亚洲女性崇尚“以白为美”，因此，美白化妆品迅速崛起。目前，关于美白作用相关的特殊化妆品开发均是以抑制酪氨酸酶活性为核心，据统计，日本在1983年～2018 年，审核通过具有美白活性作用的化学成分18 种，其中11 种成分是以抑制酪氨酸酶活性为机制开发[1]。酪氨酸酶是黑色素生成过程中的限速酶，酪氨酸被其氧化生成多巴，多巴再继续被酪氨酸酶氧化生成多巴醌，此步骤为黑色素生成的首要环节[2]。现今市场上流通的美白护肤品成分包含化学类、植物类、生物类三大类，但随着化学类美白成分副作用的增加，掀起了植物类美白的热潮。
白及是兰科植物白及的干燥块茎，具有收敛止血、消肿生肌的功效[3]。自古以来，白及属植物一直被用于女性护肤，在中医药典籍中早有记载白及具有美白、祛斑的功效[4-5]。孔伟华等[6]将白及的现代研究进行整理归纳，发现白及含有丰富的化学成分，包括氨基酸、螺环烷甾类皂苷、联苄衍生物、联苄类、糖苷、菲类以及蒽醌类等，药理作用众多，包括止血、免疫调节、促进伤口愈合、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及抗溃疡作用等。而与美白作用相关的化学成分主要涉及联苄类、白及胶（白及多糖）、二氢菲及菲类以及2-异丁基苹果酸葡萄糖氧基苄酯类等[5]，其中，白及多糖的美白作用备受关注。刘福强等[7]对白及多糖进行提取分离纯化，证实白及多糖由葡萄糖和甘露糖组成，其中甘露糖占比约85%，葡萄糖占比约15%。研究结果显示，白及多糖可以抑制酪氨酸酶活性，阻碍黑色素的生成，从而达到美白的效果，但并未阐明白及多糖对酪氨酸酶活性的抑制机理[8-10]。本文通过试验确定白及多糖的单糖组成，探究白及多糖抑制酪氨酸酶活性的机理，阐明白及多糖对酪氨酸酶活性的抑制类型，以期为进一步开发白及多糖功能食品提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白及：贵州海慕中药材发展有限公司；纤维素酶（50 000 U/g）、果胶酶（30 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、酸性蛋白酶（800 000 U/g）、酪氨酸酶（25 KU）：北京索莱宝科技有限公司；岩藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、果糖（Fru）、核糖（Rib）、半乳糖醛酸（Gal-UA）、葡萄糖醛酸（Glc-UA）、甘露糖醛酸（Man-UA）、古罗糖醛酸（Gul-UA）：美国sigma 公司；L-酪氨酸、抗坏血酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠（分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；三氯乙酸（色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）：广州和为医药科技有限公司。
1.2 仪器与设备
ICS 5000+离子色谱系统、Multiskan SkyHigh 酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific 公司；HH-2 数显恒温水浴锅：上海力辰仪器科技有限公司；ME204E 万分之一分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3C 型酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 白及多糖制备及含量测定
1.3.1.1 白及多糖提取
白及干品粉碎，过60 目筛备用。称取白及样品1.0 g，按照1∶30 （g/mL）的料液比加入pH 值为4.0、质量浓度为3% （相对底物浓度）的复合酶（纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶以及木瓜蛋白酶质量比为2∶2∶1∶0.5）磷酸盐缓冲溶液，混匀，于40 ℃恒温水浴酶解30 min。酶解结束后90 ℃热水灭酶10 min，趁热减压抽滤后，将所得滤液冻干，得到白及多糖，备用。
1.3.1.2 白及多糖含量测定
采用硫酸-苯酚法[11]测定白及多糖含量。称取白及样品1.0 g 置于烧杯中，按照1∶30 （g/mL）的料液比加入pH 值为4.0、质量浓度为3%（相对底物浓度）的复合酶磷酸盐缓冲溶液，于40 ℃恒温水浴中酶解30 min。酶解结束后90 ℃热水中灭酶10 min，趁热减压抽滤。取1 mL 滤液于100 mL 容量瓶，用蒸馏水定容，在480 nm 波长下测定多糖含量。
1.3.1.3 白及多糖单糖组成测定
精确称取2.40 mg 白及多糖，加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，121 ℃加热2 h后氮气吹干，然后用甲醇复溶后再次吹干，重复操作2～3 次，用无菌水溶解待测。
分别精确称取13 种单糖标准品，加水配成10 mg/mL的母液标准液，并配制单糖的混合标准品溶液，单糖混合标准品梯度浓度见表1。
表1 单糖混合标准品梯度浓度
Table 1 Gradient concentration of mixed monosaccharide standards
名称Fuc Rha Ara Gal Glc Xyl Man Fru Rib Gal-UA Gul-UA Glc-UA Man-UA浓度/（µg/mL）0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 1.0 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 4 4 4 4 4 4 5 6 6 6 6 6 6 8 8 8 8 8 8 10 12 12 12 12 12 12 16 16 16 16 16 16 20 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 30 36 36 36 36 36 36 32 32 32 32 32 32 40 48 48 48 48 48 48 40 40 40 40 40 40 50 60 60 60 60 60 60
离子色谱条件：Dionex™ CarboPac™ PA20（150 mm×3.0 mm，10 µm）液相色谱柱；进样量5 µL；流动相A（H2O），流动相B（0.1 mol/L NaOH），流动相C（0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaAc）；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃。洗脱梯度：0 min 三相体积比95∶5∶0，26 min 三相体积比85∶5∶10，42 min 三相体积比85∶5∶10，42.1 min 三相体积比60∶0∶40，52 min 三相体积比60∶40∶0，52.1 min三相体积比95∶5∶0，60 min 三相体积比95∶5∶0。
1.3.2 白及多糖抑制酪氨酸酶活力试验
1.3.2.1 白及多糖对酪氨酸酶活力的影响
用pH6.8 的磷酸盐缓冲液分别配制质量浓度为165.2 U/mL 的酪氨酸酶溶液和0.312 mg/mL 的L-酪氨酸溶液；用蒸馏水分别配制质量浓度为60.34、55.51、50.08、45.26、40.02 mg/mL 的白及多糖溶液。固定酪氨酸酶和L-酪氨酸溶液的质量浓度不变，按表2 所示的反应体系，每孔平行3 次，37 ℃条件下反应20 min 后，用酶标仪测定475 nm 处的OD 值。以白及多糖浓度对数为横坐标，抑制率的分布概率为纵坐标，绘制标准曲线，计算IC50 值。以抗坏血酸作阳性对照。白及多糖对酪氨酸酶活性的抑制率（R，%）计算公式如下。
表2 酪氨酸酶抑制试验反应体系
Table 2 Reaction system of tyrosinase inhibition experiment
注：-表示未添加此溶液。
反应体系C1 C2 T1 T2磷酸盐缓冲液/µL 200 250 150 200白及多糖/µL- - 50 50 L-酪氨酸/µL 50 50 50 50酪氨酸酶/µL 50-50-
式中：T1 为白及多糖样品反应体系体积，µL；T2 为白及多糖样品调零体系体积，µL；C1 为L-酪氨酸反应体系体积，µL；C2 为L-酪氨酸反应调零体系体积，µL。
1.3.2.2 白及多糖对酪氨酸酶抑制动力学曲线的绘制
固定酪氨酸酶和L-酪氨酸的质量浓度分别为165.2 U/mL 和0.312 mg/mL，考察白及多糖（60.34、55.51、50.08、45.26、40.02、0 mg/mL）对酪氨酸酶抑制动力学影响，按表2 所示的反应体系，每孔平行3 次，在37 ℃条件下，利用酶标仪每隔1 min 测定1 次475 nm处的OD 值，反应20 min 后终止读数，绘制白及多糖抑制酪氨酸酶动力学曲线。
1.3.2.3 白及多糖对酪氨酸酶反应初速度的影响
固定酪氨酸酶质量浓度为165.2 U/mL，用pH6.8的磷酸盐缓冲液分别配制质量浓度为0.312、0.234、0.156、0.078 mg/mL 的L-酪氨酸溶液，考察白及多糖（60.34、55.51、50.08、45.26、40.02、0 mg/mL）对酪氨酸酶抑制作用，按表2 所示的反应体系，每孔平行3 次，在37 ℃条件下，利用酶标仪每隔1 min 测定1 次475 nm处的OD 值，反应20 min 后终止读数，绘制动力学曲线，斜率即为反应初速度。
1.3.2.4 白及多糖对酪氨酸酶抑制可逆性分析
固定L-酪氨酸质量浓度为0.312 mg/mL，用不同质量浓度的白及多糖溶液（60.34、55.51、50.08、45.26、40.02、0 mg/mL）分别与165.2、123.9、82.6、41.3 U/mL 的酪氨酸酶溶液进行反应，以酪氨酸酶质量浓度（U/mL）为横坐标，反应初速度（ΔOD475 nm）为纵坐标作图，分析白及多糖对酪氨酸酶的抑制作用是否可逆。
1.3.2.5 白及多糖对酪氨酸酶抑制类型判断
按照1.3.2.2 方法，反应20 min 后终止反应并读数，根据Lineweaver-Burk 双倒数法，以L-酪氨酸质量浓度倒数（1/S）为横坐标，反应初速度倒数（1/V）为纵坐标作图，确定白及多糖对酪氨酸酶抑制类型。白及多糖抑制酪氨酸酶的动力学参数通过Lineweaver-Burk方程计算，公式如下。
式中：V 为不同L-酪氨酸质量浓度下的初速度值，OD/min；Km 为米氏常数，mol/L；S 为L-酪氨酸质量浓度，mg/mL；Vmax 为最大初速度，OD/min。
1.4 数据处理
采用WPS Office Excel 软件进行数据处理分析和绘图。
2 结果与分析
2.1 白及多糖含量及单糖组成结果分析
2.1.1 白及多糖含量
本法测定白及多糖含量为（51.97±1.52）%，明显高于热回流法、碱水提法、超声波提取法、纤维素酶提取法以及红外加热效应法提取的白及多糖含量[12-15]。推测原因可能是复合酶法具有专一性，作用温和，可以靶向作用于植物组织的细胞壁，更有利于多糖的溶出，同时生物酶还起到纯化多糖的作用[16]，因此复合酶法更有利于提高白及多糖含量。
2.1.2 白及多糖单糖组成
图1 为13 种单糖混标的离子色谱图，图2 为白及多糖样品的离子色谱图。
图1 单糖混合标准品离子色谱图
Fig.1 Ion chromatogram of mixed monosaccharide standards
图2 白及多糖离子色谱图
Fig.2 Ion chromatogram of Bletilla striata polysaccharides
由图1、图2 可知，白及多糖由鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、半乳糖醛酸（Gal-UA）和葡萄糖醛酸（Glc-UA）7 种单糖组成，其单糖组成比例分别为0.17%、0.36%、1.86%、41.81%、54.21%、0.71% 和0.88%，其中葡萄糖和甘露糖的占比最高，分别为41.81%和54.21%。研究显示，白及多糖为葡甘聚糖，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone， PMP）衍生化-高效液相色谱法得到白及多糖的单糖组成为葡萄糖和甘露糖[17-18]。而本研究中发现，构成白及多糖的单糖除了葡萄糖和甘露糖以外，还包括鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（Gal-UA）和葡萄糖醛酸（Glc-UA），与文献报道存在差异。分析主要原因可能是单糖组成分析检测方法不同，精确度和仪器的灵敏性有差异，PMP 衍生化-高效液相色谱法是经典的多糖单糖组成分析方法，样品需要经过繁杂的前处理，对于含量较高的单糖容易被检测到，而含量较低的单糖则不容易被检测到。而本研究使用离子色谱技术测定单糖组成，多糖样品前处理简单，仪器精密度和灵敏性高于液相色谱法，对于单糖含量差异较大的组分也可以检测到。因此，本研究发现白及多糖由Rha、Ara、Gal、Glc、Man、Gal-UA 和Glc-UA 7 种单糖组成。
2.2 白及多糖对酪氨酸酶活力的影响
不同质量浓度白及多糖、抗坏血酸对酪氨酸酶的抑制作用见图3、图4。
图3 不同质量浓度白及多糖对酪氨酸酶的抑制作用
Fig.3 Inhibition of different mass concentrations of Bletilla striata polysaccharides on tyrosinase
图4 抗坏血酸对酪氨酸酶的抑制作用
Fig.4 Inhibition of ascorbic acid on tyrosinase
由图3 可知，随着白及多糖质量浓度的升高，其对酪氨酸酶的抑制率逐渐增加，表明白及多糖对酪氨酸酶的抑制作用呈剂量依赖性。当白及多糖质量浓度为60.34 mg/mL 时，抑制率达到50.80%。
由图3、图4 可知，以白及多糖质量浓度的对数为横坐标，抑制率的分布概率为纵坐标，绘制标准曲线得到回归方程为y=1.793 2x+1.820 4，R2=0.990 6。经计算，白及多糖对酪氨酸酶抑制作用的IC50值为59.31 mg/mL，抗坏血酸对酪氨酸酶抑制作用的IC50值为260.62 µg/mL。
2.3 白及多糖对酪氨酸酶的抑制动力学分析
2.3.1 白及多糖对酪氨酸酶抑制动力学曲线分析
白及多糖对酪氨酸酶抑制动力学曲线见图5。
图5 白及多糖对酪氨酸酶抑制动力学曲线
Fig.5 Dynamic curves of inhibition of Bletilla striata polysaccharides on tyrosinase
如图5 所示，白及多糖质量浓度一定，随着反应时间的延长，曲线斜率降低，即酪氨酸酶活性被抑制；反应时间一定，随着白及多糖质量浓度的升高，吸光度呈下降趋势，曲线斜率亦逐渐降低，即随着白及多糖质量浓度的增高，酪氨酸酶活性呈降低趋势，表明白及多糖可以抑制酪氨酸酶的氧化，对其具有一定抑制作用。
2.3.2 白及多糖对酪氨酸酶反应初速度的影响
不同质量浓度白及多糖和L-酪氨酸对酪氨酸酶反应初速度的影响见图6。
图6 不同质量浓度白及多糖和L-酪氨酸对酪氨酸酶反应初速度的影响
Fig.6 Effects on the initial velocity of tyrosinase by different mass concentrations of Bletilla striata polysaccharides and L-tyrosine
如图6 所示，在同一L-酪氨酸质量浓度、不同质量浓度白及多糖作用下，吸光度随着白及多糖质量浓度的增加而降低，当白及多糖质量浓度为60.34 mg/mL时，反应体系的吸光度最低；在不同L-酪氨酸质量浓度、同一质量浓度白及多糖作用下，随着L-酪氨酸质量浓度的增加，各试验组的吸光度增幅均低于0 mg/mL白及多糖组，且曲线斜率逐渐降低，表明白及多糖可以降低酪氨酸酶反应的初速度，对其具有抑制作用。
2.3.3 白及多糖对酪氨酸酶抑制可逆性分析
抑制剂与酶结合分为可逆型和不可逆型，为了判断白及多糖对酪氨酸酶活性抑制作用是否可逆，绘制不同质量浓度白及多糖抑制酪氨酸酶可逆性分析图，见图7。
图7 不同质量浓度白及多糖抑制酪氨酸酶可逆性分析
Fig.7 Reversibility analysis of inhibition on tyrosinase by different mass concentrations of Bletilla striata polysaccharides
如图7 所示，6 条拟合曲线均相交于原点，且随着白及多糖质量浓度的升高，曲线斜率呈降低趋势，与倪丹等[19]研究结果一致，表明白及多糖可以降低酪氨酸酶活性的初速度，但不能完全使酶失活，因此推测白及多糖对酪氨酸酶的抑制作用具有可逆性。
2.3.4 白及多糖对酪氨酸酶抑制类型判断
酶抑制动力学研究结果表明，酶抑制机制类型不同，其动力学参数变化也不同，主要表现在米氏常数Km 值和最大反应速率Vm 值。竞争型抑制类型表现为Km 值增大，Vm 值不变，Lineweaver-Burk 双倒数直线与纵坐标轴相交；非竞争型抑制类型表现为Km 值不变，Vm 值变小，Lineweaver-Burk 双倒数直线与横坐标轴相交；混合型抑制类型表现为Km 值增大，Vm 值减小，且直线相交于第二象限[20-22]。
Lineweaver-Burk 双倒数直线见图8，白及多糖抑制酪氨酸酶的动力学参数见表3。
图8 Lineweaver-Burk 双倒数直线
Fig.8 Lineweaver-Burk double-reciprocal curve
（A）不同浓度的白及多糖对酪氨酸酶抑制的Lineweaver-Burk 双倒数直线；（B）、（C）分别是斜率与垂直截距对白及多糖质量浓度的二次图。
表3 白及多糖对酪氨酸酶抑制动力学参数
Table 3 Dynamic parameters of inhibition on tyrosinase by Bletilla striata polysaccharides
注：KI 为白及多糖对酶与底物络合物的抑制常数；KIS 为白及多糖对游离二酚酶的抑制常数。
白及多糖质量浓度/（mg/mL）0 40.02 45.26 50.08 55.51 60.34米氏方程y=0.224 5x+3.001 1 y=0.235 7x+4.848 8 y=0.267 3x+5.094 2 y=0.271 4x+5.686 9 y=0.344 3x+5.758 3 y=0.410 5x+6.023 9 Km/（mol/L）0.22 0.24 0.27 0.27 0.34 0.41 Vmax/（OD/min）0.33 0.21 0.20 0.18 0.17 0.17 KI/（mg/mL）13.79 KIS/（mg/mL）42.56
如图8（A）和表3 所示，Lineweaver-Burk 双倒数直线作图得到一组相交的直线，随着白及多糖质量浓度的增加，米氏常数Km 值整体逐渐增大，而Vmax 值整体逐渐降低，因此，推测白及多糖对酪氨酸酶的抑制类型为混合型抑制。如图8（B）、图8（C）和表3 所示，KI 和KIS 分别为13.79 mg/mL 和42.56 mg/mL，KI<KIS，表明白及多糖与游离酶的结合强于与酶-底物复合物的结合。因此可知，白及多糖一方面通过竞争性抑制与酪氨酸酶结合，另一方面又可通过非竞争性抑制与酶-底物复合物结合，表明白及多糖对酪氨酸酶抑制作用属于竞争性-非竞争性混合型抑制。
3 结论
本文采用离子色谱法明晰白及多糖的单糖组成，补充了现有的白及多糖结构表征研究的不足之处。白及多糖由鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、甘露糖Man、半乳糖醛酸Gal-UA 和葡萄糖醛酸Glc-UA 7 种单糖组成，其单糖组成比例分别为0.17%、0.36%、1.86%、41.81%、54.21%、0.71% 和0.88%，其中葡萄糖和甘露糖的占比最高。
此外，白及多糖对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，在试验质量浓度范围内，随着白及多糖质量浓度的增加，酪氨酸酶活性呈降低趋势，表明白及多糖对酪氨酸酶活性抑制作用具有剂量依赖性，白及多糖对酪氨酸酶抑制作用的IC50 为59.31 mg/mL。在白及多糖抑制酪氨酸酶活力动力学试验中，白及多糖可以明显减低酪氨酸酶反应初速度，且随着白及多糖质量浓度的增加，酪氨酸酶活力逐渐降低，表明白及多糖可以延迟酪氨酸酶活力的激活。此外，不同质量浓度的白及多糖与不同质量浓度的酪氨酸酶曲线相交于原点，表明白及多糖对酪氨酸酶的抑制作用具有可逆性。由Lineweaver-Burk 双倒数曲线作图得到一组相交于第二象限的直线，且随着白及多糖浓度质量的增加，米氏常数Km 值整体逐渐增大，Vmax 值整体逐渐降低，表明白及多糖对酪氨酸酶的抑制类型为混合型抑制。
本文在确定白及多糖单糖组成的基础上，对其进行酪氨酸酶活性试验研究，并阐明白及多糖对酪氨酸酶的抑制类型，为后续进一步开发白及多糖功能食品提供了研究基础。
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