荞麦是小宗杂粮的一种，隶属于蓼科，荞麦属，种植广泛。荞麦蛋白质是荞麦的主要组成（14.3%），荞麦蛋白质具有降血压、降血脂、抗氧化等生理功能[1]。研究发现，荞麦蛋白质主要由清蛋白和球蛋白组成，并含有少量的醇溶蛋白和谷蛋白，其主要含有中低分子量蛋白[2]，缺乏高分子量蛋白。由于荞麦蛋白质组成和结构的特殊性，导致其存在溶解性差、乳化稳定性差、网络结构不稳定等缺陷，难以满足现代产业研发需要。蛋白质的理化特性与其结构密切相关，对天然荞麦蛋白质进行适当改性可以对蛋白质构象产生影响，使其乳化活性、表面疏水性、持水性在原有基础上得到提高[3]。
物理改性处理是工业中一种绿色、高效的蛋白质改性方式。挤压是一种优良的物理改性方法，在高温、高压、高剪切力的协同作用下，蛋白质的二、三级结构发生变化[4]。Gao 等[5]研究发现大米蛋白在挤压过程中其天然有序结构被破坏，蛋白质分子发生了不同程度的降解和聚合。其他研究也表明挤压过程中蛋白质的加热可能改变蛋白质表面亲水性和疏水性氨基酸的分布，与蛋白质共价键结合的多糖链形成厚的保护层，在油-水界面上具有空间稳定性，从而共同影响其乳化特性[6]。微波通常作为一种蛋白质修饰方法，通过改变蛋白质内部结构来改善蛋白质的功能特性。与传统传导加热相比，微波处理诱导蛋白质聚集对蛋白质结构、理化性质和功能特性产生显著影响[7]，Kheto 等[8]研究发现微波加热引起的热效应可以破坏藜麦蛋白质特定类型的氢键、范德华力，导致一些蛋白质由有序结构转变为无序结构，形成新的亲水位点。然而目前尚不清楚挤压和微波改性能否影响荞麦蛋白质的结构和理化性质，需从结构方面探究荞麦蛋白质理化性质和乳化性质的变化关系。因此，本试验采用挤压、微波改性方式对荞麦蛋白质结构进行修饰，改善其理化特性和乳化性质，以期为荞麦蛋白质的乳液方面产品的开发应用提供参考，拓宽荞麦蛋白质的应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荞麦粉（大三棱）：山西东方亮生命科技股份有限公司；大豆色拉油：益海嘉里金龙鱼食品集团股份有限公司；氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘氨酸、三氯乙酸、5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）：国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]（分析纯）：上海爱纯生物科技有限公司；8-苯胺-1-奈磺酸（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FUMACH MCGS 双螺杆挤压机：湖南富马科工程技术有限公司；DHG-9245A 型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；QL-901 旋涡混合仪：江苏海门麒麟医用仪器厂；NJL07-3 型实验专用微波炉：南京杰全微波设备有限公司；S-3000N 扫描电子显微镜：日本Hitachi 公司；J-1500 圆二色谱仪：日本Jasco 公司；Vario ELCube 元素分析仪：德国Elementar 公司；Frontier 傅里叶变换红外光谱仪：德国Bruker 公司；F-4600荧光分光光度计：日本日立公司；Ohaus FC5916R 高速冷冻离心机：美国BioTek 公司。
1.3 方法
1.3.1 改性荞麦粉的制备
1.3.1.1 挤压改性荞麦粉
挤压改性荞麦粉温度100 ℃、水添加量30%、螺杆转速100 r/min、固体喂料量6 kg/h，电热鼓风干燥箱干燥（24 h，45 ℃）、粉碎（过80 目筛），密封备用。
1.3.1.2 微波改性荞麦粉
将荞麦粉平铺在玻璃培养皿中，放入微波炉进行微波改性处理，微波工艺参数为功率420 W、时间40 s，层厚8 mm，密封备用。
1.3.2 天然/改性荞麦蛋白质的提取及纯化
1.3.2.1 提取
将荞麦粉、挤压荞麦粉、微波荞麦粉分别按料液比1∶10 （g/mL）加入蒸馏水中，常温下磁力搅拌（200 r/min，1.5 h），用1.0 mol/L NaOH 溶液调节体系pH7.0，离心（6 000×g，15 min），取上清液，1.0 mol/L HCl 溶液调pH4.6，离心（6 000×g，15 min），取沉淀，水洗两次，冷冻干燥，粉碎（过80 目筛），制得荞麦粗蛋白质、挤压荞麦粗蛋白质、微波荞麦粗蛋白质。
1.3.2.2 纯化
取0.01 mol/L 、pH7.4 磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS）溶液溶解荞麦粗蛋白质，透析24 h，冻干、粉碎（过80 目筛），制得较高纯度天然荞麦蛋白质（buckwheat protein，BWP）（纯度为92.0%，干基）、挤压荞麦蛋白质（extrusion buckwheat protein，EBWP）（纯度为90.0%，干基）、微波荞麦蛋白质（microwave buckwheat protein，MBWP）（纯度为89.0%，干基）。
1.3.3 天然/改性荞麦蛋白质结构表征
1.3.3.1 天然/改性荞麦蛋白质二级结构测定
1）傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）测定
研磨2.0 mg 荞麦蛋白质样品制成薄片，进行红外光谱扫描。扫描32 次（4 000～400 cm-1），进行结果分析。
2）圆二色谱测定
采用圆二色谱测定荞麦蛋白质的二级结构含量。制备0.1 mg/mL 荞麦蛋白质溶液样品，25 ℃条件下，采用圆二色谱仪在190～260 nm 处测定荞麦蛋白质溶液样品的圆二色谱，以0.01 mol/L 的PBS 溶液（pH7.4）作空白。扫描速率为100 nm/min，数据间隔0.5 nm，带宽2.0 nm。
1.3.3.2 天然/改性荞麦蛋白质三级结构测定
通过荧光分光光度计法测定改性前后荞麦蛋白质的内源荧光值。配制0.05 mg/mL 荞麦蛋白质溶液（0.01 mol/L PBS 溶液，pH7.4）测定。设置激发波长290 nm，发射波长 300～460 nm，狭缝宽度5.0 nm，电压700 mV。
1.3.3.3 天然/改性荞麦蛋白质的微观结构
将适量EBWP、MBWP 粉末固定在导电胶上，样品表面喷金处理，采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）在不同倍数、15 kV 电压下观察EBWP、MBWP 的微观结构。
1.3.4 天然/改性荞麦蛋白质理化性质测定
1.3.4.1 表面疏水性测定
采用8-苯胺基萘-1-磺酸盐（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）探针法测定荞麦蛋白质的表面疏水性[9]。制备荞麦蛋白质样品溶液浓度为0.01～0.50 mg/mL。加入8 mmol/L ANS 溶液20 µL，混匀。避光反应5 min，测量溶液的荧光强度。激发波长390 nm，发射波长470 nm，狭缝宽度5 nm。以荧光强度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，初始阶段斜率即为样品的表面疏水性（H0）。
1.3.4.2 天然/改性荞麦蛋白质巯基含量和二硫键含量测定
参照王思念[10]的方法对蛋白质样品进行巯基含量和二硫键含量测定。
游离巯基含量：将0.02 mL（4 mg/mL）5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]和2.5 mL 8 mol/L 尿素溶液[以Tris-甘氨酸（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸）配制]加入到0.5 mL、10.0 mg/mL 待测样品中，反应 25 min，412 nm 波长下测定吸光度（A412），空白试验以PBS（0.01 mol/L，pH7.4）溶液代替样品测定。游离巯基含量（S1，µmol/g）计算公式如下。
式中：D1为稀释系数，6.04；C 为蛋白质浓度，mg/mL。
总巯基含量：将0.02 mL β-巯基乙醇和1.0 mL、10 mol/L 尿 素 溶 液[以 Tris-Gly（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly）配制]加入到0.2 mL、10 mg/mL 待测蛋白质样品中，混匀，25 ℃，反应1 h，取10 mL 12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）加入样品中，25 ℃反应1 h，5 000×g 离心10 min，洗涤沉淀两次（12% TCA 溶液），用3.0 mL、8 mol/L 尿素溶液[以Tris-Gly（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly）配制]溶解洗涤所得沉淀物，添加0.04 mL DTNB，25 ℃，反应25 min，412 nm 波长下测其吸光度。空白试验均用PBS 溶液（0.01 mol/L，pH7.4），平行测定3 次。结果按以下公式计算。
式中：S2 为总巯基含量，µmol/g；S3 为二硫键含量，µmol/g；D2 为稀释系数，15；C 为蛋白质浓度，mg/mL。
1.3.4.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
配制5% 体积分数浓缩胶、12% 体积分数分离胶。取5 mg/mL 蛋白样品溶液40 µL 于2 mL 离心管中，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（5×）10 µL，煮沸5 min，6 000×g 离心1 min，上样，进行电泳，电压恒定为 100 V。取出凝胶，考马斯亮蓝染液染色30 min，甲醇-冰醋酸溶液脱色，凝胶成像。
1.3.5 天然/改性荞麦蛋白质功能特性研究
1.3.5.1 溶解度测定
取10.0 mg 蛋白质样品溶于0.01 mol/L PBS 溶液（pH7.4）中制成1 mL 分散液，充分混匀，6 000×g 离心5 min。通过Brandford 法测定所得上清液的蛋白质含量，样品中总蛋白含量通过元素分析仪测得。溶解度（R，%）计算公式如下。
式中：A 为上清液蛋白含量，mg/mL；B 为样品总蛋白含量，mg/mL。
1.3.5.2 持水、持油性测定
持水性测定：参照张川等[11]的方法并稍作修改，分别称取0.1 g 蛋白质样品倒入2 支10 mL 离心管中，加入3 mL 蒸馏水，混合均匀，于室温下放置24 h，5 000×g离心10 min，取沉淀并称重。持水性（C，%）计算公式如下。
式中：m1 为离心后残留物的质量，g；m2 为样品干质量，g。
持油性测定：称取0.1 g 蛋白质样品倒入10 mL 离心管中，记录此时离心管质量为m3（g），再向离心管中加入3.0 mL 大豆油，混合均匀，于室温下放置24 h，5 000×g 离心10 min，除去表层未吸附样品的大豆油，记录离心管质量m4（g）。持油性（O，%）计算公式如下。
1.3.5.3 乳化性及乳化稳定性测定
参照Ren 等[12]方法并略作改动，称取蛋白质样品200.0 mg，用0.01 mol/L PBS 溶液（pH7.4）配制0.2%浓度的蛋白质样品溶液。将天然/改性荞麦蛋白质溶液与大豆油按照体积比3∶1 混合，12 000 r/min 分散处理1 min。快速吸取乳液100 µL，加入0.1% SDS 溶液10 mL，分散均匀。测定0 min 和10 min 的吸光度A412。乳化活性（E1，m2/g）和乳化稳定性（E2，min）计算公式如下。
式中：N 为稀释倍数，100；2.303 为换算系数；L 为比色池光径，1 cm；J 为油相体积分数，25%；ρ 为乳化液形成前蛋白质的质量浓度，g/L；A0、A10 分别为乳状液在0、10 min 的吸光度。
1.4 数据处理
3 次平行试验，数据采用SPSS 22.0 软件进行显著性分析 （p<0.05），文中图谱采用Origin 2018 软件绘制。
2 结果与分析
2.1 天然/改性荞麦蛋白质结构表征结果
2.1.1 改性处理对荞麦蛋白质二级结构变化的影响
2.1.1.1 天然/改性荞麦蛋白质傅里叶变换红外光谱
FT-IR 是测定蛋白质化学键振动状态的方法，可以用来确定蛋白质的二级结构。1 700～1 600 cm-1 波段是常用的酰胺I 区，酰胺Ⅰ区特征频率取决于C O和H—N 间的氢键性质。天然/改性荞麦蛋白质傅里叶变换红外光谱如图1 所示。
图1 天然/改性荞麦蛋白质红外光谱图
Fig.1 Infrared spectrogram of natural/modified buckwheat protein
由图1 可知，EBWP 和MBWP 在1 680～1 640 cm-1波数特征吸收峰发生蓝移，可能是挤压和微波改性处理破坏了蛋白质分子内的氢键，导致吸收峰向更高的波数移动[13]。1 390 cm-1 波数附近出现明显吸收峰，说明产生C—H 弯曲振动，C—O、C—X（卤素）等伸缩振动，和C—C 单键骨架振动等，1 500 cm-1 波数附近，主要包括
等的伸缩振动以及苯环的骨架振动，3 300 cm-1 波数附近代表碳上的C—H 的伸缩振动[14]。Chen 等[15]研究也发现同样现象。综上，挤压过程中产生的美拉德反应，使酰胺I 区和酰胺II 区的特征峰移位。图1 中未出现新的吸收峰，表明挤压和微波改性处理没有使荞麦蛋白质产生新的基团。
2.1.1.2 天然/改性荞麦蛋白质圆二色谱
天然/改性荞麦蛋白质圆二色谱如图2 所示。
图2 天然/改性荞麦蛋白质圆二色谱图
Fig.2 Circular dichroism of natural/modified buckwheat protein
肽键是蛋白质二级结构中，主要的光活性基团，其吸收峰分布在圆二色谱的远紫外区段（190～250 nm）。190～250 nm 这一区段可以反映蛋白质主链的构象信息，常用来作为蛋白质二级结构变化的指标[16]。α-螺旋吸收峰在192 nm 附近有正吸收峰，208 nm 和222 nm 有负吸收峰。β-折叠在217～218 nm 附近有负吸收峰，195 nm附近有正吸收峰。β-转角在180～190 nm、220～230 nm附近有负吸收峰，205 nm 附近有正吸收峰。无规则卷曲在198 nm 附近有一负吸收峰，在220 nm 附近有一正吸收峰[17]。韩宇鹏等 [18]研究发现α-螺旋含量的降低和无规则卷曲含量的增加都会使200～220 nm 处峰强度增加，这些变化反映出蛋白质的结构由有序转化为无序结构。图2 中MBWP 在220 nm 处的峰变化强度最大且向负波长移动，综上，微波改性使荞麦蛋白质的无规则卷曲含量显著增加，蛋白质发生变性，结构变得松散。
2.1.2 改性处理对荞麦蛋白质二级结构含量变化的影响
天然/改性荞麦蛋白质二级结构组成及含量如表1所示。
表1 天然/改性荞麦蛋白质二级结构组成及含量
Table 1 Composition and content of secondary structure of natural/modified buckwheat protein
注：同列不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
样品名称BWP EBWP MBWP α-螺旋含量/%13.800±0.010c 15.500±0.020b 15.900±0.015a β-转角含量/%22.500±0.012b 22.800±0.008a 19.500±0.011c β-折叠含量/%33.800±0.009a 30.400±0.014b 29.400±0.013c无规则卷曲含量/%29.900±0.010c 31.300±0.008b 35.200±0.007a
蛋白质的二级结构主要由非共价相互作用维持，并在一定程度上由二硫键的共价作用维持[19]。α-螺旋、β-折叠是相对稳定的有序蛋白质结构，β-转角和无规则卷曲是无序结构。由表1 可知，挤压改性处理能显著增加荞麦蛋白质α-螺旋组成（p<0.05），增幅为1.7%，可判断出挤压有助于蛋白质结构的稳定。α-螺旋和β-折叠的含量依赖于多肽链之间的氢键变化，挤压改性处理破坏了蛋白质-蛋白质分子之间的相互作用，促进了蛋白质内部氢键的降解并形成新的亲水位点。MBWP 的无规则卷曲结构含量增加，增幅为5.3%。蛋白质的二级结构主要通过氢键和静电相互作用稳定，微波改性可以破坏以上结构[20]。综上，微波改性后荞麦蛋白质的二级结构由有序转变为无序状态。
2.1.3 改性处理对荞麦蛋白质三级结构变化的影响
天然/改性荞麦蛋白质的荧光光谱如图3 所示。
图3 天然/改性荞麦蛋白质的荧光光谱图
Fig.3 Fluorescence spectra of natural/modified buckwheat protein
疏水性氨基酸残基，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，当其暴露于蛋白质的表面时，可以发出荧光，该指标可以描述蛋白质的三级结构变化。由图3 可知，挤压和微波改性处理后蛋白质的吸收峰出现红移，荧光强度增加，EBWP 的最大荧光强度为9 435，MBWP 的最大荧光强度为9 660。Tian 等[21]研究发现，挤压过程中，高热能和机械损伤导致蛋白质变性，破坏蛋白质分子之间的氢键和疏水键，色氨酸残基向疏水性更强的环境移动。也有可能是挤压和微波改性处理使荞麦蛋白质的结构展开，非极性氨基酸暴露在外侧[22]。综上，改性处理可以使荞麦蛋白三级结构发生变化。
2.1.4 SEM 观察结果
SEM 是观察改性蛋白质微观结构变化的有效手段。天然/改性荞麦蛋白质扫描电子显微镜图如图4 所示。
图4 天然/改性荞麦蛋白质扫描电子显微镜图
Fig.4 Scanning electron microscopy of natural/modified buckwheat protein
a、b、c 依次为BWP、EBWP、MBWP（×200）；d、e、f 依次为BWP、EBWP、MBWP（×5 000）。
由图4 可知，经冷冻干燥后的BWP 呈碎片状态，蛋白质表皮有分层和褶皱，这与文献[23]报道的经冷冻干燥后的植物蛋白质微观结构相似，EBWP 与BWP 相比，蛋白质微观结构更加碎小无规则，在高倍镜下观察挤压后蛋白质表面出现孔洞结构。微波导致蛋白质发生强烈的热变性，片状结构被破坏，部分蛋白质形成球状结构，结构松散，边缘不清晰，说明BWP 在微波改性过程中发生不同程度的降解和聚合，其自然有序结构被打破，蛋白质结构发生变化[24]。MBWP 的蛋白质结构变得更加无序，这一现象与蛋白质二级结构的变化结果一致。
2.2 天然/改性荞麦蛋白质理化性质指标变化
2.2.1 改性处理对荞麦蛋白质表面疏水性变化的影响
天然/改性荞麦蛋白质的表面疏水性如图5 所示。
图5 天然/改性荞麦蛋白质表面疏水性
Fig.5 Surface hydrophobicity of natural/modified buckwheat protein
不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
表面疏水性与蛋白质表面的极性和非极性基团数量相关，可以反映蛋白质分子三级结构的变化，与蛋白质的乳化稳定性和溶解度密切相关。由图5 可知，EBWP、MBWP 的表面疏水性显著提高（p<0.05），说明改性处理对荞麦蛋白质的表面疏水性起促进作用，并且微波改性效果最好，为3 563.1。EBWP 的表面疏水性增加，可能是因为BWP 聚集体被破坏，蛋白质分子结构展开，埋藏在蛋白质分子内部的疏水氨基酸残基大量暴露，这一现象与前面的荞麦蛋白质三级结构变化结果一致[22]。微波处理后，蛋白质的表面疏水性增加191%，适当的低强度热效应促进了蛋白质结构的松弛，暴露出原本隐藏的疏水基团，从而增加了荞麦蛋白质的表面疏水性，蛋白质的乳化性能提高[25]。
2.2.2 改性处理对荞麦蛋白质巯基含量变化的影响
天然、改性荞麦蛋白质的巯基含量、二硫键含量如图6 所示。
图6 天然/改性荞麦蛋白质的巯基含量、二硫键含量
Fig.6 Sulfhydryl group content and disulfide bond content of natural/modified buckwheat protein
同一指标不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
荞麦蛋白质的功能和构象与二硫键和游离巯基密切相关。游离巯基和二硫键之间的相互转化，对蛋白质的聚集起着至关重要的作用。由图6 可知，挤压后蛋白质的游离巯基含量增加，二硫键含量减少。可能是挤压过程中，随着温度的升高，蛋白质的二硫键断裂，蛋白质发生降解，游离巯基暴露[26]。微波处理后巯基含量增加可能是由于蛋白质的极性基团能强烈吸收微波能量，增加了部分分子碰撞的机会，并且在微波辐射下产生的自由基会破坏分子间的二硫键，蛋白质分子间的共价键断裂，导致巯基含量的增加[27]。
2.2.3 天然、改性荞麦蛋白质的亚基变化
天然、改性荞麦蛋白质的SDS-PAGE 结果如图7所示。
图7 天然、改性荞麦蛋白质的SDS-PAGE
Fig.7 SDS-PAGE of natural/modified buckwheat proteins
M.标准分子质量蛋白；1.BWP；2.EBWP；3.MBWP。
由图7 可知，荞麦蛋白质条带主要分布于17～40 kDa，说明荞麦蛋白质主要由清蛋白（2S）和球蛋白（8S、13S）组成，EBWP 的蛋白质条带在高分子质量区域逐渐消失，说明挤压处理会影响荞麦蛋白亚基组成[28]。其亚基分布主要集中于低分子质量区域，可能是由于挤压处理诱导蛋白质降解，肽链断裂，形成低分子荞麦蛋白质[29]。也有研究表示，挤压处理会引起蛋白质分子间的共价交联，具有强共价键的共轭物难以迁移到分离胶中[21]。MBWP 的蛋白质谱带和BWP 蛋白质谱带无明显变化，说明没有新的亚基产生，但在23 kDa 处的谱带更加清晰，可能是因为蛋白质在还原状态下的解离[30]。
2.3 天然/改性荞麦蛋白质功能特性研究结果
2.3.1 改性处理对荞麦蛋白质溶解性的影响
天然/改性荞麦蛋白质的溶解度如图8 所示。
图8 天然/改性荞麦蛋白质溶解度
Fig.8 Solubility of natural/modified buckwheat protein
不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
溶解度是蛋白质较关键的性质之一，与蛋白质的乳化性、起泡性和胶凝性密切相关。由图8 可知，与其他两组相比，EBWP 的溶解度显著增加（p<0.05）。溶解度的提高有助于改善蛋白质的功能特性。EBWP 的溶解度提高可能是由于EBWP 的分子链延长，暴露了肽键，从而促进水解[5]。MBWP 的溶解度降低，可能由于荞麦蛋白质表面疏水基团的暴露导致表面疏水性增加，这一结果现象与Mastani 等[31]的研究结果一致。也有可能是因为微波改性导致蛋白质发生聚集，从而降低蛋白质的溶解度[5]。
2.3.2 改性处理对荞麦蛋白质持水性、持油性的影响
天然/改性荞麦蛋白质持水性、持油性如图9所示。
图9 天然/改性荞麦蛋白质的持水性、持油性
Fig.9 Water and oil holding characteristics of natural/modified buckwheat protein
同一指标不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
良好的持水性、持油性可以赋予食品良好的口感。由图10 可知，与BWP 相比，EBWP、MBWP 的持水性、持油性显著增加，且微波改性处理效果更明显（p<0.05），MBWP 持水性为29.07%，持油性为36.47%。改性处理过程中，蛋白质分子致密的空间结构被破坏，导致多肽链分子量下降，极性基团数目增加，蛋白质结构更疏松，与水结合更好，蛋白质的持水性增加。挤压过程中高温使蛋白质变性、聚集，造成非极性氨基酸侧链暴露，促进疏水相互作用，从而使蛋白质的持油性增加[15]。MBWP 持油性高于EBWP，这可能是蛋白质经微波处理后变性所致，蛋白质疏水基团暴露在外侧，蛋白质与油脂的接触面积增大，从而MBWP 的持油性增加[32]。
2.3.3 改性处理对荞麦蛋白质乳化活性和乳化稳定性变化的影响
天然/改性荞麦蛋白质的乳化活性、乳化稳定性如图10 所示。
图10 天然/改性荞麦蛋白质的乳化活性、乳化稳定性
Fig.10 Emulsifying activity and stability of natural/modified buckwheat protein
同一指标不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
乳化活性和乳化稳定性分别表示蛋白质在油水界面的吸附能力和乳状液形成过程中维持两相稳定的能力。疏水性和溶解度是影响乳化活性的主要因素。由图10 可知，EBWP 的乳化活性增加了1.5%，乳化稳定性增加了22%，MBWP 的乳化活性增加了4.0%，乳化稳定性增加了170%。挤压过程中的高温和剪切作用可以改变荞麦蛋白质表面亲水和疏水基团的分布，使蛋白质发生解聚，二硫键被打开，荞麦蛋白质的疏水基团被暴露，从而改变EBWP 的界面特性，蛋白质的乳化活性增加[5]。微波处理会使荞麦蛋白质结构变得松散，蛋白质构象的变化增加比表面积，更有利于油水界面的吸附，界面处的蛋白质更容易在界面处形成粘弹性膜，使乳状液更稳定，这与Wang 等[33]的研究结果相一致。Mastani 等[31]研究发现微波对天然乳清蛋白的乳化活性有显著影响，这可能是因为微波电磁场的变化导致极性蛋白分子取向的转变，从而导致强烈的旋转，这种旋转可以破坏蛋白质的聚集并提高蛋白质的乳化性质。也有可能是MBWP 无规则卷曲结构含量高，拥有更灵活的结构，蛋白质更容易发生结构重排，从而在油/水界面快速吸附，导致更高的乳化活性[19]。微波改性处理能更好地改善荞麦蛋白质的乳化性能。
3 结论
以荞麦粉原料，采用碱提酸沉法提取荞麦蛋白，探究挤压、微波改性处理对荞麦蛋白结构和理化特性的影响。结果表明，挤压、微波改性处理能显著改变天然荞麦蛋白质的结构和理化性质（p<0.05）。与未改性荞麦蛋白质相比，EBWP、MBWP 的二级、三级结构发生改变，EBWP 的α-螺旋含量增加了1.7%，MBWP 的无规则卷曲含量增加了5.3%，MBWP 的荧光强度达到最大为9 660，MBWP 的表面疏水性增加了191%，乳化稳定性增加，溶解度降低。改性处理后的荞麦蛋白质致密的空间结构被破坏，多肽链分子量下降，蛋白质结构更加疏松，蛋白质的持水性、持油性增加，改性处理后的荞麦蛋白质颗粒更小，且微波改性后的效果更加显著。与挤压改性相比，微波能更好地诱导荞麦蛋白质的分子结构展开，暴露疏水残基并诱导构象变化。该结构修饰暴露了蛋白质表面的游离巯基基团和隐藏的疏水基团，从而提高了其乳化性质。
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