灵芝孢子是灵芝成熟后从真菌中排出的颗粒状生 殖细胞，内含大量活性成分，具备较高的营养和药用价值[1]，主要包括调节消化[2]、抗肿瘤[3]、脏器保护[4]等功能。现代研究表明，灵芝孢子粉的组成成分包括蛋白质、三萜类化合物和多糖类等[5]，其中灵芝孢子粉中蛋白质的含量丰富[6]。于华峥等[7]在研究灵芝子实体、孢子粉及菌丝体化学成分差异时发现，三者中蛋白质含量最高的是灵芝孢子粉；其中亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等人体必需氨基酸的含量达到10 g/kg 以上[8]。对灵芝孢子粉蛋白及酶解多肽抗氧化活性进行深入研究，不仅能为丰富灵芝活性物质基础研究提供新的思路，也有利于灵芝孢子粉的高值化利用[9]。
抗氧化性能够通过清除过量自由基有效减轻机体的氧化损伤[10]，而抗氧化物的活性决定了其可以中和自由基的量[11]，抗氧化肽在延缓衰老[12]和防治氧化应激[13]相关疾病方面具有巨大的潜力。生物活性肽可广泛应用于抗氧化类的保健食品以及药品等行业，具有较高的经济价值。活性肽具有生物活性强、安全性高的优点已引起了部分制药行业和医疗保健行业专家的关注[14]。目前，中药（如灵芝[15]、当归[16]和核桃仁[17]等）的生物活性肽已被证实具有抗氧化、抗菌性等功能。在加工和贮藏中，环境温度、pH 值等均会对抗氧化肽的活性造成影响[18]，因此研究不同处理方法及贮藏条件来综合评价抗氧化肽的稳定性尤为重要。
本研究以灵芝孢子粉为原料，以酶解液的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率为指标，经单因素试验和响应面试验对酶解条件进行优化制备抗氧化肽，并评价其贮藏稳定性，以期提高灵芝孢子粉的综合利用效率，为深入研究灵芝孢子粉抗氧化肽提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灵芝孢子粉：宁安市江南北域珍奇山林食品有限公司；氢氧化钠、浓盐酸：广州化学试剂厂；无水乙醇：天津市永大化学试剂有限公司；DPPH、茚三酮、胰蛋白酶（50 000 U/mg）、中性蛋白酶（50 U/mg）：上海麦克林生化科技股份有限公司；碱性蛋白酶（200 000 U/g）、风味蛋白酶（30 000 U/mg）：北京索莱宝生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司。所有化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1150 紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TDL-5-A 低速离心机：飞鸽（上海）有限公司；QC01 精密pH 计：东莞市希玛仪表有限公司；KQ-100DE 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Alpha 2-4 LD plus 真空冷冻干燥机：德国Christ 公司；3-18KR 超速冷冻离心机：湖南可成仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 灵芝孢子粉蛋白提取
将灵芝孢子粉按料水比1∶20 （g/mL）充分溶胀并调节pH 值至9.00±0.02，超声辅助提取后于45 ℃水浴1 h。冷却至室温后离心（5 000 r/min，20 min）收集上清液，剩余沉淀进行二次提取，合并两次上清液抽滤除渣。将所得上清液pH 值调节至等电点2.0，4 ℃环境下沉降3 h，离心（5 000 r/min，20 min）弃上清液并收集蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀水洗至中性，置于真空冷冻干燥机中干燥得到灵芝孢子粉蛋白，-20 ℃保存备用。
1.3.2 最优酶筛选
取灵芝孢子粉蛋白为底物，分别加入单位酶活为3 000 U/g 的碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶。在各酶的最适条件下（见表1）酶解3 h 后，沸水浴灭活蛋白酶。冷却至室温后，离心（5 000 r/min，20 min）得到上清液，测定并计算各上清液的水解度及DPPH 自由基清除率，以选出灵芝孢子粉蛋白的最佳蛋白酶。
表1 不同蛋白酶酶解条件
Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases
蛋白酶种类碱性蛋白酶风味蛋白酶胰蛋白酶木瓜蛋白酶中性蛋白酶适宜pH 值8.0 7.0 8.0 6.5 6.0适宜温度/℃55 50 55 37 50
1.3.3 单因素试验
采用方法1.3.2 筛选最适酶以水解灵芝孢子粉蛋白得到其抗氧化肽，对其酶解工艺进行单因素试验。分别探究酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g）、酶解时间（1、2、3、4、5 h）、酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）、pH 值（7、8、9、10、11）、底物浓度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%）对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH自由基清除率和水解度的影响，确定单因素试验的最佳条件。
1.3.4 响应面优化试验
基于单因素试验的初步结果，选取DPPH 自由基清除率作为评价指标，并将酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）确定为影响试验的关键变量。依照Box-Behnken 设计的原则，制定了三因素三水平的响应面试验方案。因素及水平见表2。
表2 响应面试验因素水平
Table 2 Factors and levels of response surface test
因素水平B 酶解时间/h-1 0 1 A 酶添加量/（U/g）1 000 2 000 3 000 2 3 4 C 酶解温度/℃50 55 60
1.3.5 水解度测定
参考杨文博等[19]的方法，通过茚三酮显色法来测定酶解液中的水解度。标准曲线的绘制：将甘氨酸溶液分别配制成浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL浓度的标准溶液，均加入显色剂1 mL 后沸水浴加热15 min。加热完成后，立即用冷水冷却试管，并加入5 mL 的40%乙醇溶液，静置15 min 后在570 nm 波长处测量吸光度。根据标准曲线计算游离氨基的含量，标准曲线回归方程为Y=0.520 2X-0.579 3，R2=0.998 4。灵芝孢子粉蛋白水解度（ɑ，%）的计算公式如下。
式中：b 为灵芝孢子粉蛋白酶解后游离氨基酸含量，mg；c 为蛋白酶解前游离氨基酸含量，mg；d 为灵芝孢子粉中蛋白含量，mg。
1.3.6 DPPH 自由基清除率测定
参考Teow 等[20]的方法进行了适当改动。取0.5 mL的无水乙醇与2.5 mL 的DPPH 乙醇溶液混合，在避光条件下反应30 min，之后在517 nm 处测定混合溶液的吸光度（记作A0）。取0.5 mL 样品溶液与2.5 mL DPPH乙醇溶液混匀，避光反应30 min 后在517 nm 处测定吸光度（记作A1）。取样品溶液0.5 mL 与2.5 mL 无水乙醇溶液混合，避光反应30 min，并在517 nm 波长处测定吸光度（记作A2）。DPPH 自由基清除率（W，%）计算公式如下。
1.3.7 灵芝孢子粉抗氧化肽稳定性测定
1.3.7.1 温度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性稳定性的影响
将灵芝孢子粉抗氧化肽分别置于20、40、60、80 ℃的温度下水浴2 h 后取出，在冰水中快速冷却至室温后测定其DPPH 自由基清除率。
1.3.7.2 pH 值对灵芝孢子粉抗氧化肽活性稳定性的影响
将灵芝孢子粉抗氧化肽pH 值分别调节至4、6、8、10，于25 ℃振荡2 h 后取出，测定其DPPH 自由基清除率。
1.3.7.3 不同金属离子及浓度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性稳定性的影响
向灵芝孢子粉抗氧化肽中分别添加100、150、200、250 µg/mL 的K+、Ca2+、Mg2+金属离子溶液，25 ℃振荡2 h 后取出，测定其DPPH 自由基清除率。
1.4 数据处理
所有试验均进行3 次重复试验，使用Design Expert 13.0 软件、SPSS 26.0 软件对数据进行试验设计和数据分析，数据结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶的筛选
选用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶5 种不同的蛋白酶对灵芝孢子粉蛋白进行酶解。蛋白酶解产物会释放出具有抗氧化活性的小分子肽，由于不同蛋白酶的酶切位点不同，故酶解得到的产物及生物活性具有一定的差异[21]。不同酶对灵芝孢子粉蛋白酶解产物DPPH 自由基清除率和水解度的影响如图1 所示。
图1 不同酶酶解对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率和水解度的影响
Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis with different enzymes on DPPH free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of antioxidant peptide in Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示同一指标组间差异显著，P<0.05。
由图1 可知，碱性蛋白酶酶解产物的DPPH 自由基清除率最高，为99.26%，显著高于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶（P<0.05）；胰蛋白酶酶解产物的DPPH 自由基清除率显著低于其他处理（P<0.05），但其水解度显著高于其他处理（P<0.05），这可能是因为胰蛋白酶对灵芝孢子粉蛋白造成了过度水解，产生了较多的无结构物质，从而降低了酶解产物的抗氧化活性。综上，本研究选用碱性蛋白酶进行后续酶解工艺优化。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶添加量对灵芝孢子粉蛋白酶解效果的影响
酶添加量对灵芝孢子粉蛋白酶解产物DPPH 自由基清除率和水解度的影响见图2。
图2 酶添加量对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率和水解度的影响
Fig.2 Effect of enzyme addition amount on DPPH free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of antioxidant peptide in Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示同一指标组间差异显著，P<0.05。
由图2 可知当酶添加量为2 000 U/g 时，灵芝孢子粉蛋白酶解产物的DPPH 自由基清除率高于其他酶添加量，为97.13%。继续增加酶添加量，其酶解产物的DPPH 自由基清除能力逐渐降低，而水解度逐渐呈升高趋势，当酶用量为4 000 U/g 时水解度最大，显著高于其他处理（P<0.05）。这可能是随酶添加量增加，酶解产物与底物的结合效率逐步提高，酶解液中的蛋白质被水解，故水解度呈上升趋势[22]，过度水解使得具备抗氧化活性的多肽结构被分解，故其抗氧化活性逐渐降低[23]。当灵芝孢子粉蛋白酶解的酶添加量持续增加超过4 000 U/g 后抗氧化肽的水解度呈下降趋势。这可能是因为底物的总量是固定的，当底物和酶的结合达到饱和时，酶解产物分子之间会产生竞争性抑制阻碍其与酶的结合，使酶解速率降低[24]。综上，选择1 000、2 000、3 000 U/g 的酶添加量进行后续优化试验。
2.2.2 酶解时间对灵芝孢子粉蛋白酶解效果的影响
随酶解时间的延长，灵芝孢子粉蛋白酶解液中具备抗氧化活性的肽段也持续增多，自由基清除率也在逐步增强。酶解时间对酶解产物DPPH 自由基清除率和水解度的影响如图3。
图3 酶解时间对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率和水解度的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on DPPH free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of antioxidant peptide in Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示同一指标组间差异显著，P<0.05。
由图3 可知，酶解时间为3 h 时，灵芝孢子粉蛋白酶解产物的DPPH 自由基清除能力最强，为97.24%。但在达到峰值之后，其DPPH 自由基清除率会随酶解时间的延长而逐渐降低。在酶解时间为5 h 时灵芝孢子粉蛋白酶解产物的DPPH 自由基清除率显著低于其他处理（P<0.05）。这种现象可能是由于不同酶解时间产生的肽链结构和片段差异导致的结果。肽活性与其结构具有高度相关，当酶解时间持续延长时，一些具备抗氧化活性的活性肽可能会被过度水解，生成了无抗氧化活性的肽片段或游离氨基酸[25]，从而导致水解物的抗氧化活性下降。综合考虑，选择酶解时间2、3、4 h进行后续优化试验。
2.2.3 酶解温度对灵芝孢子粉蛋白酶解效果的影响
酶解温度对灵芝孢子粉蛋白酶解产物DPPH 自由基清除率和水解度的影响见图4。
图4 酶解温度对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率和水解度的影响
Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on DPPH free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of antioxidant peptide in Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示同一指标组间差异显著，P<0.05。
由图4 可知，随着酶解温度的逐渐升高，灵芝孢子粉蛋白的水解度呈现下降的趋势，其酶解液的DPPH自由基清除率逐步增加，在55 ℃时达到峰值。此后，其酶解液的DPPH 自由基清除率随酶解温度的增加而下降，在60 ℃时其DPPH 自由基的清除能力低于其他处理。该现象可能是因为酶解温度对酶活力具有直接的影响。在较低温度下，酶的催化效率尚未达到最优，因此适当提升酶解温度能够促进反应速率；当酶解温度过高时，蛋白酶的三维结构可能会受到破坏，发生不可逆的热变性，从而丧失活性[26]。这种变性会阻碍多肽的形成，进而减弱酶解液清除DPPH 自由基的能力。结合试验结果及生产成本的考虑，选择酶解温度50、55、60 ℃进行后续优化试验。
2.2.4 酶解pH 值对灵芝孢子粉蛋白酶解效果的影响酶解pH 值对灵芝孢子粉蛋白酶解产物DPPH 自由基清除率和水解度的影响见图5。
图5 酶解pH 值对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率和水解度的影响
Fig.5 Effect of pH value on DPPH free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of antioxidant peptide in Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示同一指标组间差异显著，P<0.05。
由图5 可知，灵芝孢子粉抗氧化肽水解度随pH值的增大呈现逐渐上升趋势，其DPPH 自由基清除率在pH 值为8 时达最强，这可能是因为碱性蛋白酶在pH 值最适条件下有助于发挥蛋白酶的酶活功能。pH值大于8 后灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率呈下降趋势，这个现象可能是因为pH 值过大影响了碱性蛋白酶的酶解活性，同时强碱环境也影响了底物蛋白的稳定性，导致其酶解产物抗氧化能力低下[27]。综合考虑，碱性蛋白酶酶解灵芝孢子粉蛋白最适宜的pH 值为8。
2.2.5 底物浓度对灵芝孢子粉蛋白酶解效果的影响
底物浓度对灵芝孢子粉蛋白酶解产物DPPH 自由基清除率和水解度的影响见图6。
图6 底物浓度对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率和水解度的影响
Fig.6 Effect of substrate concentration on DPPH free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of antioxidant peptide in Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示同一指标组间差异显著，P<0.05。
由图6 可知，随着底物浓度持续增加，灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率呈下降趋势，其水解度在底物浓度为1.00%时达最大（P<0.05）。这可能是由于在该底物浓度下酶的活性中心与底物结合实现了空间利用率的最大化，充分发挥了酶的水解功能。底物浓度的进一步增加使水解度降低，这可能是因为底物与蛋白酶之间的扩散运动会随着体系中有效水分的减少而受到减弱，限制了酶解作用的发挥。综上，碱性蛋白酶酶解灵芝孢子粉蛋白底物浓度为0.50%最合适。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面试验设计与结果
基于单因素试验的数据分析结果，选取酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）为考察因素，以灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验。Box-Behnken 试验设计结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 响应面设计试验结果
Table 3 Results of response surface design test
试验号A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1 1-1 1-1 1-1-1-1 1 1 0 0 0 0-C0 0 0 0-1-1 1 1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1-1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 DPPH 自由基清除率/%95.38 96.11 97.22 96.39 96.67 96.39 96.67 96.39 96.11 95.56 94.17 96.11 98.61 98.61 98.06 99.17 98.33
表4 回归模型与方差分析
Table 4 Regression model and analysis of variance
注：**表示影响极显著（P<0.01）；*表示影响显著（P<0.05）。
方差来源模型自由度显著性**A B C AB AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和平方和27.69 0.054 4 1.54 0.241 5 0.608 4 0 1.55 1.61 11.63 8.33 1.01 0.334 6 0.679 9 28.70 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 16方差3.08 0.054 4 1.54 0.241 5 0.608 4 0 1.55 1.61 11.63 8.33 0.144 9 0.111 5 0.17 F 值21.23 0.375 7 10.63 1.67 4.20 0 10.70 11.14 80.23 57.49 P 值0.000 3 0.559 3 0.013 9 0.237 7 0.079 7 1 0.013 7 0.012 5<0.000 1 0.000 1*******0.656 1 0.620 2
由表4 可知，通过响应面分析，获得了灵芝孢子粉抗氧化肽酶解工艺参数的预测模型。响应面回归模型极显著（P<0.01），该模型的相关系数R2=0.964 7，表明响应面96.47% 的变化与所选因素相关。校正决定系数R2Adj=0.919 2，表明模型的预测值与实际响应值的拟合程度为91.92%。另外，失拟项P 值为0.620 2，大于0.05 的临界值，表明模型失拟项不显著。信噪比为14.739，远高于临界值4，这表明模型与实际数据之间的拟合度较高。由F 值的大小得到各因素对灵芝孢子粉抗氧化肽的影响大小顺序为B（酶解时间）>C（酶解温度）>A（酶添加量）。该模型的拟合程度和可信度较高，建立的模型能够预测碱性蛋白酶酶解灵芝孢子粉抗氧化肽的最佳工艺条件，通过试验数据进行模型拟合，得到了二次多项式回归方程：Y = 98.56 - 0.082 5A +0.438 8B - 0.173 8C - 0.39AB + 0.622 5BC - 0.619 3A²-1.66B² - 1.41C²。
响应面分析各因素间的交互作用对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率的影响，得到三维响应面图及对应等高线图如图7 所示。
图7 各试验因素交互作用的响应面和等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors
由图7 可知，AB、AC、BC 的等高线均呈现椭圆形，表明两因素之间具有较强的交互作用。AB、BC 的响应曲面坡度较大，等高线较密集，表明酶解时间与酶添加量、酶解时间与酶解温度的交互作用对灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率的影响较大。
根据回归方程分析及预测确定最佳酶解工艺条件为酶添加量2 000 U/g、反应温度50 ℃、酶解pH8、底物浓度0.50%、反应时间3 h，此工艺条件下得到的灵芝孢子粉抗氧化肽DPPH 自由基清除率的预测值为98.59%。
2.3.2 最佳工艺的确定及验证试验
根据模型结果验证酶解条件为酶添加量2 000 U/g、反应温度50 ℃、酶解pH8、底物浓度0.50%、反应时间3 h，此条件下得出的灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率平均值为98.40%，相对误差为0.19%，说明模型对试验结果的分析预测准确。
2.4 灵芝孢子粉抗氧化肽抗氧化活性的稳定性研究
2.4.1 温度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性稳定性的影响
灵芝孢子粉抗氧化肽在不同温度下保藏并测其DPPH 自由基清除率，结果见图8。
图8 温度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性的影响
Fig.8 Effect of temperature on antioxidant peptide activity of Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图8 可知，灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率随着温度的变化在90.90%～97.36% 波动。温度为60 ℃时，灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率显著优于20 ℃和80 ℃时（P<0.05），这说明过高或过低的温度均使灵芝孢子粉抗氧化肽的活性降低，其在60 ℃下保藏最佳。
2.4.2 pH 值对灵芝孢子粉抗氧化肽活性稳定性的影响
pH 值是影响蛋白质的空间结构和活性的重要因素，肽的电子转移能力和电离势是影响肽的抗氧化活性的主要途径[28]。pH 值对灵芝孢子粉抗氧化肽稳定性的影响结果见图9。
图9 pH 值对灵芝孢子粉抗氧化肽活性的影响
Fig.9 Effect of pH on antioxidant peptide activity of Ganoderma lucidum spore powder
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图9 可知，随着pH 值从4 逐步增加到10 的过程中，灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率逐渐降低，pH 值对灵芝孢子粉抗氧化肽的抗氧化活性影响较明显。这一现象可能归因于碱性环境下，抗氧化肽更容易发生水解反应和外消旋反应，从而导致其抗氧化活性减弱。在加工与贮藏过程中，为保持灵芝孢子粉抗氧化肽具有较好的抗氧化活性，应避免与强碱性物质长时间接触，宜在弱酸性和中性环境中加工和保藏。
2.4.3 不同金属离子及其浓度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性的影响
抗氧化物对金属离子敏感，在金属离子的作用下蛋白质可能会发生构象的转变，影响抗氧化肽的活性及其稳定性，在不同金属离子的刺激下蛋白酶解产物会有不同的特性[29-30]。金属离子及其浓度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性的影响见图10。
图10 不同金属离子及其浓度对灵芝孢子粉抗氧化肽活性的影响
Fig.10 Effects of different metal ions and their concentrations on antioxidant peptide activity of Ganoderma lucidum spore powder
同一指标不同小写字母表示组间差异显著，P<0.05。
由图10 可知，当环境中的Ca2+、K+、Mg2+金属离子浓度在100～250 µg/mL 范围内时，灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率随着浓度的上升呈现持续下降趋势，表明Ca2+、K+和Mg2+对灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除活性均有抑制作用，其中K+的抑制作用最强。这可能是由于金属离子干扰了小分子肽中电子及原子的迁移，改变了抗氧化肽的活性位点，减弱其抗氧化能力[31]。与Ca2+和K+环境相比，Mg2+环境下灵芝孢子粉抗氧化肽活性更加稳定。
3 结论
采用碱性蛋白酶酶解灵芝孢子粉抗氧化肽，并对酶解工艺进行优化。以DPPH 自由基清除率和水解度为指标，通过单因素及响应面试验优化酶解工艺，优化结果为酶添加量2 000 U/g、反应温度50 ℃、酶解pH8、底物浓度0.50%、反应时间3 h，在此条件下灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率达98.40%。保藏稳定性试验结果表明，在保藏温度60 ℃和中性、弱酸性环境下，灵芝孢子粉抗氧化肽能保持较好的抗氧化活性。与Ca2+、K+环境相比，灵芝孢子粉抗氧化肽的DPPH 自由基清除率在Mg2+环境中更稳定。综上，本研究为灵芝孢子粉抗氧化肽的深加工研究和工业化生产奠定理论基础。
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