苹果（Mɑlus pumilɑ Mill.）是世界性大宗水果，其种植总面积和产量仅次于香蕉（含大蕉）和柑橘，在我国苹果是仅次于柑橘的第二大水果品类[1-2]。苹果营养价值高，含有多种营养物质，包括维生素C、微量元素、膳食纤维、矿物质、可溶性糖、有机酸、类黄酮与果胶等[3]。苹果采摘后进行分级、清洗、修整、去皮、切分、保鲜、包装等一系列处理后得到鲜切苹果。它是一种可以提供给消费者或餐饮行业的新型即食加工产品[4]，深受广大消费者喜爱，具有广阔的市场前景。但鲜切苹果在削皮、切分等加工环节，因细胞组织受损，使得酚类化合物与多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）丧失原有正常的区域化分布，导致酶能与底物接触，发生酶促褐变[5]。这不仅影响了产品的外观色泽和商业价值，还严重制约了鲜切苹果产业的发展。
化学护色方法是鲜切果蔬护色保鲜中常用的手段之一，在护色效果、操作简捷性、成本投入等方面具有一定的优势。但部分化学护色剂的残留问题争议颇多，在食用方面有一定的危险性。随着公众生活水平的提升与健康意识的增强，相关领域在鲜切果蔬的护色保鲜方面选择安全高效天然护色剂的意识有所增强。常见的天然护色剂有抗坏血酸及其衍生物、柠檬酸（citric acid，CA）、草酸（oxalic acid，OA）、酚酸、含硫氨基酸等，常用于鲜切果蔬的护色保鲜[6]。其中OA 是植物自身产生并存在于各组织中的一种小分子有机酸，在植物的多种代谢途径中发挥重要的调控作用。另外，OA 可作为一种天然护色剂用于抑制果蔬的酶促褐变，延长货架期[7]。沈玫等[8]研究了OA 处理对绿竹笋的护色保鲜效果，结果表明，在贮藏期内（0～12 d），5 mmol/L 浓度的OA 处理延缓了过氧化氢含量的上升，降低了PPO、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）与过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性，抑制了切面褐变，与对照组比较，其能较好地维持感官品质。
近几年，非热物理技术的普及和应用为鲜切果蔬的护色保鲜提供了新思路。超声波（ultrasound，US）作为一种非热物理加工技术具有环保、无残留、安全、高效等优势，被广泛用于鲜切果蔬的护色保鲜[9]。US 通过其空化效应和机械效应，能够使鲜切果蔬所含POD、PPO 等氧化酶的结构受损，导致其活性减弱，降低酶促褐变速度[10]。研究表明，US 与化学护色剂联合处理能协同抑制鲜切果蔬的酶促褐变，其效果优于单一的US 或化学护色剂处理。Ling 等[11]研究了US（400 W、6 min）联合过氧乙酸（0.4%）对贮藏期枇杷的护色效果，结果表明，US 与过氧乙酸联合处理的护色效果明显优于单一的US 或过氧乙酸处理，并能显著降低枇杷的腐烂程度。另外，Lagnika 等[12]的研究表明，US 与化学护色剂（CA 和过氧化氢）复合处理能显著抑制白蘑菇的褐变，且护色效果明显优于单一的US或化学护色剂处理。由此可见，US 与化学护色剂联合处理能有效控制鲜切果蔬的酶促褐变，但目前还没有相关研究涉及US 辅助OA 对鲜切苹果的护色效果分析。
因此，本研究采用US 辅助OA 处理鲜切苹果，考察其贮藏期内褐变指数（browning index，BI）、氧化酶活性（PPO 和POD）、PAL 活性、总酚含量及抗氧化能力等褐变相关生理生化指标的变化，系统评价US-OA 处理对鲜切苹果的护色效果，以期为鲜切苹果酶促褐变防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
苹果：红富士品种，市售，大小均一、无损伤、色泽均匀，储存条件为4 ℃、相对湿度（relative humidity，RH）90%；聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、碳酸钠（均为分析纯）：天津市科密欧有限公司；柠檬酸、草酸（均为食品级）：天津市光复科技发展有限公司；D-异抗坏血酸（食品级）：深圳乐芙生物科技有限公司；愈创木酚、福林酚（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；邻苯二酚、L-苯丙氨酸（均为分析纯）：上海泰坦科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
切片机（SL-518）：佛山市炊之王炊具有限公司；色差计（NR110）：深圳市三恩时科技有限公司；紫外可见分光光度计（752）：上海菁华科技仪器有限公司；超声波发生器（G300）：张家港市锐志超声科技有限公司；台式高速冷冻离心机（TGL-16M）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鲜切苹果的制备
将苹果洗净、去皮去核后切成圆片状（厚度3 mm、直径20 mm），备用。
1.3.2 化学护色剂的筛选
选用3 种安全性高、效果好的化学护色剂CA、OA和D-异抗坏血酸（D-isoascorbic acid，D-IA），对比分析其对鲜切苹果的护色效果，并筛选出最佳的护色剂。将30 g 鲜切苹果（15 片）分别置于2 L 的1.5% CA、0.5% OA 和0.15% D-IA 溶液中浸泡3 min，对照组（CK）为无任何处理样品。在4 ℃下贮藏8 d，以BI 值为检测指标，考察3 种不同护色剂对鲜切样品的护色效果。
1.3.3 US-OA 处理
将鲜切苹果置于含2 L OA 溶液（0.5%）的超声清洗槽中，在频率40 kHz 和功率300 W 条件下处理3 min。再将鲜切样品于4 ℃贮藏8 d，并分别在第0、2、4、6、8天检测其BI 值并观察其表观色泽变化，对比分析单一的US 或OA 处理与US-OA 处理对鲜切苹果的护色效果。
1.3.4 贮藏期酶促褐变相关生理生化指标的检测
将CK 和US-OA 试验组鲜切样品用聚乙烯保鲜膜包好，在4 ℃下贮藏8 d，分别于第0、2、4、6、8 天测定BI 值、PPO、POD、PAL 活性、抗氧化能力、总酚含量等酶促褐变方面的生理生化参数，系统评价US-OA 的护色效果。
1.3.4.1 褐变指数（BI）的测定
利用色差计测定鲜切样品的色差值，包括亮暗程度（L* 值）、红色度（ɑ* 值）、黄色度（b* 值），并参照解新方等[13]的方法计算BI 值（X），计算公式如下。
1.3.4.2 PPO 活性的测定
参考Zhang 等[14]的方法对PPO 活性进行测定，并略加调整。称量鲜切样品5 g，加入10 mL 冷磷酸缓冲液（pH6.5 0.1 mol/L），于冰浴下进行研磨处理后呈浆状，过滤，再进行15 min 离心处理（8 000 r/min、4 ℃），所得上清液即为粗酶液。将1.8 mL 冷磷酸缓冲液（0.1 mol/L）、1 mL 邻苯二酚溶液（0.02 mol/L）、0.2 mL粗酶液放入同一试管，先充分混合均匀，随后检测OD410 nm 值，每隔0.5 min 记录1 次数据，共6 次。一个PPO 活性单位（U/g）被定义为在单位时间内吸光度增加0.01 所需的酶量。PPO 活性计算公式如下。
式中：X 为PPO 活性，U/g；ΔA410为待测液在410 nm处吸光度的变化值；Vt 为鲜切苹果粗酶液的体积，mL；FW 为鲜切苹果的质量，g；Vs 为参与反应鲜切苹果的酶液体积，mL；t 为反应总时间，min。
1.3.4.3 POD 活性的测定
采用Terefe 等[15]的方法对POD 活性进行测定，并略加调整。向提前预冷的研钵内加入鲜切样品5 g 及冷磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH6.5）10 mL，进行冰浴研磨处理后呈浆状，再通过纱布对浆液进行过滤，离心15 min（8 000 r/min，4 ℃），所得上清液即为粗酶液。将0.1 mL 粗酶液、2.7 mL 冷磷酸缓冲液、0.5 mL 愈创木酚溶液（0.2%）、0.2 mLH2O2（0.05%）溶液放入同一试管中，经摇晃使其混合均匀，随后检测OD470 nm 值，每隔0.5 min 记录1 次数据，共6 次。将单位时间内OD 值增加0.01 记作1 个POD 活性单位（U/g）。POD 活性计算公式如下。
式中：X 为POD 活性，U/g；ΔA470为待测液在470 nm处吸光度的变化值；Vt 为鲜切苹果粗酶液的体积，mL；FW 为鲜切苹果的质量，g；Vs 为参与反应鲜切苹果酶液体积，mL；t 为反应总时间，min。
1.3.4.4 PAL 活性的测定
PAL 活性测定参考Liu 等[16]的方法，并略作调整。称量鲜切苹果5 g，加入10 mL PAL 提取液[4 g PVPP、35 µL β-巯基乙醇、58 mg 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）]，冰浴研磨成浆，用纱布过滤离心30 min（8 000 r/min，4 ℃）得到上清液。取0.5 mL 酶液与3 mL 0.05 mol/L 的硼酸缓冲液（pH8.8）、0.5 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸溶液于试管中，混匀，在37 ℃下水浴10 min，分别测定0、60 min 时的OD290 nm值。以1 h 内吸光度每增加0.01 为PAL 的一个活性单位（U/g）。
式中：X 为PAL 活性，U/g；ΔA290为待测液在290 nm处吸光度的变化值；Vt 为鲜切苹果粗酶液的体积，mL；FW 为鲜切苹果的质量，g；Vs 为参与反应鲜切苹果酶液体积，mL；t 为反应总时间，min。
1.3.4.5 总酚含量的测定
总酚含量的测定根据Rocha 等[17]的方法，并略加调整。向提前预冷的研钵内放入鲜切样品5 g 及15 mL 80% 乙醇，先研磨，再过滤，并进行15 min 离心处理（4 ℃，8 000 r/min），留存上清液用于总酚含量的测定。将0.3 mL 上清液与0.5 mL 福林酚溶液放入同一试管中，先进行3 min 静置反应，再加入Na2CO3 溶液（0.5 mL），用蒸馏水定容至10 mL，再将混合溶液遮光处理60 min。空白对照组为0.3 mL 乙醇，检测OD765 nm 值。通过标准曲线获得总酚浓度C1（mg/mL），再按下述公式对总酚含量进行计算。
式中：X 为总酚含量，mg/100 g 鲜重；C1 为鲜切苹果中总酚浓度，mg/mL；Vt 为鲜切苹果粗酶液的体积，mL；FW 为鲜切苹果的质量，g；Vs 为参与反应鲜切苹果酶液体积，mL。
1.3.4.6 抗氧化能力的测定
1）DPPH·清除能力
根据Kita 等[18]的方法进行测定，并略加调整。向提前预冷的研钵内放入鲜切样品5 g 及20 mL 的乙醇（80%），先研磨、再过滤，最后进行15 min 离心处理（4 ℃，5 000 r/min），取上清液用于DPPH·清除能力的测定。将含有2 mL DPPH、1.8 mL 蒸馏水、0.2 mL 上清液的混合溶液移至暗处，进行0.5 h 的避光反应，检测OD517 nm 值。
式中：X 为DPPH·清除率，%；A1 为DPPH 和上清液的混合液在517 nm 处的吸光度；A2 为DPPH 和乙醇的混合液在517 nm 处的吸光度；A3 为上清液和乙醇的混合液在517 nm 处的吸光度。
2）ABTS+·清除能力
根据Kita 等[18]的研究进行测定，并略加调整。依次取0.2 mL 上清液[制备方法同1.3.4.6 中1）]与3.8 mL ABTS 溶液放于同一试管中，经摇晃使其混合均匀，进行避光处理6 min，再检测OD734 nm 值。
式中：X 为ABTS+·清除率，%；A1 为ABTS 和上清液的混合液在734 nm 处的吸光度；A2 为ABTS 和乙醇的混合液在734 nm 处的吸光度；A3 为上清液和乙醇的混合液在734 nm 处的吸光度。
1.4 数据分析
所有试验进行3 次重复。采用IBM SPSS Statistics 25.0 软件进行方差统计分析，统计结果以平均值±标准差来表示。用Duncan 多重比较分析法进行差异显著性分析，其中P<0.05 表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 不同护色剂处理对鲜切苹果BI 值的影响
BI 值可以直观反映鲜切苹果的褐变程度，BI 值越大表明其褐变程度越高。不同护色剂处理对鲜切苹果BI 值的影响如图1 所示。
图1 不同护色剂处理对鲜切苹果BI 值的影响
Fig.1 Effect of different color protectant treatments on BI value of fresh-cut apples
相同贮藏时间不同小写字母表示不同处理组差异显著（P<0.05）。
由图1 可知，随着贮藏时间的延长，试验组与CK组的BI 值总体呈上升趋势，但就上升幅度而言，试验组低于对照组（CK），说明3 种护色剂均能抑制贮藏期鲜切苹果的褐变。在贮藏0 ～ 6 d 内，OA 组BI 值显著低于CA 组和D-IA 组（P<0.05），但贮藏第8 天时，OA组BI 值大幅上升，且显著高于其它试验组（P<0.05）。覃海元等[19]比较了OA 和CA 处理对鲜切香蕉的护色效果，结果表明，褐变抑制率会随着OA 和CA 浓度的增加而增加，且OA 对抑制鲜切香蕉褐变的效果优于相同浓度的CA。此外，孙程旭等[20]的研究表明，在相同浓度下（0.01 mmol/L），D-IA 对贮藏期鲜切马铃薯的护色效果明显优于CA。但在本研究中，经OA 处理的鲜切苹果BI 值最低，表明褐变程度较低，可用于鲜切苹果的护色保鲜。
2.2 US-OA 处理对鲜切苹果表观色泽和BI 值的影响
表观色泽变化是反映鲜切果蔬褐变程度最直观的指标之一。不同处理对鲜切苹果表观色泽的影响如图2A 所示，对鲜切苹果BI 值的影响如图2B 所示。
图2 不同处理对鲜切苹果表观色泽和BI 值的影响
Fig.2 Effect of different treatments on the appearance and color and BI value of fresh-cut apples
A.鲜切苹果表观色泽；B. BI 值。相同贮藏时间不同小写字母表示不同处理组差异显著（P<0.05）。
由图2A 可知，在贮藏期内，单一处理（OA 组和US 组）和US-OA 组鲜切苹果表观色泽均优于CK 组样品，且在贮藏的第2 天，CK 组样品出现了明显的褐色，这与图2B 结果一致。在贮藏的第6 天，OA 组和US 组样品表面出现了明显的褐变，而US-OA 组的褐变程度相对较低。由此可见，经US-OA 处理的鲜切苹果与单一的OA 和US 处理比较，其切面褐变程度低，保持了较好的外观品质。
由图2B 可知，鲜切苹果的BI 值随着贮藏时间的延长而增加，但各试验组较CK 组显著偏低（P<0.05）。在贮藏0～6 d 内，相较OA 组和US 组，US-OA 试验组的BI 值显著偏低（P<0.05），说明US-OA 处理的护色效果优于单一的OA 或US 处理。在贮藏的第8 天，CK 组BI 值大幅升高（BI 值为18.00），与相同贮藏时间US-OA 组（BI 值为7.22）相比仍有2.5 倍的差别。这说明不仅US 自身的空化和机械作用对PPO 或POD活性产生影响，而且US 还增强了OA 溶液在样品中的渗透和扩散，从而进一步提高了OA 对鲜切苹果的护色能力[21]。
2.3 US-OA 处理对贮藏期鲜切苹果褐变相关生理生化指标的影响
2.3.1 US-OA 处理对鲜切苹果PPO 活性的影响
PPO 可催化酚类物质氧化成醌，醌进一步反应形成褐色物质，继而严重影响鲜切果蔬的感官品质。USOA 处理对鲜切苹果PPO 活性的影响如图3 所示。
图3 US-OA 处理对鲜切苹果PPO 活性的影响
Fig.3 Effect of US-OA treatment on PPO activity of fresh-cut apples
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图3 可知，随着贮藏期的延长，US-OA 组和CK组鲜切苹果PPO 活性均呈上升趋势，但US-OA 组PPO 活性均显著低于CK 组（P<0.05）。特别是自贮藏后期（4～8 d），CK 组PPO 活性的上升幅度较大，而USOA 组较为平缓。这表明，在US 和OA 的协同作用下显著抑制了鲜切苹果的PPO 活性，有利于延缓鲜切苹果的酶促褐变。这可能是因为OA 作为一种抗氧化剂，可通过螯合PPO 分子活性中心的铜离子和降低反应体系pH 值而抑制其活性升高[22]。另一方面，也可能是US 通过空化和机械作用改变PPO 分子空间结构，从而抑制其活性升高，延缓鲜切果蔬的酶促褐变[23]。
2.3.2 US-OA 处理对鲜切苹果POD 活性的影响
POD 可在H2O2 存在时促进酚类物质向醌类物质的转换，形成褐色聚合物，从而加速鲜切果蔬的褐变。US-OA 处理对鲜切苹果POD 活性的影响如图4 所示。
图4 US-OA 处理对鲜切苹果POD 活性的影响
Fig.4 Effect of US-OA treatment on POD activity in fresh-cut apples
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图4 可知，在贮藏过程中US-OA 组和CK 组鲜切苹果POD 活性大体呈现上升趋势。但在整个贮藏期内，US-OA 组POD 活性显著低于CK 组（P<0.05），而且在贮藏的第8 天仍低于CK 组。Shafique 等[24]的研究表明，OA 作为羧酸类物质可降低体系pH 值，使体系pH 值偏离POD 的最适pH 值范围，降低其活性，从而延缓鲜切果蔬的酶促褐变。此外，Wang 等[25]的研究表明，在US 空化作用下产生的自由基能与POD 分子中的氨基酸残基反应，促使其空间结构发生变化，继而降低POD 活性。由此可见，US 辅助OA 处理能有效抑制POD 活性，延缓鲜切苹果的褐变。
2.3.3 US-OA 处理对鲜切苹果PAL 活性的影响
US-OA 处理对鲜切苹果PAL 活性的影响如图5所示。
图5 US-OA 处理对鲜切苹果PAL 活性的影响
Fig.5 Effect of US-OA treatment on PAL activity in fresh-cut apples
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图5 可知，在贮藏期内（0～8 d），鲜切苹果PAL活性整体呈先上升后下降趋势。在贮藏0～2 d 内，USOA 组和CK 组PAL 活性均大幅上升，这可能是由于PAL 是一种创伤性诱导酶，当细胞遭受机械损伤时，可诱导鲜切果蔬PAL 活性上升[26]。在贮藏2～6 d 内，USOA 组和CK 组PAL 活性均呈下降趋势，但CK 组PAL活性在贮藏的第8 天大幅上升。PAL 是植物细胞内酚类化合物合成途径中苯丙烷代谢的限速酶，其活性会影响苯丙氨酸代谢，从而影响酶促褐变底物的合成和积累[27]。总体来看，US 辅助OA 处理能抑制贮藏期鲜切苹果PAL 活性的升高，尤其在贮藏前期（0～2 d）对PAL 活性的抑制效果较明显。
2.3.4 US-OA 处理对鲜切苹果总酚含量的影响
US-OA 处理对鲜切苹果总酚含量的影响如图6所示。
图6 US-OA 处理对鲜切苹果总酚含量的影响
Fig.6 Effect of US-OA treatment on total phenol content of freshcut apples
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图6 可知，在贮藏期内鲜切苹果的总酚含量整体呈现下降趋势，这可能与鲜切苹果中氧化酶持续催化酚类物质氧化分解作用有关。除第0 天外，US-OA试验组鲜切苹果总酚含量显著高于同期的CK 组（P<0.05）。酚类化合物是导致鲜切果蔬发生酶促褐变的关键底物，在氧化酶（PPO 和POD）的催化作用下氧化形成醌类物质，再通过聚合反应生成褐色物质[28]。如前所述，US 可通过空化和机械作用改变PPO 或POD分子空间结构，而OA 可以与PPO 分子活性中心的铜离子结合，从而降低酶活性，减少酚类化合物的消耗和损失。这可能是导致US-OA 组总酚含量高于同期CK组的原因。
2.3.5 US-OA 处理对鲜切苹果抗氧化能力的影响
US-OA 处理对鲜切苹果DPPH·和ABTS+·清除能力的影响如图7 所示。
图7 US-OA 处理对鲜切苹果DPPH·和ABTS+·清除能力的影响
Fig.7 Effect of US-OA treatment on DPPH· and ABTS+·scavenging ability in fresh-cut apples
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图7 可知，鲜切苹果对DPPH·和ABTS+·清除率整体呈先上升后下降趋势。除贮藏第4 天外，USOA 试验组对DPPH·清除率显著高于同期的CK 组（P<0.05），而US-OA 组对ABTS+·清除率在贮藏期内始终高于CK 组，且在贮藏8 d 显示出较大的差异（11.23%）。这说明US 辅助OA 处理有效提高了鲜切苹果的抗氧化能力，这与图6 结果一致。酚类化合物作为苹果中主要的抗氧化物质之一，可以清除自由基而减少细胞膜脂的氧化，从而延缓鲜切果蔬的褐变[29-31]。另外，US的空化和机械作用促使抗氧化物质降解相关的酶活性受到抑制，从而减少鲜切苹果中抗氧化物质的损失[32]。
3 讨论与结论
新鲜苹果在去皮、切分等过程中，由于受到机械损伤易发生褐变，其切面褐变程度与酚类物质含量、PPO、POD、PAL 活性等密切相关。在本研究中，首先考察了不同护色剂对鲜切苹果的护色作用，并筛选出最佳的化学护色剂。其次，考察了US 辅助OA 处理对贮藏期鲜切苹果的护色作用。结果表明，3 种护色剂中OA 处理对鲜切苹果的护色效果最佳，有效抑制了切面褐变。另外，US-OA 处理对鲜切苹果的护色效果优于单一的US 和OA 处理。如前所述，PPO 和POD是导致鲜切果蔬酶促褐变的关键氧化酶，US 辅助OA处理可有效抑制鲜切苹果PPO 和POD 活性。这可能与US 和OA 协同作用相关，一方面，这可能是由于US处理产生的空化效应和机械效应改变了氧化酶（PPO、POD）分子空间结构，从而导致酶活性的降低；另一方面，OA 不仅可以降低反应体系pH 值，还可以与氧化酶活性中心的金属离子（如Cu2+）结合而降低氧化酶的催化活性[33]。
PAL 是酚类化合物合成途径中的关键酶，当PAL活性受到抑制时会影响酶促褐变底物酚类化合物的合成与积累，进而延缓酶促褐变的发生。在本研究中，US-OA 组鲜切苹果PAL 活性在贮藏期内呈现先升后降的趋势，在贮藏0～2 d 内，其活性显著低于CK 组（P<0.05）。然而，这一结果与总酚含量的变化趋势并不一致，这表明US-OA 组总酚含量虽然高于CK 组，但由于氧化酶（PPO、POD）活性受到抑制，从而导致US-OA组鲜切苹果的褐变程度低于CK 组。另外，鲜切苹果经US-OA 处理后其抗氧化能力显著升高，这可能与氧化酶（PPO、POD）活性降低从而减少了鲜切苹果中酚类化合物的消耗有关[34]。同时，Qiao 等[35]的研究表明，在适当的条件下（0.75 W/cm2，5 min），US 可提高鲜切马铃薯的抗氧化能力，降低了褐变程度。在今后的研究中应进一步考察酚类化合物以外的抗氧化物质和细胞膜脂氧化程度（丙二醛含量）。
由此可见，在本研究中，US-OA 处理可通过抑制鲜切苹果中的氧化酶（PPO 和POD）活性和提高抗氧化能力而减缓其酶促褐变的发生。
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