]、保湿美白[14]、抗炎[15]、降血糖[16]等多种生理活性。此外，藻类原生质的制备[17]、研究海藻细胞壁多糖的组成和结构都可通过琼胶酶水解而实现。
紫菜营养物质丰富，但因人体中缺乏紫菜细胞壁多糖降解酶，使得紫菜的营养价值得不到充分利用。因此，本研究旨在筛选出高活性且符合生产条件的琼脂降解菌，用其降解紫菜细胞壁使其胞内蛋白及营养成分释放出来，得到的紫菜破壁产物对于食品加工、生物医疗和化工等领域都有重要意义。
本文采用微生物法产琼胶酶，从连云港紫菜养殖区分离具有琼胶酶活性的菌株，降解紫菜细胞内的多糖及蛋白质，使紫菜中的有效成分得到释放，通过观察其形态和16S rRNA 基因序列分析对菌株进行鉴定并构建系统发育树，优化培养条件，研究其生长曲线并观察菌株对紫菜细胞壁的降解效果，以期获得适合工业应用的产琼胶酶菌株，从而实现紫菜的高值化利用。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
紫菜：产自连云港市紫菜养殖区；蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母粉：英国OXOID 公司；琼脂粉：德国BIO FROXX 公司；3-5 二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：北京索莱宝科技有限公司。
1.1.2 仪器与设备
UV-1000 紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；XSQ 型立式高压蒸汽灭菌锅、SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2FD 洁净工作台：天津埃尔泰克复合材料有限公司；TS-100B台式恒温摇床：常州金坛良友仪器有限公司；BM1000生物显微镜：南京江南永新光学有限公司；CF1524R 高速冷冻型微量离心机：美国SCILOGEX 公司。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基配制
海水2216E 固体培养基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，琼脂粉20 g，陈海水1 L，pH7.2～7.6。
富集培养基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，琼脂粉2 g，陈海水1 L，pH7.5。
种子培养基：蛋白胨1 g，酵母粉1 g，琼脂粉0.5 g，陈海水1 L，pH7.2～7.6。
发酵培养基：同种子培养基。
紫菜液体培养基：紫菜粉100 g，陈海水1 L，121 ℃灭菌20 min。
1.2.2 菌株的分离和筛选
参考文献[18-19]的方法，将紫菜样品均质处理后，取悬液接入富集培养基进行富集培养，并将其菌液进行逐级稀释（10-1～10-9），取10-4～10-8 5 个稀释度的菌液涂布于海水2216E 固体培养基，28 ℃培养24 h。挑取透明圈较大的菌株涂布于海水2216E 固体培养基，培养48 h 后滴加卢戈氏碘液，挑取透明圈最大的菌株3 环，接入种子培养基，28 ℃、180 r/min 振荡培养18 h，以2%的接种量接入发酵培养基中，28 ℃、180 r/min 振荡培养24 h 后，8 000 r/min 离心10 min，取上清液进行酶活力的测定。
最终，从紫菜样品分离筛选出的17 株琼胶酶降解菌中选取产琼胶酶活力较强的一株菌（编号为Wang-1）作为试验用菌。图1 是其中编号为Wang-1 的菌株的卢戈氏碘液染色图片，未被降解的部分会被卢戈氏碘液染成深色，其菌落周围形成较大的透明水解圈，说明该菌株具有较强的琼胶降解能力。通过比较琼胶降解菌在平板上出现的透明圈直径大小，并且通过测定酶活力发现透明圈大的菌株具有较高的琼胶酶活力，发现菌株Wang-1 酶活力最高，将菌株Wang-1 作为下一步的研究对象。
图1 卢戈氏碘液染色结果
Fig.1 Lugo's iodine solution staining results
1.2.3 产琼胶酶菌株16S rRNA 基因序列扩增、比对及系统发育进化树的构建
采用煮沸处理法[20]对菌株进行破壁处理，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTA CCTTGTTACG-ACTT-3′）进行菌落聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，35 个循环；72 ℃温育10 min，4 ℃保存。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，送至南京生工生物工程有限公司测序。使用Geneious 软件对测序结果进行拼接，利用NCBI 网站的BLAST 程序在GenBank 上对拼接结果进行相似性比对，分析比对结果，从比对结果中挑出相似性较高的菌株序列，使用MEGA 7.0 的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树[19]。
1.2.4 琼胶酶活力的测定
琼胶酶活力的测定参考朱慧文等[20]的方法，取0.5 mL 发酵液于25 mL 含有1.5 mL 0.5%琼脂的磷酸盐缓冲液（pH7.0）的比色管中，50 ℃反应20 min，加入2.0 mL DNS，沸水浴显色5 min，冷却并用蒸馏水定容至25 mL 并摇匀，540 nm 处测吸光值，用灭活酶液作为对照。根据标准曲线（y=0.111 9x-0.149 6，R2=0.993 9）算出上清液中的还原糖含量。酶活力单位（U）定义为在上述条件下，1 min 转化生成1 µg 还原糖所需酶的量。
1.2.5 菌株生长曲线的绘制
挑取复筛菌株接种到种子培养基，pH7.5 培养24 h后按2% 接种量接入100 mL 发酵培养基，在28 ℃、150 r/min 条件下培养，每隔8 h 取菌悬液测定其在600 nm 处的吸光值OD600。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制菌株生长曲线。
1.2.6 菌株产琼胶酶发酵条件优化单因素试验
1.2.6.1 初始pH 值对菌株产琼胶酶的影响
以发酵培养基为基础，在接种量2%、培养时间24 h、培养温度28 ℃条件下，研究不同初始pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对菌株产琼胶酶的影响。
1.2.6.2 接种量对菌株产琼胶酶的影响
以发酵培养基为基础，在初始pH7.5、培养时间24 h、培养温度28 ℃条件下，研究不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对菌株产琼胶酶的影响。
1.2.6.3 培养时间对菌株产琼胶酶的影响
以发酵培养基为基础，在初始pH7.5、接种量2%、培养温度28 ℃条件下，研究不同培养时间（12、24、36、48、60 h）对菌株产琼胶酶的影响。
1.2.6.4 培养温度对菌株产琼胶酶的影响
以发酵培养基为基础，在初始pH7.5、接种量2%、培养时间24 h 条件下，研究不同培养温度（20、24、28、32、36 ℃）对菌株产琼胶酶的影响。
1.2.7 菌株产琼胶酶发酵条件优化正交试验
为优化菌株产琼胶酶最佳条件，在单因素试验的基础上，选取不同初始pH 值（A）、培养温度（B）、培养时间（C）、接种量（D）设计四因素三水平的正交试验，因素水平如表1 所示。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
因素水平D 接种量/%1 2 3 A 初始pH 值7.0 7.5 8.0 B 培养温度/℃24 28 32 C 培养时间/h 12 24 36 1 2 3
1.2.8 菌株的形态学观察
将菌株在海水2216E 固体培养基上划线培养24 h后，肉眼观察菌落形态特征。
1.2.9 产琼胶酶菌株降解紫菜效果的测定
将紫菜粉与水按一定料液比混合，将该产琼胶酶菌株以2%接种量接入含有50 mL 紫菜的紫菜液体培养基中，28 ℃、150 r/min 摇床培养72 h（测定组）。以接入灭菌种子液的紫菜培养基作为对照组，利用生物显微镜观察紫菜细胞24 h 和48 h 的水解变化情况。并测定产琼胶酶菌株降解紫菜24 h 和48 h 后的还原糖含量及总糖含量。
1.3 数据处理
利用Excel、IBM SPSS Statistics 25.0 进行正交试验设计和单因素方差分析，Graphpad Prism 9.5 进行作图。
2 结果与分析
2.1 菌株的16S rRNA 基因序列扩增、比对及系统发育树分析
将PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。
图2 菌株Wang-1 16S rRNA PCR 产物电泳图谱
Fig.2 Electrophoretic map of 16S rRNA PCR products of strain Wang-1
由图2 可知，在约1 500 bp 处得到1 条清晰、通亮、单一的条带，符合预期长度。
将PCR 扩增产物进行基因测序，经拼接获得1 441 个碱基序列，将测序所得基因序列在NCBI 上通过BLAST 与GenBank 数据库[19]的序列进行比对，将相似性达到95%以上的模式菌株序列，采用软件MEGA 7.0 进行模式菌同源比对，构建的系统发育树见图3。同时菌株Wang-1 的16S rRNA 基因序列与假交替单胞菌属的序列相似度达到99.86%，因此可初步判定菌株Wang-1 为假交替单胞菌。
图3 菌株Wang-1 基因序列系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of Wang-1 strain gene sequence
2.2 产琼胶酶菌株的生长曲线
产琼胶酶菌株生长曲线见图4。
图4 产琼胶酶菌株生长曲线
Fig.4 Growth curve of agarose-producing strains
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图4 可知，培养8 h 为对数期，菌株OD600 迅速增加，最终达到0.776，这一时期标志着生物量的急剧增加。16 h 后为菌株生长稳定期，该时期生物量开始逐渐降低，此时能分解更多的琼胶以供微生物进一步应用。随着培养时间的延长，菌株生长速率明显下降，40 h 后进入了衰亡期，菌体的生长速率逐渐减慢。
2.3 菌株产琼胶酶发酵条件单因素试验
2.3.1 初始pH 值对菌株产琼胶酶的影响
pH 值对微生物的生长代谢有较大的影响，海洋细菌最适生长pH 值与海水pH 值之间存在密切的关联[21]。因此，需要探究培养基的初始pH 值对菌株产琼胶酶的影响，结果见图5。
图5 初始pH 值对菌株产琼胶酶的影响
Fig.5 Effect of initial pH value on agarase production by strains
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图5 可知，在pH6.0～7.5，琼胶酶活力随初始pH值的增加而增加；而在pH7.5～8.0，琼胶酶活力随初始pH 值的增加而减小。初始pH 值为7.5 时，琼胶酶活力达到最高，说明过酸过碱的条件均不利于该菌株产酶。因此，选择菌株产琼胶酶培养基初始pH 值为7.0、7.5、8.0 进行后续正交试验，同时也更接近于海水pH 值（7.2～8.3）。
2.3.2 接种量对菌株产琼胶酶的影响
接种量对菌株产琼胶酶的影响见图6。
图6 接种量对菌株产琼胶酶的影响
Fig.6 Effect of inoculum size on agarase production by strains
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图6 可知，当接种量为1%～2%时，该菌株的琼胶酶活力随接种量的增加而增加；当接种量为2%～5%时，琼胶酶活力随着接种量的增加而急剧减小。过高的接种量会极大降低琼胶降解菌的产酶效率，这与张建美等[22]的研究结果一致。因此，选择菌株产琼胶酶的接种量为1%、2%、3%进行后续正交试验。
2.3.3 培养时间对菌株产琼胶酶的影响
培养时间对菌株产琼胶酶活力的影响见图7。
图7 培养时间对菌株产琼胶酶的影响
Fig.7 Effect of culture time on agarase production by strains
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图7 可知，随着培养时间的延长，菌株产琼胶酶活力呈现先增大后减小的趋势。在培养时间为24 h时，琼胶酶活力相对较高。可能是发酵的早期阶段，培养基中的营养物质丰富，菌体得以快速生长，同时产酶能力也逐渐增强，因此在24 h 时琼胶酶活力达到了最高值。这与尤钰娴等[23]的研究结果一致，随着培养时间的推移，菌体生长速度开始逐渐减缓，产酶能力也逐渐受到抑制，导致琼胶酶活力逐渐下降。因此，选择菌株产琼胶酶的培养时间为12、24、36 h 进行后续正交试验。
2.3.4 培养温度对菌株产琼胶酶的影响
培养温度对菌株产琼胶酶活力的影响见图8。
图8 培养温度对菌株产琼胶酶的影响
Fig.8 Effect of culture temperature on agarase production by strains
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图8 可知，当培养温度在20～28 ℃时，菌株产琼胶酶活力随培养温度的升高而增加；当培养温度大于28 ℃时，琼胶酶活力随培养温度的升高而降低，28 ℃时酶活力达到最高。有关研究表明，海洋中细菌大多适合在25～40 ℃环境中生长，海洋细菌产琼胶酶的最适培养温度集中于26～32 ℃[24]。综上所述，选择菌株产琼胶酶的培养温度为24、28、32 ℃进行后续正交试验。
2.4 菌株产琼胶酶发酵条件优化正交试验
菌株产琼胶酶发酵条件优化正交试验结果见表2。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
项目A 初始pH 值B 培养温度C 培养时间D 接种1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 2 3 2 1 2 1 3量 1 2 3 3 1 2 2 3 1琼胶酶活力/（U/mL）57.123 63.189 57.632 62.789 67.933 60.651 58.995 61.121 57.985 K2 K3 k1 k2 k3极差R主次顺序优水平最优组合177.944 191.373 178.101 59.315 63.791 59.367 4.476 178.907 192.243 176.268 59.636 64.081 58.756 5.325 178.895 184.560 183.963 59.632 61.520 61.321 1.888 183.041 182.835 181.542 61.014 60.945 60.514 0.500 B>A>C>D A2 A2B2C2D1 B2 C2 D1
由表2 可知，该菌株产琼胶酶活力的最优组合是A2B2C2D1，该试验条件下菌株产琼胶酶活力最高，可达到67.933 U/mL。根据极差分析可知，影响菌株产琼胶酶活力的主次顺序为B>A>C>D，即培养温度>初始pH值>培养时间>接种量。综上，菌株产琼胶酶的最佳培养条件为培养温度28 ℃、初始pH7.5、培养时间24 h、接种量1%。
2.5 产琼胶酶菌株的形态学观察结果
产琼胶酶菌株的形态学观察结果见图9、图10。
图9 培养24 h 后菌株形态特征
Fig.9 Morphological characteristics of strains after 24 h culture
图10 革兰氏染色结果
Fig.10 Gram staining result after 24 h culture
由图9 可知，培养24 h 后，菌落呈圆形，乳白色，质地黏稠湿润，易被挑起，菌落直径不等。由图10 可知，菌株被染成红色，表明该菌株为革兰氏阴性菌，与已报道的绝大多数产琼胶酶菌株属革兰氏阴性菌结果相符[25-26]。
2.6 菌株Wang-1 降解紫菜效果
2.6.1 生物显微镜观察紫菜细胞壁的变化
生物显微镜观察紫菜细胞壁结果见图11、图12。
图11 水解24 h 紫菜细胞变化结果
Fig. 11 Changes of Porphyra cells after hydrolysis for 24 h
图12 水解48 h 紫菜细胞变化结果
Fig.12 Changes of Porphyra cells after hydrolysis for 48 h
紫菜细胞初始结构紧密，形态规则，呈绿色。发酵液初始均呈紫红色。由图11 可知，水解24 h 时，对照组排列形态无明显变化，有部分细胞颜色发生变化，呈黄绿色。测定组有部分细胞细胞壁破碎，胞内物质溢出[27]。由图12 可知，水解48 h，对照组出现少量散落的细胞，细胞边界模糊，大部分细胞呈黄色。测定组部分细胞内物质完全溢出[28]，散落的单个细胞和分解产生的胶状物较多，出现较多被破壁后物质溢出完全的“空壳”，说明细胞破裂，细胞液大量流出，细胞结构遭到严重破坏[29]，部分细胞颜色呈浅黄色或更深的黄色。
2.6.2 菌株Wang-1 降解紫菜还原糖含量
菌株Wang-1 降解紫菜24、48 h 还原糖含量变化如表3 所示。
表3 菌株Wang-1 降解紫菜24、48 h 前后还原糖含量（n≥3）
Table 3 Reducing sugar content of Porphyra degraded by strain Wang-1 before and after 24 h and 48 h（ n≥3）mg/g
对照组0.423±0.093降解24 h 3.123±0.067降解48 h 10.498±0.845
由表3 可知，对照组还原糖含量较少，是因为降解前紫菜中的糖类物质主要以多糖的形式（主要是琼胶）存在。经琼胶酶降解后，随着降解时间的延长，还原糖含量明显增加，这可能是因为紫菜细胞中的琼胶被菌株降解为具有还原性的琼胶寡糖。琼胶寡糖的特殊生物活性[30]使得紫菜降解液的营养价值大大提高。
2.6.3 菌株Wang-1 降解紫菜总糖含量
菌株Wang-1 降解紫菜24、48 h 总糖含量变化如表4 所示。
表4 菌株Wang-1 降解紫菜24、48 h 前后总糖含量（n≥3）
Table 4 Total sugar content of Porphyra degraded by strain Wang-1 before and after 24 h and 48 h（ n≥3）mg/g
对照组32.965±0.733降解24 h 38.589±0.178降解48 h 44.498±2.145
由表4 可知，随着降解时间的延长，降解液总糖含量有所增加，表明菌株产琼胶酶使得总糖含量提高。可能是由于紫菜经过煮沸破坏后，再经过产琼胶酶菌株的降解，营养物质更好地溶出[31]。
3 结论
本文从紫菜中筛选出产琼胶酶活力较强的琼胶降解菌Wang-1，探究其产琼胶酶能力和对紫菜细胞壁的降解效果。通过形态学观察和16S rRNA 基因序列分析对菌株进行鉴定并构建系统发育树，发现菌株Wang-1，经鉴定为Pseudoɑlteromonɑs Wang-1。通过测定该菌株的生长曲线、发酵条件优化单因素试验和正交试验，确定该菌株产琼胶酶最佳培养条件为培养温度28 ℃、初始pH 值7.5、培养时间24 h、接种量1%，在此条件下，琼胶酶活力最高可达67.933 U/mL。生物显微镜观察菌株降解效果以及菌株Wang-1 降解紫菜后还原糖及总糖含量结果显示，随着降解时间的延长，产琼胶酶菌株能使琼胶降解为具有还原性的琼胶寡糖。本文成功筛选出符合生产条件的琼胶降解菌，用其降解紫菜细胞壁使紫菜胞内蛋白及营养成分释放出来，对于实现紫菜的高值化利用及其在食品加工、生物医疗和化工等领域都有重要意义。
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