氨基甲酸乙酯（ethly carbamate，EC）又称尿烷（urethane）、乌拉坦，是发酵食品在生产和贮存过程中自然产生的一种副产物，也是酒精发酵饮料中比较常见的有毒污染物。试验证明EC 及其衍生物会导致生物机体发生肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等癌变疾病[1-2]，1943 年EC 首次被确认为致癌物，1974 年国际癌症研究机构将EC 归类为2B 类致癌物，2007 年正式将EC归类为2A 级致癌物[3]。发酵食品中EC 含量超标的问题已成为生产企业以及消费者的关注重点。
白酒生产历史悠久，是世界六大蒸馏酒之一，在国内每年白酒产量呈上升趋势，生产量和消耗量前景广阔[4]。随着人们对白酒的需求不断变大，白酒安全问题也引起人们广泛关注[5]。从1988 年开始，国内已经开始重视白酒中EC 的含量问题，国际上包括加拿大、捷克、日本等多个国家将白酒中EC 的最高限量设为150 µg/L。虽然国内市场没有建立统一的限量要求标准，但有研究表明，国内不同香型白酒的EC 平均含量约为44.48～214.00 µg/L，大多数低于加拿大限量标准（150 µg/L）[6]，且随着白酒不断走向世界，对白酒安全方面的要求必将不断提高[7]。因此研究快速准确分析白酒中EC 含量的检测方法对于白酒的安全及产业发展起到保驾护航的作用。
白酒分析检测是开展酿酒生产工艺研究的前提[8]，也是有效监控氨基甲酸乙酯含量的前提。目前，我国白酒中EC 含量的检测方法主要有气相色谱法（gas chromatography，GC）[9]、气相色 谱-质 谱 法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[10]、高效液相 色 谱 法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11]、高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[12]、高效液相色谱-荧光检测法（high performance liquid chromatography-flu-orescence detection，HPLC-FLD）[13-15]。气相色谱法和气相色谱-质谱法虽然结果准确，但样品前处理复杂、耗时长，很难实现快速大规模检测；而高效液相色谱法准确率较前两种方法较低。液相色谱-串联质谱法有着高选择性、高灵敏度等优点，所以本试验在三重四极杆液相色谱质谱联用仪上利用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）模式下的Q1 全扫寻找最佳离子对后，触发Q3 模式检测，再通过选择反应监测（select the reaction monitor scan mode， SRM）扫描模式建立EC 检测方法，以期为建立快速有效地检测白酒中EC 含量的方法提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白酒酒样：市售。
EC 标准品（纯度≥98.5%）：德国Dr. Ehrenstorfer 公司；甲醇（色谱纯）：美国默克公司；甲酸、乙酸铵、乙酸（均为色谱纯）：美国Fisher 公司。 试验中所用超纯水均为Milli-Q EQ7000 超纯水系统制备；0.22 µm 水相微孔滤膜：东莞康润实验科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TSQ Altis Plus 三重四极杆液相色谱质谱联用仪：美国Thermo 公司；万分之一电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；WGLL-230BE 电热鼓风干燥箱：菲斯福仪器（河北）有限公司；QT-2A 涡旋振荡器：上海琪特分析仪器有限公司；Milli-Q EQ7000 超纯水系统：默克化工技术（上海）有限公司；POWERSONIC 620 超声清洗仪：Hwashin（上海）科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
标准储备液（119.06 mg/L）：于万分之一天平上准确称取适量EC 标准品（精确至0.000 1 g），加水定容于100 mL 容量瓶中，混匀后置于棕色试剂瓶中，于4 ℃冰箱中贮存，待用。
标准使用液（1 190.64 µg/L）：准确量取1 mL 标准储备液，加水定容于100 mL 容量瓶中，混匀后置于棕色试剂瓶中，于4 ℃冰箱中贮存，待用。
标准工作液：对标准使用液进行逐级稀释至浓度分别为11.91、23.81、59.53、119.06、178.60、238.13 µg/L，获得标准工作液，现配现用。
1.3.2 样品前处理
标准溶液工作液前处理：将配制好的标准溶液工作液使用0.22 µm 水相微孔滤膜过滤后，直接上机检测。
酒样前处理：准确吸取1 mL 酒样于离心管中，置于 80 ℃烘箱中烘至0.3～0.4 mL 后取出，冷却后加水定容至 1 mL，涡旋混匀，使用0.22 µm 水相微孔滤膜过滤后上机检测[7]。
1.3.3 仪器检测
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱：Accucore aQ 液相色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 µm）；柱温：40 ℃；样品室温度：16 ℃；进样量：2 µL；流动相：A 相为体积分数0.1% 的甲酸溶液，B 相为甲醇；洗脱方式：采用梯度洗脱，具体洗脱程序见表1。
表1 液相梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure
序号1 2 3 4 5 6时间/min 0.000 1.000 4.000 5.000 6.000 8.000流速/（mL/min）0.300 0.300 0.300 0.300 0.300 0.300流动相A/%95.0 95.0 5.0 5.0 95.0 95.0流动相B/%5.0 5.0 95.0 95.0 5.0 5.0
1.3.3.2 质谱条件
离子源类型：电喷雾电离（ESI），正离子扫描模式；扫描类型：选择反应监测（SRM）；扫描范围：质荷比（m/z）为40～100 ；正离子电压：2 850 V；负离子电压：2 300 V；鞘气流速：40 Arb；辅助气流速：18 Arb；离子传输管温度：350 ℃；辅助气加热温度：200 ℃；Q1 分辨率：半峰全宽（full width at half maxima， FWHM）为0.7；Q3 分辨率：FWHM 为0.7；碰撞气体：2 mTorr；结束时间：8 min。
1.3.4 标准曲线、线性范围、检出限和定量限的测定
标准曲线的测定方法：对标准使用液（1 190.64 µg/L）进行逐级稀释，得到5 个浓度的标准工作液，之后将配制好的标准溶液工作液使用0.22 µm 水相微孔滤膜过滤后，直接上机检测，要求标准工作液现配现用。
线性范围的测定：根据标准曲线的最低浓度和最高浓度确定标准曲线线性范围。
检出限：将标准品浓度稀释到仪器能检测的最小浓度后，重复检测n 次（n≥7）试验，将各测定结果换算为样品中的浓度或含量，计算n 次平行测定的标准偏差，按下列公式计算方法检出限。
式中：M 为方法检出限，µg/L；n 为样品平行测定次数；t（n-1，0.99）为自由度为n-1、置信度为99%时的t 分布值（单侧）；S 为n 次平行测定的标准偏差。
定量限：按照检出限是定量限的3/10 进行计算，得出定量限。
1.3.5 加标回收率及精密度的测定
对样品进行加标回收试验，分别加入11.91、29.77、59.53 µg/L 3 个浓度的标液，每个浓度进行6 个平行测定，得出检测结果后减去样品本底浓度，计算回收率、平均回收率和标准偏差。
1.4 数据分析
试验均进行6 次重复，用平均值和标准偏差表示，且在进行方法检出限时，试验次数为7 次。以SPSS 26 进行标准偏差分析，标准偏差≤5% 时，结果可信，EC 的含量检测结果由Thermo TraceFinder General LC软件直接导出。
2 结果与分析
2.1 正负离子的选择
本研究所使用的TSQ Altis Plus 三重四极杆液相色谱质谱联用仪的ESI 接口有正负离子检测模式，柯润辉等[12] 、熊晓通等[16]、孙贺等[17]检测EC 时均选择使用正离子模式。本研究在方法建立初期首先对正负离子的响应进行探索，氨基甲酸乙酯正负离子模式下响应图谱比较结果如图1 所示。
图1 氨基甲酸乙酯正负离子模式下响应图谱
Fig.1 Comparison of reaction patterns in positive and negative ion modes
A. 负离子模式；B. 正离子模式。
由图1 可知，EC 在负离子模式下响应明显低于正离子模式。在负离子模式下，EC 子离子最高离子强度为4.30×102，而在正离子模式下最高离子强度为9.42×103，因此选择正离子模式的Q1 全扫对氨基甲酸乙酯进行碰撞寻找离子对。
2.2 色谱流动相的选择
目前已报道的液相色谱-串联质谱法检测氨基甲酸乙酯的流动相的有机相主要有乙腈和甲醇，水相有0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸铵水溶液[16-19]。由于乙腈毒性大于甲醇毒性，且添加一定量的盐溶液可以增加离子响应值，因此本试验选择流动相为甲醇-0.1% 甲酸水溶液、甲醇-0.1% 乙酸水溶液、甲醇-0.1% 乙酸铵水溶液进行检测。在不同流动相下对氨基甲酸乙酯（EC）的标准溶液进行测定，结果如图2、图3 所示。
图2 不同流动相下离子响应图谱
Fig.2 Mass spectra obtained with different mobile phases
A. 流动相为甲醇-0.1%乙酸铵水溶液；B. 流动相为甲醇-0.1%乙酸水溶液；C. 流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液。
图3 不同流动相下EC 的保留时间
Fig.3 Retention time of EC under different mobile phases
A. 流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液；B. 甲醇-0.1%乙酸水溶液；C. 流动相为甲醇-0.1%乙酸铵水溶液。
由图2、图3 可知，EC 的离子强度在流动相为甲醇-0.1% 甲酸水溶液的条件下最高，且流动相为甲醇-0.1% 甲酸水溶液和甲醇-0.1% 乙酸水溶液的条件下，EC 的保留时间较稳定，保留时间在2.77 min 左右，而流动相为甲醇-0.1% 甲酸水溶液时，保留时间变化较大从2.30 min 变化到3.22 min。因此，最后确定甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行洗脱。
2.3 离子对的确定与优化
本研究根据氨基甲酸乙酯的分子结构，采用质谱针泵连续进样方式，利用三重四极杆的电喷雾电离（ESI）模式的Q1 全扫触发Q3 模式对氨基甲酸乙酯的母离子进行碰撞，在碰撞过程中引入缓冲盐溶液以增加离子响应程度。 因在条件探索过程中使用的是针泵连续进样，并且引入流动相稀释，所以选择浓度为1 190.64 µg/L 的氨基甲酸乙酯进行离子对选择。氨基甲酸乙酯子离子色谱图如图4 所示。
图4 氨基甲酸乙酯子离子色谱图
Fig.4 Ion chromatogram of ethyl carbamate
A. 优化前；B. 优化后。
由图4 可知，质荷比为61.92、71.88、43.88 的3 个子离子的响应度最高，选择质荷比为61.92、71.88、43.88 的3 个子离子进行定量和定性分析。根据子离子响应值的大小，质荷比为61.92 的子离子响应最高，作为本研究中对氨基甲酸乙酯进行定量的特征性碎片离子，而质荷比为71.88、43.88 的两对离子作为本研究的定性离子。
通过调整裂解电压、离子传输管温度、鞘气、辅助气、碰撞能量等参数，对特征性碎片离子m/z 61.92 的响应值进行优化，优化后特征离子的响应强度由1.39×104（图4A）提高到6.55×104（图4B），提高了4.71 倍，且优化后特征离子61.92 的响应强度较71.88 和43.88的响应强度高出许多，优化后参数见1.3.3.2，优化后子离子碰撞能量见表2。
表2 氨基甲酸乙酯定性定量监测离子对及相关参数
Table 2 Ion pairs and related parameters for qualitative and quantitative monitoring of ethyl carbamate
注：*为定量特征离子。
化合物氨基甲酸乙酯（EC）结构式O母离子（m/z）89.963子离子（m/z）71.88碰撞能量/V 12.73 H2N O 61.92*43.88 9.01 22.9
2.4 标准曲线、线性范围、检出限和定量限的测定结果
按照已确定的色谱条件和质谱条件，取标准工作液进行上机测定，通过仪器自带采集软件对各物质的峰面积进行采集。以配制的标准曲线浓度（X，µg/L）为横坐标，采集所得的峰面积（Y）为纵坐标，通过仪器的工作站进行线性回归，氨基甲酸乙酯标准曲线如图5所示。
图5 氨基甲酸乙酯标准曲线
Fig.5 Standard curve of ethyl carbamate
由图5 可知，氨基甲酸乙酯的线性回归方程为Y=8 115X-24 810，R2=0.999 6。氨基甲酸乙酯在11.91～238.13 µg/L 内线性良好。
检出限平行测定结果如表3 所示。
表3 检出限平行测定结果
Table 3 Limit of detection
序号1 2 3 4 5 6 7测定结果/（µg/L）1.445 1.450 1.422 1.514 1.499 1.480 1.424检出限/（µg/L）0.114
由表3 可知，样品测定7 次后，根据测定结果，按照计算公式计算得出该方法检出限为0.114 µg/L，定量限为0.380 µg/L。
2.5 加标回收率及精密度的测定结果
取一个白酒样品进行本底检测，之后进行3 个加标量且平行6 组的加标检测，加标回收率及精密度结果如表4 所示。
表4 白酒加标回收率及精密度结果（n=6）
Table 4 Recovery and precision of ethyl carbamate in Baijiu（n=6）
样品本底值/（µg/L）43.92加标量/（µg/L）11.91测定值/（µg/L）55.42 56.68 56.73 55.26 56.64 56.40回收率/%96.65 107.16 107.62 95.28 106.81 104.87平均回收率/%103.06相对标准偏差/%1.19
续表4 白酒加标回收率及精密度结果（n=6）
Continue table 4 Recovery and precision of ethyl carbamate in Baijiu（n=6）
样品本底值/（µg/L）43.92加标量/（µg/L）29.77平均回收率/%106.34相对标准偏差/%1.57 59.53测定值/（µg/L）74.27 77.14 76.64 75.29 75.78 74.29 108.61 103.07 107.40 103.84 104.38 106.07回收率/%101.98 111.60 109.95 105.39 107.06 102.04 108.66 99.37 106.63 100.66 101.56 104.40 103.55 2.05
由表4 可知，当加标量为11.91 µg/L 时，EC 的加标回收率在95.28%～107.62%，平均回收率为103.06%；加标量为29.77 µg/L 时，EC 的加标回收率在101.98%～111.60%，平均回收率为106.34%；加标量为59.53 µg/L时，EC 的加标回收率在99.37%～108.67%，平均回收率为103.55%。3 组加标量的相对标准偏差在1.19%～2.05%，均小于10%，符合GB 5009.295—2023《食品安全国家标准 化学分析方法验证通则》对精密度的要求。
2.6 白酒检测结果
为测试方法准确性和稳定性，在市场上购买了5种不同品牌的白酒，使用上述方法检测各个酒样的EC含量，对每个酒样进行6 次重复检测。5 种市售白酒中氨基甲酸乙酯含量检测结果如表5 所示。
表5 市售白酒中氨基甲酸乙酯含量检测结果（n=6）
Table 5 Content of ethyl carbamate in commercially available Baijiu （n=6）
样品样品1样品2样品3样品4样品5 EC 含量/（µg/L）89.37 116.81 77.18 123.88 96.23相对标准偏差/%3.49 1.84 2.46 2.61 3.06
由表5 可知，5 种品牌中均检测出中氨基甲酸乙酯，且EC 平均含量为100.69 µg/L，测定结果相对标准偏差为1.84%～3.49%，均小于5%，说明所建立的液相色谱-质谱联用法测定白酒中氨基甲酸乙酯含量的方法具有较高的准确度和精密度。
3 结论
本研究利用三重四极杆液相色谱质谱联用仪的ESI（电喷雾电离）模式的Q1 全扫触发Q3 模式选择和优化离子对，再通过SRM 扫描模式进行分析，建立了一种白酒中氨基甲酸乙酯的快速测定方法。对色谱条件、质谱条件进行了考察与优化，优化后的色谱条件为使用Accucore aQ 液相色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 µm）在柱温为40 ℃、样品室温度为16 ℃、进样量为2 µL、流动相使用甲醇-0.1%的甲酸溶液条件下进行梯度洗脱。质谱条件为在正离子ESI、SRM 模式、正离子电压为2 850 V、负离子电压为2 300 V、鞘气流速为40 Arb、辅助气流速为18 Arb、离子传输管温度为350 ℃、辅助气加热温度为200 ℃、碰撞气体为2 mTorr 条件下进行检测。在最优条件下，氨基甲酸乙酯能够在8 min 内通过定量和定性离子对被准确的定量和定性。检出限、回收率及精密度等均能满足实际测试需求。该方法较柯润辉等[12]建立的超高效液相色谱-串联质谱法同时测定白酒中氨基甲酸乙酯和8 种甜味剂的方法具有前处理方式简单、检测耗时短、灵敏度高、定量限低等特点，可以成功地应用于白酒中氨基甲酸乙酯含量的检测。
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