皮肤是人体最大的器官，也是抵御外界刺激的第一道防线，经常暴露于外部环境中[1]。皮肤发挥包括感知外部刺激、调节体温、排泄代谢物、抵御物理、机械和化学伤害以及病原微生物的入侵等至关重要的作用[2]。皮肤老化受到内在因素（年龄、基因组成和荷尔蒙变化等）和外在因素[紫外线（ultraviolet，UV）辐射、空气污染等]的影响[3]。“光老化”一词长期以来一直是外源性皮肤老化的代名词，强调了UV 辐射影响的重要性[4]。约80% 的皮肤老化是由UV 暴露引起的[5]。大量流行病学调查结果表明，多种皮肤病均与皮肤的光老化有关，如光线性弹性纤维病、日光性角化病、基底细胞癌、黑素细胞癌等[6]。此外，皮肤老化可引发复杂的心理问题（如焦虑、抑郁、自卑等），进而影响人们的生活质量。当前，皮肤光老化已经成为一种公共卫生问题。
UV 暴露对皮肤的主要不良影响之一是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生[7]。UV 辐射导致皮肤ROS 积累，引起皮肤氧化应激损伤，改变基因和蛋白质的结构和功能，刺激金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）分泌。这些变化导致真皮层中胶原蛋白和透明质酸（hyaluronic acid，HA）的含量降低[8]，最终表现为皱纹形成、皮肤松弛和色素沉着等光老化皮肤特征[9]。
体内和体外研究表明，植物来源的风味化合物（如丁香酚[10]、α-紫罗兰酮[11-12]和芳樟醇[13]）具有缓解皮肤光老化的有益效果，成为抗光老化损伤的重要候选物质。罗勒烯作为一种天然芳香物质，广泛存在于烟草、罗勒精油和薰衣草精油中，以其独特的芳香和草药气味而闻名，因此罗勒烯被广泛应用于香料和芳香制品中[14]。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》将罗勒烯归类为食品添加剂。而罗勒烯的生理活性（如抗光老化效果）还未被广泛研究。为填补这一空白，本研究旨在探讨罗勒烯缓解中波紫外线（ultraviolet B，UVB）诱导的HaCaT 角质形成细胞和Hs68 成纤维细胞光老化的潜在功效。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗勒烯（纯度≥90%）、细胞培养基（ulbecco′s modified Eagle，DMEM）：美国Sigma 公司；HaCaT 角质形成细胞：北京协和医学院人表皮角质形成细胞系细胞资源中心；Hs68 成纤维细胞：美国模式培养物集存库；TRIzol 试剂：美国英杰公司；反转录试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂增强版：天根生化科技（北京）有限公司；考马斯亮蓝G250（C8420）、磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate-buffered saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司；改良Eagle′s 培养基（modified Eagle′s medium，MEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素-链霉素溶液、0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液：美国赛默飞世尔科技公司；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK 8）、ROS 检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒：上海碧云天生物技术公司；人总MMP-1 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、人HA ELISA 试剂盒（DHYAL0）：美国R&D 公司；人前胶原I 型c 肽（procollagen type I C-peptide，PIP）ELISA 试剂盒：日本滋贺Takara Bio 公司。
1.2 仪器与设备
二氧化碳细胞培养箱（MCO-20AIC）：日本三洋电机株式会社；超净工作台（BJ-2CD）：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；酶标仪（DNM-9602）：北京普朗新技术有限公司；低速离心机（TDL-40B）：上海安亭科学仪器厂；分光光度计（Nano 300）：杭州奥盛仪器有限公司；荧光定量聚合酶链式分析仪（CFX384）：美国Bio-Rad 公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养和UVB 照射
HaCaT 细胞在添加10% 的FBS 和1% 的青霉素-链霉素溶液的MEM 中培养。Hs68 细胞在添加10%的FBS 和1% 的青霉素-链霉素溶液的DMEM 中培养。两种细胞系均在37 ℃含5% CO2 的条件中培养。细胞传代时，以PBS 清洗细胞，后用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液处理，使贴壁细胞脱落。UVB 灯管提供UVB 辐照，用辐照计测定辐照强度。UVB 灯管的辐照强度经测定为0.126 mW/cm²。在UVB 辐照过程中，细胞保存在PBS 中。辐照时间（F，s）的计算公式如下。
式中：ɑ 为辐照剂量，mJ/cm2；b 为辐照强度，mW/cm2。
1.3.2 细胞活力测定
采用CCK8 法测定细胞活力。细胞接种于96 孔板并培养24 h 后，用罗勒烯处理，继续培养24 h。另外设置只含培养基，不含细胞的对照组。在CCK8 试剂中孵育3 h 后，使用酶标仪在450 nm 处测量96 孔板中每孔的光密度（optical density，OD）。细胞活力（X，%）计算公式如下。
式中：A2 为每个测试孔的OD 值；A1 为无罗勒烯处理组的平均OD 值；A0 为对照组的平均OD 值。
1.3.3 ROS 水平测定
将细胞接种于96 孔板后培养24 h，使细胞达到50%～60% 的融合。细胞在UVB 辐照后，用罗勒烯处理，继续培养24 h。ROS 水平测定采用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFHDA）荧光染色法。DCFH-DA 被细胞吸收后通过细胞酯酶的去乙酰化转化为非荧光化合物，该非荧光化合物随后被ROS 氧化为2′，7′-二氯荧光素，并发出荧光。细胞内ROS 水平使用酶标仪在激发和发射波长分别为480 nm 和530 nm 处测定。
1.3.4 MDA 水平、SOD 活力、MMP-1、PIP 和HA 含量测定
采用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞，进而提取细胞总蛋白。通过测定MDA-硫代巴比妥酸复合物在532 nm 处的吸光度，检测脂质过氧化产物MDA 水平。采用WST-8 法，在450 nm 处测定吸光度，检测SOD 活力。细胞中MMP-1、PIP 和HA 含量使用相应ELISA 试剂盒测定。MDA 水平、SOD 活力、MMP-1、PIP 和HA 含量最终采用细胞总蛋白含量归一化。
1.3.5 实时定量逆转录-聚合酶链式反应
用TRIzol 提取细胞总RNA 并测定RNA 浓度。cDNA 合成使用TransScript 一步式gDNA 去除和cDNA 合成SuperMix。使用SuperReal 荧光定量预混试剂增强版进行定量反转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRTPCR）。qRT-PCR 所用引物序列如表1 所示。目标基因的mRNA 表达水平用β-ɑctin 的表达水平均一化。
表1 用于 qRT-PCR 的引物序列
Table 1 Primer sequences for qRT-PCR
目标基因MMP-1 MMP-3 MMP-9 β-ɑctin正向引物 5′-3′CACTGGCATCTTCACTG ATTCT TGAGGACACCAGCATGA ACC TTGACAGCGACAAGAAG TGG AGCGAGCATCCCCCAAA GTT反向引物 5′-3′ATGTCCTTGGGGTATCCGT GTAG ACTTCGGATGCCCAGG AAAG GCCATTCACGTCGTCC TTAT GGGCACGAAGGCTCATCA TT
1.4 数据统计与分析
数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析确定显著性差异，采用GraphPad Prism 9.4.0 软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 罗勒烯缓解UVB 诱导的HaCaT 表皮角质形成细胞光老化
2.1.1 罗勒烯对HaCaT 细胞活力的影响
CCK8 试验探究罗勒烯对HaCaT 细胞活力的影响，结果如图1 所示。
图1 罗勒烯的化学结构及罗勒烯对HaCaT 细胞活力的影响
Fig.1 Chemical structure and effect of ocimene on cell viability in HaCaT cells
（A）罗勒烯的化学结构；（B）细胞活力。
由图1 可知，罗勒烯浓度达到100.0 µmol/L 时对HaCaT 细胞存活率无明显影响。因此，在随后的HaCaT细胞实验中，选择100.0 µmol/L 浓度处理HaCaT 细胞。
2.1.2 罗勒烯对UVB 引起的HaCaT 细胞氧化损伤的影响
前期研究表明，给予HaCaT 细胞5 mJ/cm²的UVB辐照可诱导其光老化[11]。通过检测ROS、MDA 水平和SOD 活力，可评价罗勒烯对UVB 诱导的HaCaT 细胞氧化应激损伤的缓解效果，结果如图2 所示。
图2 罗勒烯对UVB 引起的HaCaT 细胞氧化损伤的影响
Fig.2 Effect of ocimene on UVB-induced oxidative damage in HaCaT cells
（A）ROS 水平；（B）MDA 水平；（C）SOD 活力。*表示差异显著，p<0.05；****表示差异高度显著，p<0.000 1；ns 表示差异不显著，p>0.05。
由图2 可知，暴露于UVB 后，HaCaT 细胞中ROS 水平和脂质过氧化产物MDA 水平显著增加（p<0.000 1），细胞内抗氧化酶SOD 活力显著降低（p<0.05）。罗勒烯处理显著抑制了UVB 诱导的细胞内ROS 水平的升高，并有效降低了MDA 水平。罗勒烯处理可上调UVB 暴露的HaCaT 细胞中SOD 活力（p>0.05）。上述结果表明，罗勒烯缓解了UVB 暴露引起的HaCaT 细胞中的氧化应激损伤。
2.1.3 罗勒烯对UVB 诱导的HaCaT 细胞中MMP 表达的影响
罗勒烯对UVB 诱导的HaCaT 细胞中MMP 表达的影响如图3 所示。
图3 罗勒烯对UVB 诱导的HaCaT 细胞中MMP 表达的影响
Fig.3 Effect of ocimene on MMP expression in UVB-induced HaCaT cells
（A）HaCaT 细胞中MMP-1 的含量；（B）HaCaT 细胞中MMP-1 的mRNA 表达水平；（C）HaCaT 细胞中MMP-3 的mRNA 表达水平；（D）HaCaT 细胞中MMP-9 的mRNA 表达水平。*表示差异显著，p<0.05；***表示差异极显著，p<0.001；****表示差异高度显著，p<0.000 1；ns 表示差异不显著，p>0.05。
由图3 可知，UVB 暴露引起MMP-1 蛋白分泌显著增加（p<0.000 1），而罗勒烯处理似乎对MMP-1 分泌无显著抑制效果。UVB 辐照显著增加了HaCaT 细胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9 的mRNA 表达水平（p<0.001、p<0.000 1）。当UVB 暴露后的HaCaT 细胞经罗勒烯处理后，MMP-1、MMP-3、MMP-9 的mRNA 表达水平显著降低（p<0.05、p<0.001、p<0.000 1）。上述结果表明，罗勒烯处理抑制了UVB 诱导的HaCaT 细胞中MMP 表达水平升高。
2.2 罗勒烯缓解UVB 诱导的Hs68 真皮成纤维细胞光老化
2.2.1 罗勒烯对Hs68 细胞活力的影响
罗勒烯对Hs68 细胞活力的影响如图4 所示。
图4 罗勒烯对Hs68 细胞活力的影响
Fig.4 Effect of ocimene on cell viability in Hs68 cells
***表示差异极显著，p<0.001。
由图4 可知，罗勒烯处理Hs68 细胞的浓度达100.0 µmol/L 时，仍对Hs68 细胞没有明显的细胞毒性。在后续Hs68 细胞实验中，采用100.0 µmol/L 罗勒烯处理Hs68 细胞。
2.2.2 罗勒烯对UVB 辐照的Hs68 细胞中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）含量的影响
前期研究表明，给予Hs68 细胞5 mJ/cm²的UVB辐照可诱导其光老化[15]。罗勒烯对UVB 辐照的Hs68细胞中ECM 含量的影响如图5 所示。
图5 罗勒烯对UVB 辐照的Hs68 细胞中ECM 含量的影响
Fig.5 Effect of ocimene on ECM content in UVB-induced Hs68 cells
（A）Hs68 细胞中MMP-1 的含量；（B）Hs68 细胞中PIP 的含量；（C）Hs68 细胞中HA 的含量。*表示差异显著，p<0.05；**表示差异极显著，p<0.001；****表示差异高度显著，p<0.000 1。
由图5 可知，UVB 暴露促进Hs68 细胞中MMP-1蛋白的分泌，降低胶原蛋白（由PIP 含量表示）和HA的含量。罗勒烯处理抑制UVB 诱导的MMP-1 分泌增加，并显著恢复胶原蛋白和HA 含量。综上所述，罗勒烯恢复了UVB 辐照的Hs68 细胞中ECM 的含量。
3 讨论与结论
基于UV 暴露在皮肤老化中的显著作用及其直接影响皮肤表皮层的特点，外源性皮肤老化长期以来被认为是一种由外到内的作用机制[4]。UV 对皮肤表皮层的损伤不仅导致表皮老化，还触发下游一系列反应，进而导致真皮老化。表皮层是皮肤的主要屏障，在UV暴露中最容易受到影响，导致皮肤含水量降低、屏障蛋白表达降低等不良后果，最终破坏皮肤屏障的完整性[16]。随后，真皮层出现大量免疫细胞浸润并伴随炎症因子的分泌，导致真皮中的主要细胞—成纤维细胞数量减少，进而引起ECM 含量降低，最终破坏了皮肤结构的完整性[17]。UVB 照射还导致皮肤细胞中ROS的积累，触发氧化应激反应，破坏皮肤细胞的正常功能[18]。本研究结果表明，罗勒烯对表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞的光老化均具有保护作用，提示罗勒烯可能是缓解皮肤光老化有前景的候选物质。
MMP 是一类锌依赖性内肽酶，受到如UV 等刺激后，由角质形成细胞和真皮成纤维细胞分泌[19]。MMP具有广泛的底物特异性，在胶原蛋白和透明质酸等多种ECM 的降解中发挥关键作用[20]。MMP 在皮肤光老化中发挥至关重要的作用，UVB 暴露后，表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞主要分泌MMP-1，这是一种胶原酶，可将ECM（如I 型胶原蛋白和III 型胶原蛋白）降解成特定片段；其他MMP（如MMP-3、MMP-9）进一步水解这些片段，最终呈现出光老化皮肤的外观特征[5]。本研究中罗勒烯显著降低了光老化的HaCaT 细胞中MMP 的基因表达，但罗勒烯对MMP-1 蛋白的分泌无抑制效果；而光老化的Hs68 细胞中，罗勒烯呈现出显著抑制MMP-1 蛋白分泌的效果。综上，罗勒烯对表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞分泌的MMP 的抑制效果不一致，已有研究中存在类似现象[11]。
在光老化进程中，ROS 作为信号分子发挥着重要作用[21]。UV 暴露会促使ROS 积累于皮肤，引起各种丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化和激活，包括细胞外信号调节激酶、p38 和c-Jun N 末端激酶。这些激活的激酶进一步刺激转录因子激活蛋白-1 的c-Jun 和c-Fos组分[12]。激活蛋白-1 具有促进MMP 表达的作用，而MMP 被广泛认为是一类重要的与衰老相关的分泌表型[8]。本研究发现，罗勒烯缓解了UVB 引起的HaCaT细胞氧化损伤，表现为抑制ROS 的积累，降低氧化产物MDA 的水平，恢复抗氧化酶SOD 的活力。此外，罗勒烯呈现出抑制光老化HaCaT 和Hs68 细胞中MMP的表达及分泌的有益作用。推测罗勒烯抑制MMP 表达及分泌的效果可能与其缓解细胞氧化应激损伤的作用有关。
综上，罗勒烯对UVB 诱导的皮肤细胞光老化具有保护效果。在光老化的表皮角质形成细胞中，罗勒烯缓解了氧化应激损伤并抑制了MMP 的表达。在光老化的真皮成纤维细胞中，罗勒烯降低了MMP 蛋白分泌并提高了胶原蛋白和HA 的含量，发挥保护ECM 的有益效果。结果表明罗勒烯具有缓解皮肤光老化的重要潜力，为防治皮肤老化提供了新思路和新方法。
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