粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）又名粗壮脉纹孢菌，是一种丝状真菌，该菌无性繁殖时，产生大量分生孢子，呈现黄、红等颜色，在面包淀粉基质中常见，因此，也被称为红色面包霉。粗糙脉孢菌具有对生长环境需求低、生长速度快、生命周期短及单倍体遗传等典型极性生长特点，可在多种培养环境中迅速生长，且未发现毒素生成[1]。粗糙脉孢菌因其蛋白质及细胞器等代谢活跃，通常被用于基础生物钟机制及遗传代谢等研究[2]。因粗糙脉孢菌安全性、易培养且发酵产物丰富，近年来，也被广泛应用于食品工业，但是关于粗糙脉孢菌在食品方面的综述未见报道，因此，本文综述近些年粗糙脉孢菌在生长过程中的代谢产物及合成途径与发酵工艺相关研究，列举了粗糙脉孢菌在食品中应用的研究，以期为粗糙脉孢菌更深入的开发与利用提供参考依据。
1 粗糙脉孢菌及其酶系
粗糙脉孢菌可利用不同的培养基和底物发酵产生丰富的酶系，包括纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、漆酶和酪氨酸酶等。粗糙脉孢菌发酵生产纤维素酶研究较多，相关的遗传背景的研究比较清楚，所产纤维素酶系齐全；针对其余酶系研究较少，有待深入研究。
1.1 纤维素酶
粗糙脉孢菌中纤维素酶含量是里氏木霉的两倍多，并且可以合成半纤维素酶和木质素酶，能够将植物细胞壁中的纤维素、木质素等大分子物质降解为简单的化合物。粗糙脉孢菌能够产生所有主要的植物细胞壁降解酶，对生物圈中植物凋落物的循环利用至关重要[3]。因此在食品工业中，可利用其产酶作用进行高纤维食品废料的处理加工，从而提升食品原料的利用率，可以开辟一条环保、高效、无污染的有效途径。
在真菌中，研究粗糙脉孢菌发酵降解纤维素的机理最多，粗糙脉孢菌可以通过细胞壁合成机制分泌纤维素酶，分泌纤维素酶的机制涉及到多个基因的调控和表达，以及细胞壁合成途径的调节。粗糙脉孢菌发酵合成纤维素酶如图1 所示。
图1 粗糙脉孢菌发酵合成纤维素酶示意图
Fig.1 Diagram of fermentation of cellulase by Neurospora crassa
纤维二糖、槐糖、乳糖、葡萄糖等碳源可作为粗糙脉孢菌生产纤维素酶的诱导物，CRE、CLR 等转录因子调控纤维素酶的基因表达，以及染色体的调控和调控中信号转导，通过调节信号转导和增强转运蛋白分泌可以调控纤维素酶产量。王珊珊[4]系统分析了粗糙脉孢菌丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶基因突变体的纤维素酶表达分泌情况，发现粗糙脉孢菌缺失stk-12 基因可以提高纤维二糖转运速率和相关转录蛋白的表达水平，提高胞内信号分子的浓度，进而激活纤维素酶表达，最终提高粗糙脉孢菌的纤维素酶的产量。裴雪[5]在研究粗糙脉孢菌作为模式真菌时，发现AP-3 复合体突变菌株的纤维素酶相关的蛋白分泌产量较高，并且发现通过粗糙脉孢菌裂解性多糖单加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO）蛋白表达可有效提升纤维素酶的活性。Collier 等[6]研究证明粗糙脉孢菌中鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G-蛋白）信号是纤维素酶生产的关键。
此外，研究人员还探索了不同的培养条件和培养基成分优化纤维素酶的生产和活性。Verma 等[7]以麦麸废料为原料，利用粗糙脉孢菌生产纤维素酶，发现发酵温度、pH 值、接种量、颗粒大小、含水率和培养时间对纤维素酶生产影响较大，工艺优化后纤维素的酶活性达到（2.47±0.03）U/mL。郭清华等[8]对粗糙脉孢菌产纤维素酶培养条件进行优化，降低培养过程中摇床转速到200 r/min 时可以有效保护菌丝体，得到的纤维素酶浓度可以达到1.23 mg/L。张玲秀等[9]在研究中也得出相似结论，在初始pH7、转速159.24 r/min、培养温度27.9 ℃条件下，其产纤维素酶活性提高了39.1%。冯炘等[10]在研究纤维素高产菌株粗糙脉孢菌AS 3.1602 时发现，最佳产酶培养基碳源的组成为3% 玉米芯粉和0.5% 麸皮酸水解液（0.6 mol/L），最适宜的有机氮源为黄豆粉，最适宜的无机氮源为NH4HSO4。Verma 等[7]在研究利用粗糙脉孢菌发酵西葫芦皮生产纤维素酶时，发现在培养基中添加马铃薯淀粉水解物后粗糙脉孢菌生产纤维素酶的产量更高。
1.2 淀粉酶和木聚糖酶
淀粉酶和木聚糖酶分别可以将淀粉和木聚糖完全水解，参与糖化过程，广泛应用于食品、酿造、果汁和葡萄酒行业。而利用微生物生产淀粉酶和木聚糖酶具有高产量、高稳定性、可优化性和没有季节波动等优点，优于从植物和动物中获得的淀粉酶和木聚糖酶[11]。
研究发现缺失转录因子Col-26 和Exo-1 的粗糙脉孢菌突变菌株在分解代谢产物阻遏（carbon cata-bolite repression，CCR）过程（前一种碳源耗尽，一段停滞期后再开始利用另一种碳源的过程）中调节淀粉酶能力较高[12]。
赵峰等[13]采用木聚糖作为唯一碳源的培养基筛选高产木聚糖酶的菌株，粗糙脉孢菌表现出较高的产酶能力，生产的木聚糖酶活性最高，酶活力达到最高时所需时间最短，发酵培养第6 天产酶活力可以达到136.90 U/mL。研究发现粗糙脉孢菌在发酵玉米芯、玉米秸、麸皮时木聚糖酶合成能力最强，超过了以纯木聚糖为底物时的诱导能力，最适pH 值为5.4，最适培养温度为60 ℃[14]。Shahryari 等[11]首次利用深层发酵的方式培养粗糙脉孢菌，发现硝酸钠和酵母提取物是细胞外酶生产的最佳氮源。目前，粗糙脉孢菌发酵产淀粉酶和木聚糖酶相关研究较少，尚需进行深度研究。
1.3 漆酶和酪氨酸酶
漆酶和酪氨酸酶是一种温和的氧化剂，具有氧化和降解木质素以及环境污染物的能力，可以很好地清除自由基、抗菌、抗病毒[15]。真菌发酵生产的漆酶，常用于发酵食品中降解生物胺，具有易大量产生、易于操作等优点[16]。漆酶在食品饮料加工行业用途较广，特别是在啤酒生产中常用漆酶对麦芽汁进行预处理，氧化麦芽汁中的酚类物质，不仅可以提高啤酒的质量和透明度，还可延长其储存期。
粗糙脉孢菌是少数能够产生漆酶的子囊菌，研究发现粗糙脉孢菌生产的漆酶可以分解玉米秸秆中的酚类物质，降低其毒性[17]，其产生的漆酶是诱导型的漆酶，添加诱导剂可使漆酶产量增加。铜是漆酶蛋白的结构组分，锰起着活化剂的作用，铜离子及锰离子可以作为诱导剂，研究表明10µmol/L 的铜离子和150µmol/L 的锰离子产生的漆酶活力最高[18]。放线菌酮是一种抑制蛋白质合成的抗生素类物质，也常用于诱导真菌漆酶的产生，谌斌等[19]研究发现加入2.8µmol/L 放线菌酮诱导培养6～7 d 后产生的漆酶的最高酶活可达4～5 U/mL，粗糙脉孢菌合成漆酶最佳培养基为以20 g/L 葡萄糖为碳源、2 g/L 硝酸铵为氮源。在30 ℃时，含有环己胺和氟尿嘧啶的磷酸盐缓冲液中，粗糙脉孢菌还可以同时产生漆酶和酪氨酸酶[20]。
2 粗糙脉孢菌发酵产物
粗糙脉孢菌发酵产物丰富，其菌丝和分生孢子均可积累类胡萝卜素和黑色素等。粗糙脉孢菌在马铃薯培养基下生长代谢，进行无性生殖发育，产生橘色-红色的分生孢子，易积累类胡萝卜素、番茄红素等。在恶劣的环境条件下，粗糙脉孢菌菌丝可进入有性生殖阶段产生休眠状态的黑色子囊孢子，易积累黑色素[21]。研究表明粗糙脉孢菌还具有发酵纤维素和木聚糖产生乙醇的能力[22]。
2.1 类胡萝卜素
生产类胡萝卜素有天然提取、化学合成和微生物发酵3 种方法[23]。近年来粗糙脉孢菌作为研究类胡萝卜素合成的既定生物模型和利用其发酵生产类胡萝卜素愈发受到关注[24]。研究表明粗糙脉孢菌所产的类胡萝卜素具有较高的总抗氧化能力和金属螯合能力[25]。
影响粗糙脉孢菌发酵生产类胡萝卜素的因素主要有蛋白质、培养基类型和培养条件。Bayram 等[26]研究真菌特异性调节绒毛复合体在粗糙脉孢菌生长代谢过程中的作用，发现粗糙脉孢菌生长代谢过程中产生的绒毛蛋白VE-1/VE-2 异源二聚体对类胡萝卜素合成具有调控作用。刘志刚等[27]优化粗糙脉孢菌发酵生产类胡萝卜素的培养基，发现脱脂米糠64.58%、砻糠33.85%、（NH4）2SO4 1.57% 为粗糙脉孢菌发酵生产类胡萝卜素最佳培养基，这是由于脱脂米糠中丰富的矿物质可以使粗糙脉孢菌更好的生长。杨风玲等[23]利用粗糙脉孢菌对麸皮、啤酒糟、豆渣、甘薯渣和米糠类培养基进行固态发酵，发现米糠类培养基产生的类胡萝卜素含量最高，达到403.13 µg/g 干基，类胡萝卜素主要以色素颗粒的形式分布在孢子内部和孢子壁周围，当采用啤酒糟、米糠和甘薯渣复配培养基时生产类胡萝卜素效果更优。培养环境中温度和光照也影响粗糙脉孢菌发酵类胡萝卜素的产量，研究发现粗糙脉孢菌在6～12 ℃类胡萝卜素的产量较高，同时发现蓝光诱导可以提高低温发酵粗糙脉孢菌生产类胡萝卜素的效率[28]。
类胡萝卜素产量除了受发酵工艺因素影响外，类胡萝卜素的提取工艺也影响其得率，杜佳等[29]研究发现，采用酸热法，在丙酮浸提温度54 ℃、浸提时间59.2 min、料液比1∶100（g/mL）的条件下，粗糙脉孢菌孢子中β-胡萝卜素提取量可达561.082µg/g 孢子。
2.2 番茄红素
番茄红素是类胡萝卜素的一种，常在食品加工中用作色素添加剂，也常作为抗氧化保健食品的原料。粗糙脉孢菌发酵合成类胡萝卜素途径如图2 所示[23]。
图2 粗糙脉孢菌发酵合成类胡萝卜素途径示意图
Fig.2 Schematic diagram of synthesis of carotenoids by fermentation of Neurospora crassa
由图2 可知，粗糙脉孢菌发酵生产类胡萝卜素途径是以乙酰辅酶A 为前体物质，经甲羟戊酸途径合成，乙酰辅酶A（acetyl-CoA）在合成酶和还原酶的作用下生成甲羟戊酸（mevalonate），合成反应后生成八氢番茄红素（phytoene），再经过脱氢及共轭双键延长等反应形成番茄红素（lycopene）。当有番茄红素环化酶存在时，番茄红素可以进一步生产β-胡萝卜素等类胡萝卜素。在研究粗糙脉孢菌发酵合成类胡萝卜素的途径中，发现改变粗糙脉孢菌培养条件和添加抑制剂可以抑制番茄红素环化酶的合成，如在发酵过程中添加一定浓度的氟康唑和烟草水提液，可以调控番茄红素代谢路径，阻断两步环化反应，反应就被控制在番茄红素水平，就可大量积累产生番茄红素，可将番茄红素产量提升2.38 倍[30]。欧明花[31]研究粗糙脉孢菌生产番茄红素的促进剂，发现4 种物质对粗糙脉孢菌发酵产生番茄红素影响较大，依次为烟草水提物>麦角固醇盐酸特比萘芬（terbinafine hydrochloride，TH）>青霉素>2，6-二叔丁基-对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT），最佳发酵助剂工艺为青霉素1.2 mg/L、烟草水提物102 mg/L、BHT 3.8 mg/L、TH 1.01 mg/L，番茄红素总产量为（13.50±0.65）µg/g 孢子。
影响粗糙脉孢菌发酵生产番茄红素的因素还有培养基的组成、形态及培养条件。Wang 等[32]在培养基中添加油酸作为外源脂肪酸，研究其对粗糙脉孢菌产番茄红素的影响，发现脂类物质的添加有利于甲羟戊酸途径下番茄红素的生成积累，其分解代谢有利于增加胞内的碳通量，促进向番茄红素产生方向进行，油酸浓度为0.88 g/L 时，番茄红素产量达到最高值，是未添加油酸的2.77 倍。郭月山等[33]在添加大豆蛋白胨时，粗糙脉孢菌生产番茄红素的产量明显提高，在大豆蛋白胨添加量11 g/L、发酵55 h、菌种接种量6%，添加后继续发酵51 h 后番茄红素产量达9.64 mg/L。李陈陈等[34]研究发现，固态发酵与液态发酵相比，可以使番茄红素产量提升30 倍。耿英龙等[35]研究发现发酵温度对粗糙脉孢菌生产番茄红素影响最大，在最优工艺条件发酵温度30 ℃、接种量6.5%、振荡速率100 r/min、发酵时间110 h 下，番茄红素产量达10.09 mg/L。阙发秀等[36-37]研究发现超声波可以使粗糙脉孢菌菌丝受损，刺激了分生孢子的产生，从而提高番茄红素的产量，当发酵温度30 ℃、110 r/min 振荡培养19 h，每24 h进行1 次超声（200 W、40 kHz），每次6.3 min，共处理3 次，番茄红素产量达到（29.506 2±0.209 3）mg/L。同时发现二阶段培养法即摇瓶培养菌丝一段时间后再静止培养让菌丝触空气，这种诱导产孢的方法也可以提升粗糙脉孢菌生产番茄红素的产量。
2.3 黑色素
黑色素是由酚类或吲哚类化合物氧化聚合而成的深棕色至黑色的生物大分子，许多真菌都可以产生黑色素，可以增强真菌对环境的抵抗力。黑色素已被用于功能食品的生产中，有预防改善色素沉着、自由基清除和抗紫外辐射[38]等作用。真菌产生黑色素的作用机制是通过产生黑色素合成相关酶，包括酪氨酸酶、内切酶、DNA 聚合酶等催化生物体内2C结构单元底物，聚合为不定形的颗粒黑色素，沉积于真菌细胞壁中[39]。
粗糙脉孢菌发酵生产黑色素受到多种因素影响，一些信号传导途径对黑色素的合成具有调节作用，Ao等[40]对粗糙脉孢菌发酵生产黑色素的研究发现，合成黑色素发生在胞壁间隙LACM-1 通路和成熟的细胞内囊泡中的脱水蛋白（dehydrin，DNH）通路。通过研究粗糙脉孢菌的突变菌株，发现酪氨酸酶编码基因是控制黑色素生成的限速酶之一，其在所有变异菌株中过表达，并且在正常菌株中也存在此现象[41]。兰希影[42]以酪氨酸为前体物质，利用粗糙脉孢菌生产黑色素，发现在3，4-二羟苯丙氨酸（3，4-dihydroxyphenyl L-alanine，L-DOPA）黑色素合成途径中，对黑色素合成影响显著的基因为NCU08615。
此外，在培养基选择方面，粗糙脉孢菌生产黑色素培养的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨，酪氨酸浓度0.05 g/100 mL，并利用碱溶酸沉法对黑色素进行提取，最佳条件下提取率为0.333 g/100 mL[43]。李建波等[44]挑选出了生产黑色素能力较好的粗糙脉孢菌AS3.1602，并发现NaCl 质量浓度对黑色素产量的影响最大，其次是葡萄糖，在最佳的发酵工艺下黑色素产量提高了2.18 倍。
2.4 乙醇
微生物发酵生产乙醇是一种高效的生物质转化技术，可以大大提高生物质利用度，减少对粮食的需求，从而降低对石油和化学原料的依赖[45]。粗糙脉孢菌能够直接利用木质纤维素转化生成乙醇，转化过程为先利用纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖，再将葡萄糖转化为乙醇，因其独特的代谢途径和酶系统使其成为一种重要的生物质转化技术。
粗糙脉孢菌菌株不同发酵生成乙醇的能力也不同，张志华[46]通过比较粗糙脉孢菌各菌株的纤维素乙醇发酵的能力，发现N.carssa AS3.1602 菌株纤维素乙醇转化率和木糖乙醇转化率最高，分别为91% 和64%。此外，在氧限制条件下可以提高乙醇产量。Waters 等[47]研究了73 种生态型和89 种实验菌株粗糙脉孢菌中纤维素糖化和发酵的自然变化，表现最好的菌株N345-2 乙醇产量提高了10%，并发现影响葡萄糖发酵的主要数量性状基因位点（quantitative trait loci，QTL）和多个潜在的糖化QTL，有助于更好地针对优化粗糙脉孢菌生产乙醇[48]。研究发现影响粗糙脉孢菌生产乙醇的因素有蛋白基因和培养环境pH 值。Guo等[49]发现粗糙脉孢菌中天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase，Asp）基因可以有效提高乙醇的产量，将其Asp基因克隆到酿酒酵母中，刺激酿酒酵母酸性蛋白酶的分泌，提高了酵母菌的生长速度和活菌数，重组后菌株的乙醇产量高于正常酿酒酵母菌株。培养环境中的pH 值也影响粗糙脉孢菌生产乙醇的产量，Campos等[50]研究粗糙脉孢菌发酵甘蔗渣发现，添加pH 调节剂PAC-3 可以正向调控相关转录因子编码基因的表达，从而增加粗糙脉孢菌乙醇的产量。
2.5 其他
水杨醛具有良好的杀菌作用，在油品香料中用作防腐杀菌剂，并且在预防疾病方面有很大潜力[51]。在粗糙脉孢菌中发现了与产生水杨醛和相关中间体聚酮合成酶基因簇的同源基因簇，表明粗糙脉孢菌具有生产水杨醛的巨大潜力[52]。粗糙脉孢菌还可以产生谷氨酸脱羧酶，在粗糙脉孢菌休眠期的孢子中的谷氨酸脱羧酶含量相对较高，达到了可提取蛋白的0.5%～1%，但在粗糙脉孢菌分生孢子的萌发过程中，谷氨酸脱氢酶蛋白质会被降解，含量会降低[53]。Bartholomai 等[54]分析证明粗糙脉孢菌菌丝体蛋白是完整蛋白质的良好来源，富含纤维、钾和铁。此外，Lin 等[55]研究菌株改良的策略，发现基因GUL-1 的缺失可以降低培养粗糙脉孢菌发酵液的黏度，增加粗糙脉孢菌蛋白质的分泌。
3 粗糙脉孢菌在食品中的应用
3.1 粗糙脉孢菌对农副产品的综合利用
粗糙脉孢菌产生的酶系丰富，能够将豆渣中部分粗纤维和大分子蛋白质分解，产生小分子单糖、低聚糖、多肽及氨基酸等活性物质，可以改善豆渣的抗氧化活性，提升其营养价值和感官品质[56]。黄文利等[57]利用粗糙脉孢菌发酵豆渣后，粗多糖含量较发酵前增加了8.19 倍，总糖、蛋白质、总黄酮、总酚的含量均有所提高，微观结构也得到了改善。倪龙等[58]采用保加利亚乳杆菌和粗糙脉孢菌联合发酵豆渣，制备豆渣膳食纤维蓝莓饮料，该饮料具有口感独特、营养成分丰富等特点。Zheng 等[59]利用粗糙脉孢菌发酵豆渣生产碱性蛋白酶，该蛋白酶在55 ℃、pH9.0 时活性最佳。除了豆渣以外，Dogaris 等[60]利用粗糙脉孢菌发酵高粱及甘蔗渣，利用其生产乙醇的效率高于酿酒酵母，乙醇产量可以提高到27.6 g/L。还可以利用粗糙脉孢菌发酵咖啡渣合成α-淀粉酶，在水分为60%、pH4.6、温度28 ℃、接种量107 孢子/g、发酵时间5 d 的工艺参数下，合成的α-淀粉酶活性可达到4 981 U/g[61]。
利用粗糙脉孢菌发酵鸡饲料还可以提高鸡蛋的品质，Liu 等[62]优化和共同培养粗糙脉孢菌和植物乳杆菌发酵啤酒糟底物，粗糙脉孢菌生产的纤维素酶可以提高粗纤维水解率，显著提高油茶籽饼基质的氨基酸含量，饲喂母鸡后，产蛋率和鸡蛋品质都得到改善。
合理地利用农产品加工副产物能降低环境压力，节约资源，实现废弃物的高效利用，今后应证明其安全性，实现从实验层面到科研成果的转化。
3.2 粗糙脉孢菌对食品营养成分的改性
粗糙脉孢菌对食品营养成分的改性，可以提升其物化特性，更好的发挥该营养成分的潜力，但相关研究较少。蒋明星等[63]从提取多糖后的紫皮石斛渣中分离到粗糙脉孢菌，研究发现粗糙脉孢菌能够将石斛多糖水解为寡糖，可以应用到食品保鲜及加工中。利用粗糙脉孢菌发酵改性大豆渣低聚糖，可以产生更多的短链脂肪酸，具有调节肠道菌群和改善肠道健康的潜力[64]。Huang 等[65]利用粗糙脉孢菌发酵改性豆渣可溶性多糖，研究表明豆渣可溶性多糖对小鼠结肠炎症状有所改善，还可以调节肠道菌群改善肠道屏障功能。粗糙脉孢菌的纤维素酶产量很高，且纤维素酶活性较高，Guan 等[66]利用粗糙脉孢菌发酵改性黑米渣膳食纤维，能够提升黑米渣可溶性膳食纤维含量，并且增加了黑米渣膳食纤维的膨胀力、持水力和持油力，且胆固醇吸附能力、葡萄糖吸附能力和胆酸钠吸附能力显著提升。Lin 等[67]研究了黑曲霉和粗糙脉孢菌混合发酵改性豆腐渣膳食纤维，改性后的膳食纤维能显著降低小鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和动脉粥样硬化指数，对高胆固醇小鼠有很好的降血脂效果。Li 等[68]利用粗糙脉孢菌发酵改性豆粕蛋白，发现豆粕蛋白中总游离氨基酸提升了13 倍，蛋白水解率达到10.05%，还显著降低了β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白两个过敏源含量，降低了食用大豆蛋白引起的过敏反应。现阶段所研究粗糙脉孢菌的结论均表明，在没有外界影响的情况下，粗糙脉孢菌参与生产的食物是安全的，并在食品工业中的利用研究进展较快，具有较高的应用前景。
4 存在的问题及发展趋势
近年来粗糙脉孢菌在分子遗传学、生物化学以及在发育等学科作为作为经典的模式生物研究较多，基于粗糙脉孢菌丰富的酶系和多样的代谢产物，在食品加工方面有很大的应用前景，相关研究也在逐步增加，但仍旧较为单薄，因此，粗糙脉孢菌还有很大的研究发展空间。在粗糙脉孢菌代谢产物方面研究大多为其发酵工艺的研究，对于发酵产物的功能特性研究较少，粗糙脉孢菌发酵产物的优势并不突出，可能是未来重要的研究方向。另外多数产品经粗糙脉孢菌发酵后理化性质、营养价值等提升，但具体应用在食品生产上研究较少，综合效益有待考证。综上，未来需综合运用多种技术手段深度研究粗糙脉孢菌产酶机制，探究菌体本身及其发酵产物的生理学活性及作用机制等方面，使粗糙脉孢菌在食品加工等领域得到更好的应用。
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