滇黄精（Polygonɑtum kingiɑnum Coll.et Hemsl）为百合科黄精属植物，广泛分布于云南、四川、贵州等地，富含黄精多糖、氨基酸、皂苷、生物碱、木质素和黄酮等活性成分，具有调节血糖、增强免疫力、抗疲劳和抗衰老等功效[1]，是我国极具区域特色的药食同源植物。目前有超过360 种以黄精为主要功能成分的功能性食品上市，其中包括140 种免疫调节产品、133 种抗疲劳产品和40 种辅助降糖产品等[2]。新鲜滇黄精生辛感对鼻腔有强烈刺激，极易引发过敏的应激反应[3]，因此滇黄精食用前通常需对其进行炮制处理。
九蒸九制法是至今用途最为广泛且消费者接受度最高的炮制手段[4]，历经多次循环蒸制-晾干-蒸制过程，黄精的色泽、香气等会明显改善[5]，味感由新鲜黄精刺激性转变为甘甜滋味。随着工业化发展，九蒸九制工艺不断改进。传统晾晒工艺难以保证样品的品质稳定性，因而现代加工多采用烘干的方式进行代替[4]。目前，国内外研究主要集中对九蒸九制炮制前后黄精功能活性成分的比较[5-6]，炮制处理对黄精风味品质的影响鲜有报道。炮制能够有效减轻药材的不良风味，如五灵脂和鸡内金等药用资源在炮制后腥臭味明显弱化且功效显著增强[7-8]。相关鲜黄精挥发性组分虽已有相关报道[9]，但针对黄精炮制前后造成呈香品质差异的关键靶点物质尚未明晰。为更好地了解炮制处理对黄精风味品质和抗氧化活性的影响，本研究利用随机森林筛选出与九蒸九制炮制工艺显著相关的关键挥发组分，对比黄精炮制前后抗氧化活性差异，并运用偏最小回归模型（partial least squares regression，PLSR）进一步揭示挥发性物质及抗氧化活性与九蒸九制炮制之间的关系，以期为我国滇黄精传统炮制工艺嫁接于现代加工体系的转型与升级奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
滇黄精：产自云南普洱市；正构烷烃（C7～C40）、1，2-二氯苯（纯度99%）、1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，纯度97%）：Sigma-Aldrich有限公司；2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]（纯度≥ 98%）：DIYBio 试剂公司；H2O2：天津市天力化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
气相色谱-质谱联用仪（7890B-5977）、DB-WAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）：美国安捷伦公司；手动固相微萃取进样器（DVB/CAR/PDMS）：Sigma-Aldrich 有限公司；全波长酶标仪（Multiskan Go）：默飞世尔科技有限公司；电子天平（PL202-L）：梅特勒-托利多（上海）有限公司；真空冷冻干燥机（LGJ-25C）：四环科仪科技发展（北京）有限公司；旋转蒸发仪（STRIKE-300）：优莱博技术（北京）有限公司；数显鼓风干燥箱（GZX-9146 MBE）：上海博迅实业有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄精样品的制备
鲜黄精样本的制备：挑选无病虫害和机械损伤的大小均一、成熟度一致的黄精为试验样本，流动水清洗后切片，得鲜滇黄精样本（PKraw）。
黄精样本的炮制：采用九蒸九制方法，参考杨敏敏[10]的方法略作改动。将洗净鲜黄精置于蒸锅中隔水蒸制6 h，取出放入55 ℃数显鼓风干燥箱中干燥12 h，即得“一蒸一制”黄精，如此重复操作9 次，即可获得“九蒸九制”的黄精样品（PK9-9），置于-40 ℃真空保存待测。不同蒸制工序黄精样本外观表征见图1。
图1 不同蒸制工序黄精样本外观表征
Fig.1 Appearance of Polygonati Rhizoma samples treated by steaming and basking for different times
1.3.2 描述性感官评价
采用描述性感官分析对九蒸九制炮制前后黄精样本风味品质进行评定，具体参照张帆[11]的方法。风味评定小组由8 名经验丰富的成员组成（4 男4 女，平均年龄约为25 岁）。在试验开始前，评价员分别对鲜黄精和九蒸九制黄精呈香轮廓进行描述，制定感官属性描述词，经汇总讨论后，最终确定脂香、焦香、青草香、草本味、甜香和泥土味6 个属性为黄精样品评估指标。具体评估过程：分别称取25.0 g 样品置于100 mL 具塞棕色三角瓶中，采用随机3 位编码标注后呈送给评价员，采用九点间隔法（0=无香气强度，1～9 代表样本呈香强度依次增强）于（25±2） ℃进行评价。为保证结果的准确性，每组样品平行测定3 次，且每两组试验间隙设立休息时间以防止嗅闻疲劳，最终结果以平均值表示。
1.3.3 挥发性成分测定
顶空固相微萃取（head-space solid-phase microextraction，HS-SPME）提取：称取5 g 新鲜和九蒸九制滇黄精样品，加入1 µL 1，2-二氯苯（内标物，密度为1.306 mg/µL），置于20 mL 顶空瓶中，立即用封口膜密封。随后，将顶空瓶固定在40 ℃恒温水浴锅中，平衡20 min。平衡结束后，利用50/30 µm DVB/CAR/PDMS SPME 萃取头富集30 min。富集结束后，立即将其转移到气相色谱进样口进行热解吸（250 ℃，7 min）。
气相色谱质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）分析：色谱毛细管柱为DB-WAX，99.999%纯度的氦气作为载气（流速1.5 mL/min）。升温模式具体条件：起始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，保持10 min，再以5 ℃/min 升至230 ℃，保持5 min。MS 条件：采用电子电离模式，电子电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，传输温度280 ℃，质量扫描范围（m/z）30～450，延迟2.5 min。
挥发性物质定性定量分析：将GC 分离出的化合物利用计算机检索与NIST14 标准谱库进行初步判定，以匹配度大于80%作为物质鉴定标准，并结合挥发物质相对保留指数（reservation index，RI）和标准物质进行定性验证解析，各挥发组分RI 值（R）的计算见式（1）；定量参照文献[12]内标法（内标物为1.306 µg/µL 1，2-二氯苯），计算公式见式（2）。
式中：n 为碳原子数为n 的正构烷烃；Tn 为碳原子数为n 的正构烷烃的保留时间，min；Tx 为待测物质x的保留时间，min。
式中：Ci 为待测组分i 的相对含量，µg/kg；ms 为内标物质含量，µg；mo 为待测样品含量，kg；Ai 和As 分别为待测组分和内标物质峰面积；fi 为待测组分i 对内标物的相对质量校正因子，1。
1.3.4 抗氧化活性测定
1.3.4.1 滇黄精水提物制备
参考Yang 等[13]的方法制备滇黄精水提物。将滇黄精样品分别称500 g 置于烧杯中，加入7 倍质量的纯水，浸泡30 min 后水浴加热1 h，过滤后收集滤液。在滤渣中加入7 倍质量的纯水进行二次水浴加热，1 h后过滤并收集滤液。将两次滤液合并，得到滇黄精样品水提液。对水提液浓缩及冷冻干燥。精确称取水提物冻干粉的质量，用以下公式计算得率（X，%）。
式中：m 为滇黄精水提物冻干粉的质量，g；M 为最初称取的药材质量，g。
1.3.4.2 DPPH 自由基清除能力测定
参考文献[14]方法并略作调整，取0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00 mg/mL 两样品溶液各1 mL，加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH 工作液，混匀后避光反应30 min，于517 nm 处测定吸光度。根据公式（4）计算DPPH 自由基清除率（Y，%），并计算EC50 值。
式中：A 试验组为1 mL 样品+2 mL DPPH 自由基溶液的吸光度；A 对照组为1 mL 样品+2 mL 无水乙醇的吸光度；A 标准组为1 mL 去离子水+2 mL DPPH 自由基溶液的吸光度。
1.3.4.3 ABTS+自由基清除能力测定
参考文献[10]的方法并略作调整。将等体积的7.4 mmol/L ABTS 溶液和2.6 mmol/L 过硫酸钾溶液混合均匀避光反应12 h 后得ABTS+工作液，取200 µL 样品加入800 µL ABTS+工作液，混匀后避光反应6 min，立刻于734 nm 处测定吸光度。根据公式（5）计算ABTS+自由基清除率（Z，%），并计算EC50 值。
式中：A 试验组为200 µL 样品+800 µL ABTS+工作液的吸光度；A 对照组为200 µL 样品+800 µL 无水乙醇的吸光度；A 标准组为 200 µL 去离子水+800 µL ABTS+工作液的吸光度。
1.4 数据处理
所有试验均进行3 次重复，数据统计分析采用软件SPSS 25.0，描述性感官评价雷达图，自由基清除率折线图采用Origin 2018 绘制，热图采用TBtools 进行绘制，随机森林分析采用联川生物云平台 OmicStudio tools 进行绘制。
2 结果与分析
2.1 九蒸九制滇黄精挥发性物质GC-MS 分析
九蒸九制炮制前后黄精挥发性物质组分解析见表1。
表1 九蒸九制炮制前后黄精挥发性物质组分解析
Table 1 Volatile compounds in Polygonati Rhizoma samples before and after nine-steam-nine-bask treatment
序号醛类A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15醇类B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15酮类C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10名称RIc RIr CAS 号含量/（µg/kg）PKraw PK9-9显著性戊醛己醛庚醛（E，E）-2，4-壬二烯醛辛醛（E）-2-庚烯醛壬醛（E）-2-辛烯醛糠醛癸醛苯甲醛5-甲基糠醛苯乙醛2，4-二甲基苯甲醛5-羟甲基糠醛813 1 034 1 157 1 194 1 265 1 309 1 376 1 418 1 459 1 485 1 510 1 567 1 629 1 788 2 488 953 1 048 1 163 1 681 1 279 1 306 1 391 1 412 1 469 1 486 1 502 1 570 1 638 1 742 2 485 110-62-3 66-25-1 111-71-7 5910-87-2 124-13-0 18829-55-5 124-19-6 2548-87-0 98-01-1 112-31-2 100-52-7 620-02-0 122-78-1 15764-16-6 67-47-0 39.37±1.58 166.18±28.80-- - -* * **45.75±6.23 73.42±9.93 70.37±5.37- -859.31±46.21 45.76±7.27 50.73±8.07 5.76±0.76 151.77±36.65-332.15±5.70-82.39±3.21 73.15±1.99 28.77±2.76 20.30±1.88 66.90±9.06 16.60±1.14 53.30±2.68************** * *3，5-壬二烯-2-醇己醇2-壬烯-1-醇庚醇2-乙基己醇芳樟醇辛醇2，3-丁二醇（E）-2-辛烯醇糠醇壬醇5-甲基-2-呋喃甲醇苯甲醇叔十六硫醇法呢醇1 242 1 359 1 450 1 463 1 493 1 552 1 562 1 582 1 615 1 658 1 662 1 720 1 874 2 094 2 276 ND 1 360 1 692 1 453 1 492 1 547 1 558 1 573 1 620 1 659 1 661 1 729 1 878 ND 2 237 1000193-00-8 111-27-3 22104-79-6 111-70-6 104-76-7 78-70-6 111-87-5 24347-58-8 18409-17-1 98-00-0 143-08-8 3857-25-8 100-51-6 25360-09-2 4602-84-0- - - - -265.69±2.97 20.08±0.90 30.30±1.32 273.83±21.21 10.34±0.96 25.45±3.83 64.61±2.51 22.72±1.04-81.35±7.35-137.63±3.08 133.88±0.96-9.99±0.90-19.76±0.35-20.21±2.94-36.57±6.47* * * ********- -***55.48±6.28-19.24±1.33- -* * * **9.75±1.24****3-甲基-2-丁酮2-庚酮3-羟基-2-丁酮4-环戊烯-1，3-二酮3-己烯-2-酮2（5H）-呋喃酮甲基环戊烯醇酮香叶基丙酮呋喃酮2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮748 1 160 1 276 1 576 1 664 1 735 1 822 1 851 1 851 2 255 918 1 173 1 277 1 573 1 209 1 716 1 829 1 864 1 995 2 240 563-80-4 110-43-0 513-86-0 930-60-9 763-93-9 497-23-4 80-71-7 689-67-8 3658-77-3 28564-83-2 37.74±3.70 115.77±12.70 524.02±2.99- - -- - - - - - -38.52±2.86 13.64±1.69 5.20±0.51 6.57±0.35 22.63±3.17 22.55±3.25 80.32±13.06*******************
续表1 九蒸九制炮制前后黄精挥发性物质组分解析
Continue table 1 Volatile compounds in Polygonati Rhizoma samples before and after nine-steam-nine-bask treatment
注：ND、- 表示未检出。*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。
序号酯类D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8其他类E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7名称RIc RIr CAS 号含量/（µg/kg）PKraw PK9-9显著性己酸乙酯当归内酯苯甲酸甲酯（E）-2-苯甲酸己烯酯肉豆蔻酸异丙酯棕榈酸甲酯棕榈酸异丙酯癸二酸-2-丁烯基丙酯1 230 1 424 1 610 1 638 2 040 2 214 2 241 2 286 2 160 1 429 1 611 2 104 2 041 2 206 2 232 ND 6290-37-5 591-12-8 93-58-3 76841-70-8 110-27-0 112-39-0 142-91-6 1000356-10-9 44.84±8.73-44.51±2.78 19.77±1.51 79.45±6.58 17.88±1.54 34.23±1.20 58.57±6.59-73.68±2.96*******2-戊基呋喃间氯甲苯3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯2-乙酰基呋喃苯甲腈2-乙酰吡咯麝香草酚1 194 1 285 1 401 1 498 1 595 1 961 2 182 1 200 1 313 ND 1 501 1 614 1 969 2 178 3777-69-3 108-41-8 61142-36-7 1192-62-7 100-47-0 1072-83-9 89-83-8 105.75±2.94-104.12±11.29-19.07±0.88-61.57±1.72- - - - - - -45.03±4.74-21.35±2.41-53.95±4.86 5.18±1.59*** ************
如表1 所示，共检出55 种物质，包括15 种醛类、15 种醇类、10 种酮类、8 种酯类和7 种其他类化合物。新鲜黄精和九蒸九制炮制后黄精样品的共有挥发性成分共7 种，分别为己醛、壬醛、2-壬烯-1-醇、2-乙基己醇、苯甲醛、辛醇、麝香草酚。
醛类是表征滇黄精特征香气的关键挥发性物质，鲜黄精中测出6 种醛类，经九蒸九制处理后，醛类物质种类明显增加，共测得12 种物质。已报道己醛、苯甲醛和壬醛是多种不同产地多花黄精样品中含量较高的醛类物质[9]，由表1 可知，上述物质相对含量在滇黄精鲜品中也具有一致性，经炮制处理己醛和苯甲醛含量显著下降（P<0.05，P<0.01），而壬醛含量极显著上升（P<0.01）。其中，己醛和苯甲醛被认为是黄精刺激性气味的来源之一[15]，而壬醛贡献甜香气味。在新生成的醛类物质中，辛醛是占比最多的物质，呈现甜香的味道，且因其阈值较低（0.032 µg/kg）[16]，使得滇黄精甜香味更加突出。新生成的5-羟甲基糠醛是典型的美拉德反应和焦糖化反应产物，含量达到75 mg/kg 以上会有毒副作用，是中药材炮制品质控制的关键指标[17]。炮制温度是造成滇黄精中5-羟甲基糠醛含量上升的关键因素[18]，本工艺下，5-羟甲基糠醛含量为53.30 µg/kg，远低于毒理指标要求，此外还检测出大量5-甲基糠醛（20.30 µg/kg）和糠醛（82.39 µg/kg），表明九蒸九制炮制过程的长时多次蒸晒处理会引起部分5-羟甲基糠醛发生进一步热降解，导致总体5-羟甲基糠醛含量较低[19]，产生了5-甲基糠醛和糠醛。糠醛和5-甲基糠醛具有类似焦糖的香气，可能是炮制黄精甜香属性增加的原因。
醇类是新鲜滇黄精挥发性成分中的主要组分，是含量较高的物质（1 065.88 µg/kg），炮制处理后此类物质损失极严重，仅测得171.00 µg/kg。此外，炮制处理后，滇黄精的醇类物质种类明显减少，这可能与热敏性短链醇散逸或醇类物质在多次高温炮制发生次级裂解或合成转化为其他衍生物质有关。与新鲜滇黄精相比，己醇和2-乙基己醇的含量变化最为显著（P<0.01）。己醇是典型的呈现青草味的物质，而2-乙基己醇则具有脂肪的气味[20]，此两类物质含量极显著降低可导致新鲜黄精的刺激性气味降低。
黄精鲜品及炮制品中酮类挥发性物质在11.32%～15.89%，在总体挥发性物质占比较少。3-羟基-2-丁酮和2-庚酮是滇黄精中含量最高的酮类物质，分别为524.02 µg/kg 和115.77 µg/kg，且仅在鲜滇黄精样品中被检出。Liu 等[21]发现3-羟基-2-丁酮对金华火腿中油脂香气具有重要贡献，这与鲜滇黄精中油脂味突出结果一致。2-庚酮可以与空气中的羟基自由基发生反应，分解成小分子的醛[22]，高温长时的蒸制过程可以促进2-庚酮与羟自由基的反应，这可能与炮制滇黄精样品中未测得该物质有关。炮制后酮类物质种类明显升高且新生成的酮类多为低碳数酮（C4～C6 酮），如2（5H）-呋喃酮、呋喃酮和2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮等，其中2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮是典型的美拉德反应产物[11]，高温炮制会加速美拉德反应的进程，使得炮制黄精呈现类似水果的香甜香气。
酯类化合物主要存在于鲜滇黄精中，己酸乙酯和苯甲酸甲酯呈现令人愉悦的水果香气[23]，在炮制处理后，二者均未被检出。己酸乙酯易发生水解反应[24]，多次蒸制炮制的高温加速己酸乙酯的水解过程。此外，肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸甲酯和棕榈酸异丙酯等长链脂肪酸酯类在炮制处理后均未检出，可能由于多次长时高温处理使得酯类物质发生热降解。当归内酯是新生成的炮制产物，是炮制后唯一测得的酯类物质，具有甜香属性。
2-戊基呋喃是其他物质中占比最大的物质，提供青草的气味，被认为是评价黄精品质的指标之一[22]。麝香草酚是样品中的共有物质，具有似薄荷的刺鼻气味，广泛存在于药材中，经炮制处理后，该物质含量极显著降低。
2.2 九蒸九制炮制处理前后黄精感官评价结果分析
新鲜黄精与九蒸九制黄精感官评价雷达图和聚类分析见图2。
图2 新鲜黄精与九蒸九制黄精感官评价雷达图和聚类分析
Fig.2 Radar chart and cluster analysis of the sensory quality of Polygonati Rhizoma samples before and after nine-steam-ninebask treatment
A.雷达图；B.聚类分析。***表示差异高度显著（P<0.001）。
由图2A 可知，九蒸九制处理前后黄精在不同感官属性上均存在高度显著差异（P<0.001）。鲜黄精具有较强的油脂味和刺激感（青涩味、草药味和泥土味），而经九蒸九制炮制后，上述鲜黄精呈现的油脂味、青涩味、草本味和泥土味明显降低，却促发九蒸九制高温炮制产生的甜香和焦香属性占据主导风味。聚类分析（图2B）结果显示所有评测黄精样本可明显归属于两类，其风味属性与炮制工艺完全一致，再次证实了九蒸九制炮制处理对黄精样本风味属性的显著影响。
鲜黄精刺激感多源于苯甲醛（苦杏仁味）、己醛（青草味）、己醇（青草味）和2-庚酮（草药味）等，此类物质经九蒸九制高温炮制后显著下降。C6 醇和醛是果实中青草味的主要来源，在热处理后C6 醛/醇极易分解导致其青草香的损失[25]。九蒸九制的高温长时处理后青涩味和草药味评分下降明显，此现象与GC-MS 结果一致；油脂气味主要由3-羟基-2-丁酮、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸甲酯和棕榈酸异丙酯等物质表征，该风味属性强度的下降可能是由炮制过程中此类物质损失显著所致。炮制后，黄精中的不愉快气味属性的下降显著，这可能由表征青涩味和油腻感的香气活性物质减少的同时一些呈现优良属性（甜香、烘焙香等）的物质产生导致。九蒸九制黄精中的焦糖味和烘焙香等愉悦气味是由黄精中的多糖、游离氨基酸以及微量的脂肪在九蒸九制处理的条件下受热分解或者发生非酶反应产生的[11]。脂肪在高温下加速氧化降解，生成具有香甜感的辛醛和壬醛。而多糖经高温蒸制后，易降解或与氨基酸发生美拉德反应，生成具有焦糖味和烘焙味的呋喃类化合物，如糠醛、4-羟基-2，5-二甲基-3（2H）呋喃酮、5-羟甲基糠醛等。而新生成的呋喃醛类物质产生则与糖类物质受热降解有关。薛澄[26]发现炮制地黄“甜如饴”的形成机制是寡糖在高温条件下的热分解，崔小兵[27]发现山药、白术、苍术、薏苡仁在炮制后生成的焦糖香味物质是美拉德反应产物。这些脂肪氧化产物和美拉德产物构成了黄精蒸制品浓郁厚重的香甜风味，导致整体黄精风味轮廓的改变。
2.3 九蒸九制炮制黄精香气随机森林分析结果
新鲜或炮制滇黄精呈香组分均由复杂的挥发性物质构成，九蒸九制炮制对滇黄精整体香气轮廓影响明显，造成处理前后风味品质异化显著，但单一地探究某一种或一类物质均无法解析炮制工艺对滇黄精整体香气品质影响。因此，减少低贡献度物质对滇黄精炮制前后香气品质的影响，对挥发性物质数据集降维分析，综合筛选出与炮制处理显著相关的关键香气物质十分重要。
随机森林是一种基于自助聚集和随机子空间的包含多个决策树的分类方法，通过生成多个决策树并赋予一定规律进行投票制筛选的方式，实现对高维数据降维处理和合理分类[28]。为明晰新鲜黄精与九蒸九制炮制处理后黄精样本间挥发性化合物的差异，采用随机森林模型对检出的55 种挥发性化合物进行分析，结果见图3。
图3 基于随机森林分析筛选鲜黄精和九蒸九制炮制黄精标志性差异挥发性物质
Fig.3 Random forest analysis of differential volatile compounds in Polygonati Rhizoma samples before and after nine-steam-ninebask treatment
（A）按重要性排序，前20 种标志性化合物；（B）聚类热图。图中序号见表1。
如图3（A）所示，根据平均准确度下降（mean decrease accuracy）按重要性进行排序，共筛选出20 种标志性差异物，分别是癸二酸-2-丁烯基丙酯、苯甲醇、己醇、庚醇、（E）-2-苯甲酸己烯酯、2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、苯甲腈、5-甲基糠醛、己酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、庚醛、糠醛、5-甲基-2-呋喃甲醇、苯甲酸甲酯、棕榈酸异丙酯、2-乙酰基呋喃、己醛、癸醛、3-己烯-2-酮、当归内酯。
将这20 种标志性差异物绘制热图，由图3（B）可知，挥发性物质被分为两大簇，其中5-甲基-2-呋喃甲醇、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、庚醛、2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、3-己烯-2-酮、癸醛、糠醛、当归内酯为一大簇，剩余其他物质为另一大簇。与鲜滇黄精样品相比，经蒸制处理，以5-甲基-2-呋喃甲醇为代表的一大簇物质含量均呈上升趋势。5-甲基-2-呋喃甲醇、糠醛、2-乙酰基呋喃等物质表现为强烈的甜香气味[29-30]，此类物质经蒸制后含量增加的结果与炮制后甜香感官属性增加一致。另一大簇的物质主要表现为草药味、油脂味、青草味等风味属性，呈现较为强烈的刺激感官特征。经九蒸九制处理后，该簇物质含量均呈下降趋势，以苯甲醇和己醇的下降最为显著。苯甲醇和己醇具有相似的变化趋势，处于同一小簇中，其中苯甲醇呈现刺激的苦杏仁味，而己醇则表现为浓郁的青草味，在炮制处理后含量均显著下降，与鲜滇黄精刺激感降低结果相同。
2.4 滇黄精九蒸九制工艺前后的抗氧化活性对比
根据水提物计算公式，九蒸九制滇黄精得率为32.97%。DPPH 自由基和ABTS+自由基清除能力是体外评价活性物质抗氧化活性的常见方法，能够简单快速地评价物质的抗氧化活性[31]。鲜滇黄精与九蒸九制后的滇黄精不同浓度条件下对ABTS+自由基和DPPH由图4 可知，两滇黄精样品对ABTS+自由基清除率均随着水提物浓度的增加呈先增加后趋于平稳的趋势。当滇黄精浓度为1.00 mg/mL 时，鲜滇黄精ABTS+自由基清除率可达45.51%，而九蒸九制后其对ABTS+自由基清除率达到99.81%。之后，随着滇黄精浓度的持续增大，鲜滇黄精样本对ABTS+自由基清除率持续上升，直至浓度达到8.00 mg/mL 时其对ABTS+自由基清除率趋于平衡；相比之下，经九蒸九制炮制处理后的滇黄精样本浓度仅为1.00 mg/mL 时即可达到较优ABTS+自由基清除效果（自由基清除率>90%）。EC50 用于衡量待测物半数效应浓度， EC50 值越小表征其抗氧化活性越强[32]。通过计算获得鲜黄精和九蒸九制后黄精样本EC50 分别为4.24 mg/mL 和0.47 mg/mL，再次表明九蒸九制工艺能够有效提升滇黄精ABTS+自由基清除率。
图4 鲜黄精与九蒸九制黄精对ABTS+自由基和DPPH 自由基清除率
Fig.4 ABTS+ and DPPH free radical scavenging rates of Polygonati Rhizoma samples before and after nine-steam-ninebask treatment
由图4 可知，在试验范围内，鲜滇黄精和九蒸九制滇黄精的DPPH 自由基清除能力差异明显。在最佳浓度0.05～8.00 mg/mL 范围内，蒸制前后黄精样本对DPPH 自由基清除率均与浓度呈正相关，但当浓度大于8.00 mg/mL 时，炮制滇黄精DPPH 自由基清除率逐步趋于平稳，而鲜滇黄精样品的自由基清除率则随着水提物浓度的增大而持续上升，在12.00 mg/mL 时达到68%的最高清除率，仍远低于此浓度下九蒸九制样品的DPPH 自由基清除率。鲜滇黄精EC50为85.12 mg/mL是九蒸九制处理后的滇黄精样品（0.14 mg/mL）的608 倍，再次表明经九蒸九制炮制能明显提高滇黄精DPPH 自由基清除能力。
2.5 挥发性化合物、抗氧化活性与九蒸九制炮制相关性分析
采用多因素PLSR 研究挥发性化合物、抗氧化活性与九蒸九制炮制的关系，结果见图5。由于挥发性化合物和抗氧化活性的表征量纲不同，对数据进行标准化处理后进行PLSR 分析，其中X 基质被指定为标志性香气差异物，而Y 基质被指定为黄精样本及其抗氧化能力（以EC50 的倒数表示）。PLSR 模型包括一个双因子，解释了 99.00% 的 X 方差（香气活性分子）和62.00% 的 Y 方差（不同黄精样本和抗氧化能力）。内椭圆和外椭圆分别表示解释方差的 50% 和 100%。大多数挥发性化合物和感官属性位于这两个椭圆之间，其他位于内部椭圆中，说明PLSR 模型可以很好地解释它们。
图5 新鲜和九蒸九制滇黄精香气标志性差异化合物与抗氧化活性的相关性分析
Fig.5 Correlations between differential volatile compounds and antioxidant activity of Polygonati Rhizoma samples before and after ninesteam-nine-bask treatment
（A）主成分分析（principal component analysis，PCA）；（B）为（A）图中圈住部分。
如图5 所示，样本根据PC1 进行分布，新鲜黄精样本分布在左侧，而经过九蒸九制处理的样本分布在右侧。九蒸九制样本与抗氧化活性指标共同分布在PC1 的正值区域，表明二者存在较强的相关性，这一结果与2.3 结果一致。而新鲜样本则与A2（己醛）、B2（己醇）等11 种挥发性物质分布在PC1 的负值区域，表明此类物质是新鲜黄精香气的主要贡献物质。
此外，抗氧化活性指标与C10[2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮）]、A3（庚醛）、A12（5-甲基糠醛）、A10（癸醛）、A9（糠醛）、D2（当归内酯）、C5（3-己烯-2-酮）、B12（5-甲基-2-呋喃甲醇）、E4（2-乙酰基呋喃）呈显著正相关，其中2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、5-甲基糠醛、糠醛、5-甲基-2-呋喃甲醇和2-乙酰基呋喃是典型的美拉德反应产物。美拉德反应具有广泛的抗氧化性，Cho 等[33]采用不同温度蒸制高丽参发现，随着蒸制温度升高和蒸制时间的延长，其美拉德产物对自由基的清除能力增加，且高温长时蒸制的高丽参呈现最佳的抗氧化能力。Malar 等[34]研究发现，洛神花提取物中的5-甲基糠醛能提高DPPH 自由基清除能力，具有一定的氧化性。Yu 等[35]对葡萄糖-组氨酸参与的美拉德反应产物研究发现，H7 组中的主要成分2，3-二氢-3，5 二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮具有最强的抗氧化能力。九蒸九制的多次高温蒸制可促进美拉德反应发生，增加美拉德反应产物，进而使得炮制黄精的抗氧化能力提高，此结果与王淳等[36]研究结果一致。当归内酯也被认为是有效的抗氧化剂[37]，与PLSR 结果一致。
3 结论
滇黄精经九蒸九制炮制处理后风味属性、挥发性物质组成和功能活性发生显著变化。共55 种挥发性物质被检出，其中20 种物质被认定为是区分炮制黄精的标志性差异性物质。炮制后风味轮廓由青涩味和泥土味等刺激性属性为主转变为甜香和焦香占优势，整体更加柔和。炮制滇黄精样品半数效应浓度（EC50）均明显小于新鲜滇黄精样品，且均在较低浓度具有较高的清除能力，抗氧化能力明显提高。此外，通过偏最小回归分析模型确定九蒸九制炮制可以明显提升滇黄精的抗氧化能力，且抗氧化能力与5-甲基糠醛、糠醛和当归内酯等9 种物质呈较强的相关性。综合以上结论，九蒸九制炮制能够有效改善滇黄精的不良风味，提高抗氧化活性，同时炮制过程中标志性美拉德产物与抗氧化活性显著相关。
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