柠檬磷伞种（Pholiotɑ limonellɑ）是滑子菇常见栽培种，除具有高蛋白、低脂肪等食用菌共性优点外，相比其它滑子菇种其表面分泌有大量黏液，富含滑菇多糖、蛋白质、维生素等，使其成为食用菌研究的新宠[1-2]。目前滑子菇常用培养基有马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、最低基本培养基等，但都存在生长缓慢、菌丝量少等亟待解决的难题，难以满足规模化生产及研究工作的需求。
刘芳等[3]对烟草疫病进行有效生物防治，将玉米粉作为主要碳源开发出了贝莱斯芽胞杆菌YC11 液体发酵培养基，菌丝生物量达到了76.9 亿芽胞/mL。乔俊卿等[4]为提高芽孢杆菌表面活性素的生物量，将黄豆粉作为主要氮源，开发出了一种新型芽孢杆菌B9BD 发酵培养基。目前还未见以玉米淀粉、黄豆粉作为主要碳源、氮源的柠檬磷伞种液体发酵培养基。本研究以玉米淀粉、黄豆粉、MgSO4 为原辅料研发出一种新型培养基，通过单因素筛选与响应面试验确定最优配方，通过质构仪对优化条件下生长出的滑子菇进行质构参数分析，依据相关国家标准对其进行性能指标的测定，以期为滑子菇加工应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
滑子菇供试菌种（柠檬磷伞种）：延安大学生命科学学院食用菌分子育种实验室提供。
葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉：北京奥博星生物技术有限公司；玉米淀粉、黄豆粉：北京鸿润宝顺科技有限公司；维生素C、硫酸镁（均为分析纯）：天津市博迪化工有限公司；麸皮：天津市天力化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HC-3518 高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；GHP-9160 隔水式恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；LDZ -75L-I 立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ZQZY-CS9S 振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；TMS-PRO 质构仪：美国Food Technology Corporation 公司。
1.3 培养基
参照戴建清等[5]的方法配制普通马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基，普通PDA液体培养基，参照文献[6]的方法配制PDA 综合培养基，按照文献[7-9]的方法配制种子液培养基。
1.4 试验方法
1.4.1 菌种活化
将供试母种以接种铲接种到PDA 平板中，培养箱25 ℃培养7 d；使用PDA 综合培养基平板活化滑子菇菌种，在25 ℃条件下，培养10 d。种子液培养：活化的菌种接种在500 mL 锥形瓶，装液量300 mL，温度控制在（25±1） ℃，摇床180 r/min，培养7 d；液体优化培养基：接种量10%，培养条件控制温度为（25±1） ℃、摇床转速为180 r/min，培养时间为7 d。
1.4.2 菌丝生物量测定
将菌丝以8 层纱布过滤培养液，清水冲洗表面3 次，置于50 mL 离心管中进行离心（7 000 r/min，10 min），而后置于预先清洗烘干的锥形瓶中（称空瓶质量），封口膜封口处理后。置于60 ℃干燥箱中烘24h 后，称取总质量，去除空瓶质量后得菌丝生物量干重。
1.4.3 单因素试验
按照文献[10-11]设计单因素试验。以蛋白胨（氮源）浓度30 g/L，MgSO4（无机盐）浓度3g/L，维生素C（生长因子）浓度0.005 g/L 为基准，从葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉中筛选碳源，浓度分别设置为10、20、30、40、50 g/L，得出最优碳源浓度；以葡萄糖（碳源）浓度20 g/L，MgSO4（无机盐）浓度3 g/L，维生素C（生长因子）浓度0.005 g/L 为基准，从麸皮、黄豆粉，蛋白胨中筛选氮源，浓度分别设置为20、30、40、50、60 g/L，得出最优氮源浓度；以葡萄糖（碳源）浓度20 g/L，蛋白胨（氮源）浓度30 g/L，维生素C（生长因子）浓度0.005 g/L 为基准，从NaCl、MgSO4 中筛选无机盐，浓度分别设置为1、2、3、4、5 g/L，得出最优无机盐浓度；以葡萄糖（碳源）浓度20 g/L，蛋白胨（氮源）浓度30 g/L，MgSO4（无机盐）浓度为3 g/L为基准，设置维生素C 浓度分别为0.001、0.005、0.010、0.050、0.100 g/L，得出最优生长因子浓度，由于生长因子维生素C，在高温灭菌条件会失活，灭菌后，过0.22 µm的滤膜。以上试验设置3 组重复，培养条件为（25±1） ℃、180 r/min、7 d。
1.4.4 Plackett-Burman（PB）设计
参考Oludemi 等[12]的方法，在单因素优化试验的基础上，使用Design-Expert 11 软件进行PB 设计，从碳源、氮源、无机盐以及生长因子中选取影响菌丝生物量的显著因素[13]。
PB 试验水平设计见表1。
表1 PB 设计因素水平
Table 1 Factors and levels of PB design
因素种类水平E 蛋白胨浓度/（g/L）G NaCl 浓度/（g/L）H MgSO4 浓度/（g/L）-1 1 A 葡萄糖浓度/（g/L）30 50 B 蔗糖浓度/（g/L）20 40 C 玉米淀粉浓度/（g/L）20 40 D 黄豆粉浓度/（g/L）40 60 2 4 F 麸皮浓度/（g/L）20 40 2 4 3 5 I 维生素C浓度/（g/L）0.010 0.100
1.4.5 最陡爬坡试验
根据PB 试验结果，确定对菌丝生物量影响最为显著的因子，以试验值变化的梯度方向作为爬坡方向，在PB 试验低水平的基础上设置10 个梯度的爬坡试验[14]，每组重复3 次，参考赵航轲等[15]方法，在单因素试验以及PB 设计的基础上，对筛选出的显著影响因素选择出中心点值，进行后续试验。
1.4.6 中心组合试验与响应面分析
为得到3 种显著影响因素的最佳组合，以爬坡试验所得的数据组合为中心，参考赵航轲等[15]的方法，在前期试验的基础上，使用Design-Expert 11 软件进行三因素三水平中心组合设计[16]，最后用响应面法分析[17-18]，中心组合试验因素及水平见表2。
表2 中心组合试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of center combination
因素水平C MgSO4 浓度/（g/L）-1 0 1 A 玉米淀粉浓度/（g/L）30 40 50 B 黄豆粉浓度/（g/L）30 50 70 4 6 8
1.4.7 验证试验
为了验证模型的准定性和有效性，在培养条件不变的情况下，采用普通培养基和预测的最佳培养基组成分别进行摇瓶培养试验，摇瓶培养7 d 后测量菌丝干重，与优化前参数进行比较[19]。
1.4.8 质构分析
在最优条件下待滑子菇生长到子实体阶段，用质构仪的质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模组对其进行物性测试[20]，采用3PB 型号探头，操作类型选择“PTZ1”，测前、测中、测后速度分别设置为1、1、5 mm/s，触发力为0.3 N，触发类型选择“AUTO”，压缩间隔设置2 s，样品进行3 次重复，选择滑子菇硬度（N）、黏着性（N·s）、咀嚼性（N）、凝聚性（mJ）、弹性（mm）等参数进行测试[21-22]。
1.4.9 滑子菇性能指标测定
酸价采用GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》的方法测定、过氧化值采用GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》的方法测定、菌落总数采用GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》的方法测定、大肠杆菌数采用GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》的方法测定、霉菌数采用GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》的方法测定、酵母数采用GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》的方法测定，为滑子菇运输、保鲜、贮藏等提供参考依据[23]。
1.5 数据处理
本试验使用Design-Expert 11 对滑子菇液体发酵培养基工艺优化，采用IBM SPSS Statistics 19 分析数据，使用Texture Analysis softwareV1.18- 408 软件对柠檬鳞伞种质构参数进行分析，联合使用GraphPad Prism.9.5 与Origin 2022 软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
单因素筛选结果见图1。
图1 单因素筛选结果
Fig.1 Results of single factor screening
a～d 分别为碳源、氮源、无机盐、维生素C 浓度的单因素试验结果。在同一因素中不同浓度条件下比较菌丝生物量差异，**表示P<0.05，***表示P<0.01。
由图1a 可知，葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉浓度太高和太低都不利于滑子菇菌丝体的生长，当葡萄糖浓度为40 g/L 时，滑子菇生物量最大为0.705 g。当蔗糖浓度为30 g/L 时，滑子菇生物量最大，为0.568 g；当玉米淀粉浓度为30 g/L 时，滑子菇生物量最大，为1.007 g，碳源选择玉米淀粉进行后续试验。
由图1b 可知，黄豆粉、麸皮、蛋白胨浓度太高和太低均不利于滑子菇菌丝体的生长，当黄豆粉浓度为30 g/L 时，滑子菇生物量最大，为0.787 g；当麸皮浓度为40 g/L 时，滑子菇生物量最大，为0.660 6 g；当蛋白胨浓度为30 g/L 时，滑子菇生物量最大，为0.730 6 g，氮源选择黄豆粉进行后续试验。
由图1c 可知，氯化钠、硫酸镁浓度太高和太低都不利于滑子菇菌丝体的生长，当氯化钠浓度为3 g/L时，滑子菇生物量最大，为0.392 g；当硫酸镁浓度为4 g/L 时，滑子菇生物量最大，为0.561 g，无机盐选择硫酸镁进行后续试验。
由图1d 可知，维生素C 浓度太高和太低都不利于滑子菇菌丝体的生长，当维生素C 浓度为0.050 g/L时，滑子菇生物量最大，为0.318 g，试验表明VC 不符合筛选要求，故不做选择。
2.2 Plackett-Burman 设计试验结果
PB 试验结果见表3。
表3 Plackett-Burman 设计试验结果
Table 3 Plackett-Burman design test results
试验号A E F G I 菌丝生物量/g 1 2 3 4 5-1-1-1-1 1 B 1 --1-1 1 1 1 -1 C 1 1 -D 1 --1-1 1 1 1 1 1 --1 1-1 1 1 1 1 1 -1 1 1 1 1 1 H 1 1 1 -1 1 1 1 -1-1 3.913 2.798 2.780 2.034 3.799
续表3 Plackett-Burman 设计试验结果
Continue table 3 Plackett-Burman design test results
试验号B C D F I 6 7 8 9 10 A 1-1 1 1--1-1 E 1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1 G 1-1 H 1-1 1-1 1--1 1-1-1 1 1 1 1-1-1-1 1 1-1-1-1 1-1 11 12 1 1 1 1 1-1 1 1 1 1-1 1 1-1-1-1-1 1 1 1菌丝生物量/g 2.356 1.980 2.154 2.389 2.203 2.581 2.716
通过Design-Expert 11 软件Plackett-Burman 模块对数据进行分析结果见表4。
表4 PB 试验方差分析
Table 4 PB test variance analysis
方差来源模型C 玉米淀粉浓度D 黄豆粉浓度H 硫酸镁浓度残差平方和4.05 1.32 1.27 1.27 0.338 8自由度4 1 1 1 7均方1.01 1.32 1.27 1.27 0.048 4 F 值20.94 27.26 26.15 26.15 P 值0.000 5 0.001 2 0.001 4 0.001 4
由表4 可知，根据模型的P 值<0.01，说明此模型可行且拟合程度好。即在所选因素中玉米淀粉浓度（C）、黄豆粉浓度（D）、硫酸镁浓度（H）为主要影响因子。由于模型所在回归区域内拟合较好，可作为后续Box-Behnken 试验的基础。因此在Box-Behnken 试验中控制具有显著性影响的因子来进行深一步的研究。
2.3 最陡爬坡试验结果
在Plackett-Burman 设计试验结果的基础上进行最陡爬坡试验，最陡爬坡试验结果见表5。
表5 最陡爬坡试验结果
Table 5 Results of steepest climb test
试验号硫酸镁浓度/（g/L）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10玉米淀粉浓度/（g/L）20 30 40 50 60 70 80 90 100 110黄豆粉浓度/（g/L）10 30 50 70 90 110 130 150 170 190 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20菌丝生物量/g 0.897 1.372 2.004 1.693 1.473 1.274 1.211 0.983 0.963 0.674
由表5 可知，随着玉米淀粉浓度、黄豆粉浓度以及硫酸镁浓度的增加，菌丝生物量呈先升高后降低的趋势，当三者浓度依次为40、50、6 g/L 时，得到菌丝最大生物量为2.004 g。
2.4 中心组合响应面分析试验结果
通过软件Design-Expert 11 中的Box-Behnken 模块根据PB 试验和爬坡试验进行三因素三水平中心组合设计，结果见表6。
表6 中心组合设计试验结果
Table 6 Center combination design test results
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A1 0-1 0 0-B1 0 0-C0 0-1-1 0 0 0-1 1 0--1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 1 0 0-1 1 0 1 0-1 0 0 1 0 1-1 0 1 0 0 1 0-1 0 0 0 0 1 1 1 1 Y 菌丝生物量/g 1.826 2.212 1.544 1.543 2.214 1.512 2.221 1.516 1.542 2.163 1.494 1.487 2.194 1.688 1.822 1.398 1.519
利用Design-Expert 11 软件对试验所得菌丝生物量进行分析可得，菌丝生物量对玉米淀粉浓度、黄豆粉浓度、硫酸镁浓度的回归方程：Y=2.20+0.071 1A+0.077 9B+0.035 3C+0.089 2AB+0.079 5AC+0.076 0BC-0.345 5A2-0.275 5B2-0.318 8C2。对所得结果进行方差分析，结果见表7。
表7 响应面方差分析
Table 7 Response surface variance analysis
注：P<0.05 表示影响显著；P<0.01 表示影响极显著。
方差来源模型A 玉米淀粉浓度B 黄豆粉浓度C 硫酸镁浓度AB AC BC A²B²C²残差失拟项纯误差总离差平方和1.57 0.040 5 0.048 5 0.009 9 0.031 9 0.025 3 0.023 1 0.502 7 0.319 6 0.427 9 0.009 1 0.006 9 0.002 2 1.58自由度9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16均方0.175 0 0.040 5 0.048 5 0.009 9 0.031 9 0.025 3 0.023 1 0.502 7 0.319 6 0.427 9 0.001 3 0.002 3 0.000 5 F 值134.68 31.15 37.35 7.65 24.53 19.46 17.78 386.95 246.05 329.36 P 值<0.000 1 0.000 8 0.000 5 0.027 8 0.001 7 0.003 1 0.004 0<0.000 1<0.000 1<0.000 1 4.22 0.099 0
由表7 可知，模型的P<0.001，因此本模型拟合程度好且达到极显著水平。其中A、B、A2、B2、C2、AB、AC、BC影响极显著，C 影响显著。复相关系数R2=0.994 3，模型选择合适，失拟项小于0.05，试验可信。
根据模型的回归方程，通过 Design-Expert 11 软件生成响应曲面，见图 2～图4。
由图2 可知，玉米淀粉浓度44.0～48.0 g/L，黄豆粉浓度53.0～57.0 g/L 时，菌丝生物量较高；由图3 可知，玉米淀粉浓度44.0～48.0 g/L，MgSO4 浓度5.5～6.5 g/L时，菌丝生物量较高；由图4 可知，MgSO4 浓度5.5～6.5 g/L，黄豆粉浓度53.0～57.0 g/L 时，菌丝生物量较高。
图2 玉米淀粉和黄豆粉的浓度交互作用
Fig.2 Interaction between concentrations of corn starch and soybean powder
图3 玉米淀粉和硫酸镁的浓度交互作用
Fig.3 Interaction between concentration of corn starch and MgSO4
图4 黄豆粉和硫酸镁的浓度交互作用
Fig.4 Interaction between soybean powder and MgSO4 concentration
2.5 验证试验
根据响应面分析得出玉米淀粉的最佳浓度为47.396 g/L，黄豆粉的最佳浓度为55.707 g/L，MgSO4 的最佳浓度为6.363 g/L，菌丝生物量为2.094 g。根据响应面分析所得的最佳浓度值进行验证试验，所得的菌丝生物量为2.012 g，优化前使用普通培养基摇瓶培养的菌丝生物量平均为0.711 g，产量提升了182.98%。该结果确定采用响应面法优化滑子菇液体培养最佳营养条件是有效可行的。
2.6 质构特性分析
滑子菇质构特性分析结果见表8。
表8 滑子菇质构特性分析
Table 8 Analysis of texture characteristics of Pholiota nameko
名称普通PDA 培养基PDA 综合培养基优化培养基硬度/N 18.66±0.24 19.25±0.22 16.18±0.37黏着性/（N·s）-1.13±0.04-1.05±0.01-1.26±0.02凝聚性/mJ 0.11±0.03 0.18±0.01 0.25±0.02咀嚼性/N 2.15±0.01 2.61±0.02 2.88±0.05弹性/mm 0.97±0.04 0.69±0.02 1.25±0.05
由表8 可知，相较于传统培养基下的滑子菇，在优化后的培养基中生长出的滑子菇硬度与黏着性下降，提升了弹性与咀嚼性，且具有更好的凝聚性。
2.7 性能指标分析
玉米淀粉（碳源）浓度为47.396 g/L，黄豆粉（氮源）浓度为55.707 g/L，MgSO4（无机盐）浓度为6.363 g/L 制作液体发酵培养基，依据食品安全国家标准对其进行分析，通过3 次重复验证，滑子菇各项理化指标与微生物指标均符合国家安全质量标准的各项规定，结果见表9。
表9 滑子菇性能指标检测结果
Table 9 Test results of performance index of Pholiota nameko
检验项目酵母/（CFU/g）标准要求≤20检测数据<10评价合格酸价/（mg/g）≤5.0<4合格过氧化值/（g/100 g）≤0.25<0.18合格菌落总数/（CFU/g）≤100 000<20合格大肠杆菌数/（CFU/g）≤100 0合格霉菌/（CFU/g）≤50<10标准来源GB 4789.15—2016 GB 5009.229—201 GB 5009.227—2016 GB 4789.2—2016 GB 4789.3—2016 GB 4789.15—2016合格
3 结论
结果表明优化后培养基配方为玉米淀粉的最佳浓度为47.396 g/L，黄豆粉的最佳浓度为55.707 g/L，MgSO4 的最佳浓度为6.363 g/L，此时菌丝生物量达到最大值为2.094 g。同未优化培养基菌丝生物量相比，产量提升了182.98%。此条件下生长出的滑子菇硬度为（16.18±0.37） N，弹性为（1.25±0.05） mm，凝聚性为（0.25±0.02） mJ，其各项数值均符合国标规定。采用优化后发酵培养基培育的滑子菇具有高抗氧活性、高生物量、高致密性的特点。
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